荧光假单胞菌2P24中RstA蛋白的功能鉴定

探究荧光假单胞菌2P24 中OmpR 家族转录因子RstA 的功能,明确其对EmhABC 外排泵的调控作用及机制。利用共适应分析预测RstA 的潜在功能;采用同源重组技术构建rstA、emhABC 基因缺失菌株ΔrstA 和ΔemhABC,检测野生型、ΔrstA、ΔemhABC 对多种抗生素的敏感性;通过qRT-PCR 和β-半乳糖苷酶实验检测emhABC 在野生型和ΔrstA 菌株中的转录、表达水平;表达纯化His-RstA 蛋白并经凝胶阻滞实验检测RstA 蛋白与emhABC 基因启动子区域的结合活性。结果显示,RstA 同EmhABC 存在共适应性,并预测RstA 与多种抗生素胁迫环境的适应相关;ΔrstA 和ΔemhABC 对多种抗生素耐受性下降;与野生株相比,突变株ΔrstA 中emhABC 的转录、表达水平均下降超过3 倍;成功表达纯化His-RstA 蛋白,经凝胶阻滞实验显示重组His-RstA 蛋白可与emhABC 基因启动子区域特异性结合。OmpR 家族转录因子RstA 通过结合在emhABC 上游启动子区域正向调控EmhABC 的表达,并影响荧光假单胞菌2P24 的多重耐药性。

PDA／SiO2大孔复合材料固定化荧光假单胞菌脂肪酶

以具有三维骨架结构的大孔聚合物为模板制备SiO2大孔材料，通过多巴胺在SiO2大孔材料孔道表面的原位聚合制得聚多巴胺表面功能化修饰的二氧化硅大孔材料（PDA/SiO2）。应用SEM、EDX、MIP、BET、TG—DTA和FTIR等技术对修饰前后的材料进行表征。以PDA／SiO2为载体固定荧光假单胞菌脂肪酶（PFL）．优化固定化条件并对比游离脂肪酶和固定化脂肪酶的性质。结果表明SiO2大孔材料具有三维连续贯通的孔道结构，孔径分布在300～500nm，聚多巴胺修饰后形成聚多巴胺／二氧化硅复合纳米薄膜构筑的大孔材料。在固定化时间为14h、pH值为8、初始脂肪酶浓度为0．4mg·mL-1时，固定化效果最佳，酶活回收率达246％。与游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶有更宽的温度和pH适用范围、热稳定性显著提高，并展现出良好的储存稳定性和操作稳定性。固定化脂肪酶的Km低于游离脂肪酶的，酶与底物的亲和性较好。

荧光假单胞菌AR4产2-酮基-D-葡萄糖酸发酵条件的研究

以淀粉水解糖为碳源,研究了不同氮源、碳氮比、金属离子、接种量以及环境因子(培养基起始pH值、通气量、温度)对抗噬菌体菌株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4产2-酮基-D-葡萄糖酸发酵的影响。结果表明,氮源、碳氮比、培养基的起始pH值、通气量及温度对该菌的产酸均有显著影响。在适宜培养条件下,该菌的摇瓶产酸及发酵转化率分别可达13.5%和90%左右。

2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌A46抗噬菌体菌株的选育

从2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)A46的异常发酵液中分离到1种噬菌体,将其命名为KS461。透射电镜观察表明,KS461呈近球形,直径为52nm。以荧光假单胞菌A46为出发菌株,利用紫外诱变的方法,获得了4株对噬菌体KS461具有抗性的2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株,并研究了这些变异株的遗传稳定性。研究结果表明,经8次传代,这些变异株对噬菌体的抗性及其发酵产酸能力没有改变。

荧光假单胞菌株P13分泌铁载体抑制油菜菌核病菌

通过铬天青(CAS)检测法和400 nm特异光谱吸收法测定了在无铁条件下,荧光假单胞菌株P13能大量分泌铁载体,对油菜菌核病菌有较强的抑制作用.随着铁离子浓度的提高,铁载体分泌减少,对油菜菌核病菌的抑制作用减弱.

