质粒pACYC184电转化松材线虫携带的荧光假单胞菌GcM5－1A

以质粒pACYC184为材料,研究了松材线虫携带的荧光假单胞菌的最适电转化条件.结果表明,荧光假单胞菌GcM5-1A培养至D600nm为0.5时制备感受态细胞,以300mmol/L蔗糖溶液为电击缓冲液,质粒DNA终浓度为0.01ng/μL,在25μF电容、9kV/cm电场强度、200Ω电阻的电击条件下电击一次,可得最大的电转化效率,即5.5×106/μg(DNA).SDS-PAGE分析显示,转化质粒pACYC184的氯霉素抗性基因在受体细胞内得到了表达.本方法的建立为松材线虫携带的荧光假单胞菌的基因导入提供技术支持,为进一步通过基因敲除的方法,选择性地失活特定功能基因,进而确定这些基因在松材线虫病病理进程中的作用奠定基础.

荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens GcM5-1A菌株的胞外木素过氧化物酶的部分纯化和鉴定(英文)

荧光假单胞菌GcM5-1A是松材线虫携带的一种致病菌。在GcM5-1A的培养液中发现有木质素过氧化物酶的活性,同时显示很强的毒性。通过对其胞外木质素过氧化物酶的酶学性质的初步研究发现:其最适温度为35℃,最适pH为4.0。在15～35℃、pH为6.0～9.0范围内,酶活保持相对稳定。NH2OH·HCl和KCN对酶活的抑制作用分别达到88%和57%,而NaN3对酶活的抑制作用只有15 %左右。Ca2+、Mn2+和Fe3+对其活性有增强作用,但是Hg2+和Zn2+却有中等的抑制作用。KCN和NH2OH·HCl抑制其酶活性分别达57%、88%,而NaN3的抑制率仅为15%。吸收光谱显示该酶在406nm处有一个Soret峰,加入1mmol/L Na2S2O4后,吸光度出现了明显的下降,但Soret峰没有显著移动。

荧光假单胞菌M18 rpoD克隆及其对抗生素合成的影响

荧光假单胞菌M1 8对多种植物病原真菌具有显著的抑制作用。荧光假单胞菌(Pseuclomonesfluo rescens)M1 8能同时合成吩嗪 1 羧酸 (PCA)和藤黄绿菌素 (Plt)两种抗生素。从M1 8的基因组中克隆了rpoD基因 ,其相应的氨基酸序列与荧光假单胞菌CHAO中RpoD蛋白的氨基酸序列完全相同。利用基因重组技术和大肠杆菌 荧光假单胞菌穿梭质粒pME60 32 ,将rpoD置于强启动子Ptac的控制下 ,导入M1 8菌株。发现经重组质粒转化的M1 8,与对照相比 ,培养基中PCA和Plt开始累积的时间分别提前 4h和 8h ,积累量提高 1倍和 6倍。

荧光定量PCR法检测不同状态下铜绿假单胞菌intⅠ1基因的表达

目的检测铜绿假单胞菌Ⅰ类整合酶基因(intⅠ1基因)在生物膜状态和浮游状态表达水平的差异,探讨整合子的作用机制。方法对3株Ⅰ类整合酶阳性的铜绿假单胞菌分别进行液相培养和生物膜细菌培养,常规方法提取3株细菌两种生长状态的总RNA。采用荧光定量PCR(FQ-PCR)法,以细菌的16srRNA为内参照,分别测定菌株SW07、R07和TH12的浮游细菌和生物膜细菌intⅠ1mRNA的相对表达量,比较3株菌在两种状态下intⅠ1mRNA的表达水平。结果3株铜绿假单菌的生物膜细菌和浮游细菌都检测到intⅠ1基因的表达。3株菌在两种状态下intⅠ1mRNA的表达量不同,生物膜细菌intⅠ1基因的表达水平较高,其中菌株R07、SW07和TH12的生物膜细菌intⅠ1mRNA的表达量分别较浮游细菌高1.4、5.7和128倍。结论在生物膜状态下,铜绿假单胞菌intⅠ1基因的表达上调,本实验结果提示整合子在生物膜细菌中可进行更加活跃的基因盒捕获和积累,整合子和细菌生物膜的形成是导致细菌对抗生素耐药的重要机制。

荧光假单胞菌株M18防治甜瓜蔓枯病害

荧光假单胞菌株 M1 8在离体条件下 ,能有效抑制甜瓜蔓枯病菌的菌丝生长 .经甜瓜蔓枯病菌的苗期接种试验 ,M1 8的菌悬液 (1 0 8CFU/m L )对甜瓜蔓枯病的防治效果达到 80 %左右 .在苗期接种抗性诱导试验中 ,发现荧光假单胞菌株 M1 8还具有诱导甜瓜幼苗产生系统性抗甜瓜蔓枯病菌感染的能力 .从 M1 8培养液中 ,提取并纯化了抗生物质吩嗪 - 1 -羧酸 (PCA) ,该物质对甜瓜蔓枯病菌具有强力抑菌作用 ,EC50 值仅为 3.2 4 μg/m L.在大田试验中 ,M1 8可以保持 80 %的防治效果 ,显著提高甜瓜产量 ,并且还发现在蔓枯病发病初期 ,M1

荧光假单胞菌M18的rpoS基因克隆及其功能分析

从荧光假单胞菌 (Pseudomonasfluorescentsp .)M1 8基因组中克隆了RNA聚合酶的稳定期σs 因子编码基因rpoS ,推测其氨基酸序列与铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌的同源性分别为 99 1 %、87 35 %和87 8%。利用体外定点插入突变和同源重组技术 ,构建了M1 8的rpoS突变株M1 8R- 。对突变株M1 8R- 合成抗生素吩嗪 1 羧酸 (PCA)和藤黄绿菌素 (Plt)的动力学分析结果表明 ,在KB或PPM培养基中 ,突变株合成PCA的能力比野生型分别提高了 2 5或 5 78倍 ,但Plt的积累量不受影响。与野生型相比 ,突变株对碳源饥饿的耐性下降。同时 ,在碳源饥饿条件下对过氧化氢、乙醇和和氯化钠等环境胁迫的交叉保护性减小 。

荧光假单胞菌株M18产吩嗪-1-羧酸的条件

在摇瓶发酵条件下 ,研究了产吩嗪 - 1 -羧酸 ( PCA)的荧光假单胞菌 M1 8在各种碳源、氮源、盐类、温度、接种量下 PCA的分泌量 ,确定了适合 PCA分泌的最佳培养基 ( 1 L) :葡萄糖 2 0 g,肉胨2 2 g,KNO3 1 0 g;最佳培养条件 :温度 2 8°C,起始 p H 7.0 ,装瓶量 2 0 0 /5 0 0 ( m L) ,接种量 5 % ;最佳培养时间 72 h.在此条件下 ,PCA在发酵液中的浓度可达到 82 0 mg/L.

降解1,2,4-三氯苯的硝基还原假单胞菌J5-1的分离鉴定和邻苯二酚1,2-双加氧酶基因的克隆

从受氯苯污染的土壤中分离到1株以1,2,4-三氯苯为唯一碳源生长的细菌,命名为J5-1.根据其生理生化特征和16SrDNA(GenBank Accession No.EF107515)序列相似性分析,将该菌株初步鉴定为硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens).当1,2,4-三氯苯初始浓度为400 mg/L时,J5-1对其最大降解率接近90%;当1,2,4-三氯苯浓度初始为20 mg/L时,降解效果最好.J5-1对1,2,4-TCB的降解服从一级反应动力学.从J5-1的基因组DNA中克隆到CC12O的全长序列.

鲈鱼肠道LactobacillussakeiLY1-6对荧光假单胞菌抑制作用研究

目的：从海鱼肠道中筛选对荧光假单胞菌具有较强抑制作用的乳酸菌。方法：采用牛津杯琼脂扩散法筛选菌株，通过生理生化反应和16SrRNA测序进行菌株生物学鉴定，利用蛋白酶、pH和温度等因素对抑菌活性进行分析，采用扫描电镜分析乳酸菌无细胞上清液（CFS）对荧光假单胞菌细胞结构的完整性影响。结果：从鲈鱼肠道中筛选出对荧光假单胞菌具有较强抑制活性的菌株LY1—6，经生理生化和16SrRNA测序鉴定为清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）。菌株LY1—6CFS经胃蛋白酶处理后其抑菌活性完全丧失，经中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶处理后其抑菌活性分别丧失了38．22％、38．00％、22．48％和18．46％。在pH2．5—5．0具有抑菌活性，并具有良好的热稳定性，初步结果表明LY1—6CFS中抑菌活性物质可能为细菌素。扫描电镜结果表明经LY1—6CFS处理使荧光假单胞菌细胞结构被破坏并溶解。结论：来自鲈鱼肠道的清酒乳杆菌LY1—6对荧光假单胞菌具有较强抑制作用，其抑菌活性物质为细菌素类，作用机制为破坏细胞的完整性，可作为控制水产品中荧光假单胞菌腐败生物保鲜的出发菌株。