噬菌体污染对荧光假单胞菌K10052-酮基-D-葡萄糖酸发酵的影响

在实验室条件下,考察了噬菌体污染对荧光假单胞菌K1005的2-酮基-D-葡萄糖酸发酵的危害。研究结果表明,发酵早期的噬菌体污染减缓菌株对葡萄糖的利用,导致发酵周期大大延长和发酵转化率明显降低。

荧光假单胞菌AR4在2-酮基-D-葡萄糖酸工业生产中的应用研究

在噬菌体存在的情况下,采用抗噬菌体菌株荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)AR4在200m3发酵罐上进行了2-酮基-D-葡萄糖酸的发酵生产。结果表明,荧光假单胞菌AR4对生产环境中噬菌体的抗性稳定,发酵周期短,发酵转化率高;经过10次传代,荧光假单胞菌AR4对噬菌体的抗性及其发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的能力没有改变;该菌株的发酵产物可以用于食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠的合成。

高效产絮凝剂荧光假单胞菌C-2培养条件优化应用

以筛选出的一株高效产絮凝剂荧光假单胞菌C-2为菌种,采用单因素试验方法确定最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为黄豆饼粉。采用正交试验设计方法,对该菌产絮凝剂的培养条件进行优化研究,结果表明:菌株产絮凝剂的最佳培养条件是碳源为葡萄糖(20.0g/L),氮源为黄豆饼粉(4.0g/L),培养温度为30℃,培养基初始pH值为8.0,通气量为160r/min,在此培养条件下,对高岭土悬浊液絮凝率达93.52%。最佳培养条件下产生的絮凝剂用于多种实际废水的净化,其中对色度和浊度的去除率均在80%以上,对COD的去除率为52.67%～85.22%。

利用荧光假单胞菌固定化细胞生产2-酮基-D-葡萄糖酸

以海藻酸钠为载体固定荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4,考察固定化细胞发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的条件。结果表明:利用5.0%海藻酸钠制备的固定化细胞颗粒稳定性好,可重复利用7次;发酵培养基中玉米浆的最适质量浓度为0.75g/100mL,固定化细胞的适宜发酵温度为30～36℃;在适宜的培养条件下,固定化细胞与游离细胞的2-酮基-D-葡萄糖酸产量及糖酸转化率基本相同,分别可达13.5g/100mL和90.0%左右。

生防菌Pseudomonas fluorescens 2P24对甜瓜根围土壤微生物的影响

【目的】探讨生防假单胞菌2P24对根围土壤微生物的影响,为生防菌的安全应用提供基础。【方法】利用平板培养计数与末端标记限制性片段长度多态性分析(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)相结合的方法研究施用生防假单胞菌2P24后不同生育期甜瓜根围土壤微生物多样性的变化。【结果】在甜瓜定植后,生防菌2P24对土壤中细菌和真菌均有较强的抑制作用,对放线菌却具有促进作用。在收获期,2P24对土壤中细菌和放线菌的影响逐渐减弱,而对真菌表现了一定的促进作用。获得了41个细菌菌群的TRF片段,其中,2P24对优势菌群TRF213、TRF240、TRF513无明显影响,而对TRF61、TRF348、TRF365等菌群影响显著,土壤微生物Shannon-Wiener多样性指数有所提高。【结论】将传统培养法和T-RFLP分析技术相结合,是分析土壤微生物种群变化较为理想的方法。生防菌2P24对甜瓜根围土壤微生物的生态系统影响不显著。

加压CO_2对乳中荧光假单胞菌杀菌效果的研究

为了研究加压CO2对乳中荧光假单胞菌的杀菌效果,首先采用单因素试验研究处理压力、处理时间和处理温度分别对杀菌效果的影响,然后通过正交试验确定最佳杀菌条件。结果表明:当压力为7 MPa,时间为70 min,温度为40℃时,加压CO2对荧光假单胞菌杀菌率为99.80%。

荧光假单胞菌噬菌体KS461-2的分离及其生物学特性研究

从2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌A46异常发酵液中分离得到1种噬菌体,将其命名为KS461-2。电镜观察表明,噬菌体KS461-2呈蝌蚪状。根据ICTV对病毒的分类标准,噬菌体KS461-2属长尾噬菌体科,为烈性噬菌体。噬菌体KS461-2对宿主菌的最佳感染复数为0．01,温度和pH对其稳定性具有显著的影响。一步生长曲线显示,噬菌体KS461-2的潜伏期约30min,裂解期约135min,裂解量为24。SDS-PAGE显示,噬菌体KS461-2有5种主要的结构蛋白,其分子量分别为66．0、61．0、42．5、34．7和14．4kDa。