酵母耐铜基因CUP1改良荧光假单胞菌耐铜性研究初报

利用根际促生菌(PGPR)荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等微生物的生物修复作用可治理土壤重金属污染。酿酒酵母耐铜基因CUP1编码铜金属硫蛋白(Cu-MT),对铜有很高的亲和性,可拮抗重金属铜毒性。为提高荧光假单胞菌的生物修复能力,将酿酒酵母耐铜基因CUP1克隆至荧光假单胞菌。通过引物设计,将SD序列添加至酵母耐铜基因CUP1编码序列前端,PCR扩增得到约200bp的CUP1片段,克隆至测序载体pUC19,经测序证明正确后,胶回收CUP1片段连接到具有广泛宿主范围的柯斯质粒pLAFR3上,经三亲接合转移至荧光假单胞菌AS1.1381,得到重组菌株AS1.1381/pL3CUP1。铜实验表明,重组菌株AS1.1381/pL3CUP1的抗铜能力(6mM Cu2+)显著高于AS1.1381/pLAFR3(4.5mMCu2+),重组菌株抗铜性得到提高。

荧光假单胞菌Tn5转座诱变及对青枯病生防特性

目的:利用Tn5转座诱变荧光假单胞菌PF20001,研究所获得的突变株对青枯病的生防效果。方法:利用三亲本杂交方式,将带有转座子Tn5的Tn5-102(含luxAB)的质粒pTR102成功地转入PF20001,利用平板相互拮抗法分析突变株对青枯病致病菌的拮抗作用。结果:通过诱导Tn5转座,得到荧光假单胞菌PF20001的Tn5插入突变库。经平板相互拮抗实验发现,菌株PF20001-lux-48拮抗圈明显大于野生型(半径达0.35cm)。用Tn5-lux特异引物进行PCR扩增,结果显示只有以该突变株的DNA为模板才能得到300bp的扩增产物,证实该菌株基因组中有Tn5插入。结论:Tn5的插入使菌株PF20001对青枯病生物防治能力增强。

莫西沙星经ERK1/2通路抑制铜绿假单胞菌诱导气道上皮细胞产生MUC5AC

目的:研究喹诺酮类抗生素莫西沙星(moxifloxacin,MXF)对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)诱导气道上皮细胞表达产黏蛋白MUC5AC的影响,并探讨其可能的分子机制。方法:体外培养NCI-H292细胞,用不同浓度的PA、产藻酸盐型PA脂多糖(光滑型,sPA-LPS)、非藻酸盐型PA脂多糖(粗糙型,rPA-LPS)刺激,然后加入不同浓度MXF孵育24h,分别采用ELISA和实时定量PCR检测MUC5AC蛋白和mRNA的表达情况,Westernblot检测NCI-H292细胞内ERK1/2的激活情况。结果:PA、sPA-LPS和rPA-LPS能明显诱导NCI-H292细胞产生和表达MUC5AC,并能促进ERK1/2磷酸化。而MXF处理后,能以剂量依赖性方式抑制PA、sPA-LPS或rPA-LPS诱导的MUC5AC蛋白表达,并有效抑制ERK1/2的磷酸化。结论:MXF能抑制PA诱导的黏蛋白表达,因此有望用于PA诱导的黏蛋白过度分泌的治疗。

诱变筛选荧光假单胞菌M18高产吩嗪-1-羧酸(PCA)菌株及发酵条件研究

研究了亚硝基胍 (NTG)的诱变剂量、处理时间以及氯化钠浓度对野生型荧光假单胞菌M 18存活率的影响 ,NTG的诱变剂量 2 5～ 2 0 0mg/L ,处理时间 10～ 30min范围内 ,随着诱变剂剂量增加和时间的延长 ,M 18的存活率不断下降。NTG的作用剂量 2 5mg/L ,处理时间 10min时 ,细菌存活率为 5 5 %左右。利用细菌存活率为 5 5 %时的诱变条件 ,经生物测定 ,初筛获得 2 0株抑菌效果明显的诱变株。经摇瓶发酵复筛 ,从这 2 0株诱变株中 ,获得PCA高产诱变株M 18N0 7。并对此菌株发酵条件进行调整 ,较理想的培养条件为 :蛋白胨 18g/L ,葡萄糖 16 g/L ,氯化钠 1g/L ,硝酸钾10 g/L。小瓶培养时间 17h ,大瓶 5 %接种量 ,2 8℃培养 5 4h。

荧光假单胞菌Tn5诱变菌株防治小麦全蚀病的初步研究

利用生物技术(转座子Tn5诱变)对荧光假单胞菌进行遗传改良获得对小麦全蚀病有更好防治效果的基因工程菌株。将大肠杆菌S17—1中psup2021值粒上的转座子Tn5转移到荧光假单胞菌CN12菌系的基因组内获得5100个Tn5突变体,转化频率为1.2×10^(-7)。与自然菌系CN12比较,7个突变体对全蚀病菌的离体拮抗作用提高到160—250%,其中3个突变体对温室苗期全蚀病防治效果也显著提高(p=0.01)。初步研究证明:(1)荧光假单胞菌中可能存在两类功能不同的拮抗作用基因(暂称为抗生基因和调控基因);(2)在目前抗病基因缺乏或难于应用的情况下,利用微生物或其有用基因达到防病增产的目的可能是一条有希望的途径。

群体感应抑制剂3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用

为了研究3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮(3,4-dibromo-2(5H)-furanone,DF)对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用。通过在24孔板和硅胶片上构建生物膜模型,CFU计数法测定DF对荧光假单胞菌的最低抑制浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)和最低杀菌浓度(Minimum Bacterial Concentration,MBC)以及生物膜生长曲线,在1倍MIC和5倍MIC的DF作用下的荧光假单胞菌生物膜形成率和细菌群集运动能力,并探讨DF对荧光假单胞菌总蛋白合成及多糖含量的影响。结果表明,DF对荧光假单胞菌作用的MIC和MBC值分别为12.5μg/m L和800μg/m L;在DF浓度为1 MIC和5 MIC时,作用于荧光假单胞菌24 h生物膜形成抑制率分别为20.59%±2.91%和99.54%±1.83%,并能明显抑制荧光假单胞菌的群集运动能力,干扰荧光假单胞菌群体感应(Quorum sensing,QS)系统而影响其总蛋白合成及多糖的含量,24 h时5 MIC的DF对荧光假单胞菌总蛋白和菌多糖合成量的抑制率分别为8.04%±0.37%和51.08%±2.71%。本研究对DF影响荧光假单胞菌生物膜形成的原因,DF对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用及其对QS通路的干扰具有良好的理论和实践参考。

面包乳杆菌ZHG2-1对荧光假单胞菌群体感应的淬灭作用

以紫色杆菌CV026为指示菌株,验证面包乳杆菌ZHG2-1群体感应淬灭活性,检测其对荧光假单胞菌生物膜、致腐因子表型以及相关基因表达水平的影响,探究面包乳杆菌ZHG2-1对荧光假单胞菌群体感应的淬灭机制。结果表明:菌株ZHG2-1无细胞上清液对荧光假单胞菌AHLs的降解活性为100%。在亚抑制质量浓度(1.0,2.0,3.0 mg/mL)下,菌株ZHG2-1粗提物对荧光假单胞菌生物膜的抑制率和清除率分别为在9.66%~31.32%和28.62%~62.82%范围,对胞外多糖、蛋白酶、脂肪酶、生物胺等致腐因子抑制率在7.23%~100%范围,并呈质量浓度依赖性。扫描电镜结果表明亚抑制质量浓度的菌株ZHG2-1粗提物处理使其生物膜量显著减少,细菌菌落处于分散状态。qRT-PCR结果显示,菌株ZHG2-1粗提物对荧光假单胞菌群体感应基因rhlI和rhlR分别下调0.93和0.99,aprX、algA、orm、flgA、ldcA等生物膜和致腐基因的表达水平也被显著抑制,说明面包乳杆菌ZHG2-1通过干扰荧光假单胞菌群体感应基因的表达,影响其生物膜和腐败因子的产生。本研究结果为开发水产品新型生物防腐剂提供理论依据。