荧光假单胞菌JD1202利用大米淀粉水解糖连续发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸

研发荧光假单胞菌JD1202转化大米淀粉水解糖为2-酮基-D-葡萄糖酸的连续发酵工艺。考察了连续发酵起点、稀释率和补料培养基中葡萄糖浓度对2-酮基-D-葡萄糖酸生产的影响。结果表明,稀释率和葡萄糖浓度对2-酮基-D-葡萄糖酸发酵具有显著影响;在稀释率和补料培养基成分保持不变的条件下,2-酮基-D-葡萄糖酸大量合成期的任何时段均可作为连续发酵的起点,其细胞浓度、残糖浓度和2-酮基-D-葡萄糖酸浓度均稳定在一定范围。较适的连续发酵操作条件为:稀释率0.065h-1,补料培养基中葡萄糖的质量浓度为170.0g/L。在此条件下,连续发酵达到稳态时发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的质量浓度为130.34g/L,生产强度平均为8.47g/L.h,发酵转化率为89.46%。连续发酵工艺是一种高效的2-酮基-D-葡萄糖酸生产方法,有望应用于工业生产中。

群体感应抑制剂3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用

为了研究3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮(3,4-dibromo-2(5H)-furanone,DF)对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用。通过在24孔板和硅胶片上构建生物膜模型,CFU计数法测定DF对荧光假单胞菌的最低抑制浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)和最低杀菌浓度(Minimum Bacterial Concentration,MBC)以及生物膜生长曲线,在1倍MIC和5倍MIC的DF作用下的荧光假单胞菌生物膜形成率和细菌群集运动能力,并探讨DF对荧光假单胞菌总蛋白合成及多糖含量的影响。结果表明,DF对荧光假单胞菌作用的MIC和MBC值分别为12.5μg/m L和800μg/m L;在DF浓度为1 MIC和5 MIC时,作用于荧光假单胞菌24 h生物膜形成抑制率分别为20.59%±2.91%和99.54%±1.83%,并能明显抑制荧光假单胞菌的群集运动能力,干扰荧光假单胞菌群体感应(Quorum sensing,QS)系统而影响其总蛋白合成及多糖的含量,24 h时5 MIC的DF对荧光假单胞菌总蛋白和菌多糖合成量的抑制率分别为8.04%±0.37%和51.08%±2.71%。本研究对DF影响荧光假单胞菌生物膜形成的原因,DF对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用及其对QS通路的干扰具有良好的理论和实践参考。

抗噬菌体菌株荧光假单胞菌A46在D-异抗坏血酸钠工业生产中的应用研究

荧光假单胞菌A4 6是通过紫外线诱变K10 0 5菌株所得到的一株抗噬菌体菌株。在噬菌体存在的情况下 ,使用菌株A4 6和K10 0 5在 50kL的发酵罐上进行了 2 酮基 D 葡萄糖酸的发酵生产。结果表明 ,荧光假单胞菌A4 6对噬菌体的抗性稳定 ,其发酵周期短 ,发酵转化率高 ;经过多次传代 ,荧光假单胞菌A4 6对噬菌体的抗性及其发酵生产 2 酮基 D 葡萄糖酸的能力没有改变 ;该菌株的发酵产物可以用于D

面包乳杆菌ZHG2-1对荧光假单胞菌群体感应的淬灭作用

以紫色杆菌CV026为指示菌株,验证面包乳杆菌ZHG2-1群体感应淬灭活性,检测其对荧光假单胞菌生物膜、致腐因子表型以及相关基因表达水平的影响,探究面包乳杆菌ZHG2-1对荧光假单胞菌群体感应的淬灭机制。结果表明:菌株ZHG2-1无细胞上清液对荧光假单胞菌AHLs的降解活性为100%。在亚抑制质量浓度(1.0,2.0,3.0 mg/mL)下,菌株ZHG2-1粗提物对荧光假单胞菌生物膜的抑制率和清除率分别为在9.66%~31.32%和28.62%~62.82%范围,对胞外多糖、蛋白酶、脂肪酶、生物胺等致腐因子抑制率在7.23%~100%范围,并呈质量浓度依赖性。扫描电镜结果表明亚抑制质量浓度的菌株ZHG2-1粗提物处理使其生物膜量显著减少,细菌菌落处于分散状态。qRT-PCR结果显示,菌株ZHG2-1粗提物对荧光假单胞菌群体感应基因rhlI和rhlR分别下调0.93和0.99,aprX、algA、orm、flgA、ldcA等生物膜和致腐基因的表达水平也被显著抑制,说明面包乳杆菌ZHG2-1通过干扰荧光假单胞菌群体感应基因的表达,影响其生物膜和腐败因子的产生。本研究结果为开发水产品新型生物防腐剂提供理论依据。