调控基因gacA在荧光假单胞菌2P24防治土传病害中的作用

Pseudomonas fluorescens2P24分离自山东小麦全蚀病自然衰退土壤，该菌株能产生抗生素2，4-二乙酰基藤黄酚(2，4-diacetylphloroglucinol，2，4-DAPG)、氢氰酸，嗜铁素和蛋白酶，且抑菌谱广，可防治多种作物土传病害。本研究应用Tn5转座突变技术，获得1株产嗜铁素过量，同时不产生2，4-DAPG、HCN、蛋白酶、不能形成生物膜(biofilm)的突变菌株PM3390，

秀丽线虫对根际益生菌P13和S3-1传播作用及对植物生长的影响

通过缓慢杀线实验、偏好性实验和共培养毒性实验分析了秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)对荧光假单胞菌P13(Pseudomonas fluorescens P13)和解淀粉芽孢杆菌S3-1(Bacillus amyloliquefaciens S3-1)传播的可能性.通过显微观察与平板稀释涂布对秀丽线虫细菌携带作用进行了定性、定量分析,并对细菌—线虫—植物三者交互作用进行初步探究.结果发现,P13和S3-1对秀丽线虫的慢性致死率分别为12.12%和3.00%,每10 s身体弯曲次数分别为4.68和4.33.相对于尿嘧啶缺陷型大肠杆菌(OP50),线虫对P13和S3-1选择系数分别为0.13和0.52,P13、S3-1携带菌量分别为(4.02×103±47)和(9.67×102±22)CFU/条.携细菌线虫将细菌定向传播至植物根际,细菌定殖菌量为105CFU,有效促进植物生长发育.

通过染色体整合抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚合成基因提高荧光假单胞菌生防能力

Pseudomonas fluorescens CPF-10和2P24分离自小麦全蚀病自然衰退土壤,两者都产生酚类抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol,2,4-DAPG),对多种土传植物病害具有较好的防治能力.利用Tn5转座子携带2,4-DAPG合成基因簇分别整合到野生荧光假单胞菌P32(2,4-DAPG-),CPF-10和2P24的染色体上,HPLC结果表明2,4-DAPG阴性菌P32可以产生抗生素2,4-DAPG,2,4-DAPG阳性菌CPF-10和2P24的抗生素产量可显著提高.番茄青枯病菌、小麦全蚀病菌、棉花立枯病菌的平板抑菌实验和番茄青枯病、小麦全蚀病温室防病实验结果说明2,4-DAPG产量的提高对防治病害具有增效作用.工程菌与野生菌株在灭菌土中定殖能力没有显著差异,但在自然土中工程菌较野生菌的定殖能力显著提高.结果表明,提高抗生素2,4-DAPG的产量是提高荧光假单胞菌防治病害效果的有效途径之一.

1,2,4-三氯苯双加氧酶和脱氢酶基因克隆与序列分析

通过Pseudomonas nitroreducensJ5-1对不同氯苯类底物的降解实验,发现其降解能力大小顺序为：1,2,4-三氯苯〉1,3-二氯苯〉1,2-二氯苯〉氯苯,与已报道的1,2,4-三氯苯降解菌株在底物利用的特性方面存在差异.采用PCR技术从J5-1中扩增获得氯苯降解过程中的关键酶——氯苯双加氧酶和脱氢酶的基因序列,分别命名为tcbA和tcbB,序列比对发现其与Burkholderia sp.PS12的氯苯双加氧酶和脱氢酶的基因序列同源性最高.通过J5-1的氯苯双加氧酶α亚基（TcbAa）与PS12的氯苯双加氧酶α亚基（TecA1）的氨基酸序列比对发现,在307-310位置有连续4个氨基酸残基的差异（I307L、M308TI、309V、Q310E）,这可能是造成2株菌对1,2,4,5-四氯苯降解偏好性差异的原因.此外,通过催化芳香化合物降解的双加氧酶α亚基的系统进化分析,认为TcbAa属于甲苯/联苯亚科,且与多取代氯苯双加氧酶α亚基的同源性最大.