产AmpC酶铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药机制的研究

目的研究产AmpC酶的铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的分子机制。方法2003—2007年从临床标本中分离到铜绿假单胞菌220株,采用三维试验筛选产β内酰胺酶(包括AmpC酶)的铜绿假单胞菌,应用多重PCR检测产AmpC酶的铜绿假单胞菌质粒携带的AmpC耐药基因,应用荧光定量RT-PCR的方法检测染色体AmpC酶基因和oprD2基因的表达情况。结果共检出40株产β内酰胺酶的菌株,其中产AmpC酶、ESBLs、金属酶(MBL)和未知酶型铜绿假单胞菌的构成比分别是62.5%(25/40)、20%(8/40)、7.5%(3/40)和10%(4/40)。25株产AmpC酶菌株均有不同程度AmpC酶基因表达量升高,其中,仅1株细菌携带DHA质粒型AmpC酶基因,12株菌oprD2基因表达量减低,这些菌株均对亚胺培南耐药,13株菌oprD2基因表达量正常,其中仅5株菌对亚胺培南耐药;7株菌(占产AmpC酶菌株的28%,不产金属酶)的酶粗提物能微弱水解IPM,这7株菌AmpC酶基因的表达量均有明显升高,其中5株菌同时伴有oprD2基因表达量降低。结论铜绿假单胞菌产生的AmpC酶可微弱水解亚胺培南,且其水解亚胺培南可能与AmpC酶产生量有一定关系;产AmpC酶铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的原因可能是细菌AmpC酶表达量增加和oprD2表达量减低两者共同作用的结果。

噬菌体对荧光假单胞菌A46的感染及其防治的初步研究

利用透射电镜观察2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌A46感染噬菌体KS461-2后的菌体形态变化,测定该菌株耐噬菌体突变频率,考察不同pH值对噬菌体增殖的影响,检测4种常用药物对噬菌体的防治效果。结果表明,随着噬菌体感染时间的延长,菌体形态变化差异显著;该菌株耐噬菌体KS461-2的突变频率在2.5×10-6左右;噬菌体在pH7.5～8.0的条件下容易吸附于宿主而增殖;草酸铵能有效抑制该噬菌体的增殖,而对宿主菌的生长无明显影响,最佳添加浓度为0.7%。

不同降解菌对甲基毒死蜱及3,5,6-三氯-2-吡啶酚的降解能力比较

为掌握微生物降解甲基毒死蜱的特性与机制,首先从土壤中分离不同的甲基毒死蜱降解菌,然后对其降解效率、降解过程中中间产物3,5,6-三氯-2-吡啶酚(TCP)的质量浓度变化、对TCP与其他6种有机磷农药的降解能力以及磷酸酯酶活性进行了测试分析。结果表明,分离到2株能高效降解甲基毒死蜱的菌株,经鉴定命名为地衣芽孢杆菌ZL-7与荧光假单胞菌ZHLXL-2,其降解甲基毒死蜱的5 d降解率分别为90.6%和99.4%;在菌株ZL-7降解甲基毒死蜱的过程中检出了TCP,而在菌株ZHLXL-2的降解过程中未检出。菌株ZHLXL-2能降解TCP,48 h降解率可达91.0%,而菌株ZL-7不能降解TCP。两菌株都能降解6种供试的有机磷农药,但菌株ZL-7降解率更高,其10 d降解率在92.1%~99.8%,菌株ZHLXL-2的10 d降解率为89.2%~93.4%;同时菌株ZL-7的磷酸酯酶活性显著高于菌株ZHLXL-2。分析表明,这2种菌株的磷酸酯酶活性与其降解有机磷农药的能力呈正相关性,而菌株ZHLXL-2因可有效降解中间物TCP,从而能更快地降解甲基毒死蜱。

秀丽线虫对根际益生菌P13和S3-1传播作用及对植物生长的影响

通过缓慢杀线实验、偏好性实验和共培养毒性实验分析了秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)对荧光假单胞菌P13(Pseudomonas fluorescens P13)和解淀粉芽孢杆菌S3-1(Bacillus amyloliquefaciens S3-1)传播的可能性.通过显微观察与平板稀释涂布对秀丽线虫细菌携带作用进行了定性、定量分析,并对细菌—线虫—植物三者交互作用进行初步探究.结果发现,P13和S3-1对秀丽线虫的慢性致死率分别为12.12%和3.00%,每10 s身体弯曲次数分别为4.68和4.33.相对于尿嘧啶缺陷型大肠杆菌(OP50),线虫对P13和S3-1选择系数分别为0.13和0.52,P13、S3-1携带菌量分别为(4.02×103±47)和(9.67×102±22)CFU/条.携细菌线虫将细菌定向传播至植物根际,细菌定殖菌量为105CFU,有效促进植物生长发育.