配施荧光假单胞菌对采煤区复垦土壤化学及生物学特性的影响

为探讨无机肥、有机肥配施荧光假单胞菌对采煤区复垦土壤化学生物学特性的影响,以复垦5 a的土壤为研究对象,设置单施无机肥(CF)、荧光假单胞菌剂配施无机肥(CFB)、单施有机肥(M)、荧光假单胞菌剂配施有机肥(MB)、不施肥(CK)共5个处理。结果表明,MB处理较M处理有机质、碱解氮、有效磷、微生物量碳氮含量显著增加了5.57%~21.30%,碱性磷酸酶、脲酶、转化酶活性显著增加了15.44%~18.68%;而CFB处理较CF处理仅碱解氮含量、脲酶活性分别显著增加了4.77%、12.62%,表明荧光假单胞菌可以在一定程度上提高复垦土壤化学生物指标。复垦土壤的优势菌门为放线菌门、变形菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门,优势菌属为节杆菌属、芽生球菌属、KD4-96、芽单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、类诺卡氏菌属、Vicinamibacterales、Vicinamibacteraceae、JG30-KF-CM45。施加荧光假单胞菌对复垦土壤细菌多样性指数和优势菌门、菌属组成无显著影响,但可在一定程度上改变细菌属水平相对丰度。冗余分析结果表明,有机质、碱解氮对复垦土壤细菌群落的影响程度较高,脲酶、碱性磷酸酶、转化酶对复垦土壤细菌群落的影响程度较低。主成分分析表明,与M处理相比,MB处理的综合得分增加了2.92;与CF处理相比,CFB处理的综合得分增加了1.82。综上,荧光假单胞菌的施用有利于采煤复垦区土壤的熟化,且荧光假单胞菌与有机肥配施效果优于荧光假单胞菌与无机肥配施。

不同有机腐熟物与荧光假单胞菌配施对复垦土壤氮素形态和酶活性的影响

[目的]本文旨在探究不同有机腐熟物与荧光假单胞菌配施在矿区复垦土壤的有效合理施用。[方法]以玉米作为供试作物,采用盆栽试验研究不同有机腐熟物(羊粪、牛粪、猪粪、鸡粪)与荧光假单胞菌配施对复垦土壤氮素形态和酶活性影响。[结果]有机腐熟物配施荧光假单胞菌可以在单施有机腐熟物的基础上有效提高复垦土壤各氮素、微生物量碳/氮含量和酶活性。以鸡粪配施荧光假单胞菌对各氮素、微生物量碳/氮含量以及4种土壤酶活性的提升效果最为显著,其与单施鸡粪处理相比,铵态氮含量显著提高13.12%,微生物量碳显著提高20.21%,蛋白酶活性显著提高16.11%。[结论]腐熟鸡粪与荧光假单胞菌配施效果最好,可作为复垦土壤中较为合理的施用方式。

异硫氰酸苄酯对荧光假单胞菌的抑菌活性及在牛肉保鲜中的应用

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)广泛存在于牛肉、鱼类、家禽和乳制品等生鲜产品中,成为引发食源性疾病的重要原因。以荧光假单胞菌ATCC 13525作为供试菌株,研究异硫氰酸苄酯(benzyl isothiocyanate,BITC)对菌株的抑制作用及其应用于牛肉的保鲜效果。结果表明:通过牛津杯实验法,得到BITC对荧光假单胞菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为0.25 mmol/L;表型实验表明BITC能够破坏细菌细胞膜的通透性并降低代谢活力;此外,相比于对照组,MIC处理组牛肉贮藏7 d内菌落总数、色差值、pH值、总挥发性盐基氮含量及氮氧化合物含量分别降低35.73%、21.52%、4.53%、54.39%和4.78%,而感官评分提高10.45%,说明BITC可以显著抑制荧光假单胞菌的生长,改善牛肉的感官品质及理化指标。因此,BITC在冷鲜牛肉贮藏保鲜方面具有较好的应用前景。

蜡样芽孢杆菌YF-2对荧光假单胞菌群体感应的淬灭活性

荧光假单胞菌是生鲜水产品中常见的优势腐败菌,其致腐能力受N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)类群体感应系统调控。以群体感应淬灭活性为导向,利用热灭活和酸敏感试验分析菌株YF-2分泌的淬灭活性物质类型。采用结晶紫染色法和激光共聚焦显微镜技术探究菌株YF-2对荧光假单胞菌生物膜的抑制和清除作用。通过生理生化和16S rDNA对菌株YF-2进行鉴定。结果表明:菌株YF-2对荧光假单胞菌AHLs具有较强的淬灭作用,降解率为100%,且淬灭活性物质在细胞提取物(CCE)中,通过热灭活及酸敏感试验初步判断淬灭活性物质为酰基转移酶或氧化还原酶。蛋白质量浓度为20,40μg/mL和80μg/mL的CCE对C4-HSL、C6-HSL及C8-HSL的降解率在52.8%~100%范围,对荧光假单胞菌生物膜的抑制率和清除率分别在25.84%~56.63%和26.12%~59.35%范围。此外,激光共聚焦图像表明CCE使荧光假单胞菌生物膜厚度减少,生物膜结构被破坏。同时,菌株YF-2被鉴定为蜡样芽孢杆菌。本研究为应用芽孢杆菌控制水产品腐败菌荧光假单胞菌提供一定的理论依据。

荧光假单胞菌噬菌体对大西洋鲑贮藏过程中品质变化规律研究

目的探究大西洋鲑在4℃贮藏过程中,外源添加荧光假单胞菌及其噬菌体影响大西洋鲑品质变化规律。方法采用色差值、菌落总数(total viable count,TVC)、挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)、质构、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)、pH、剪切力、持水性等指标对冷藏温度(4℃)条件下大西洋鲑的品质变化进行综合评价。结果4℃贮藏期间,初期微生物生长迅速且菌相变化明显,噬菌体vB_PF_Y1-MI的加入使得鱼肉中TVC下降大约0.07 lg(CFU/g);大西洋鲑TVB-N含量整体变化趋势明显呈指数型增长,pH均呈现先下降后上升的变化趋势;添加荧光假单胞菌组的大西洋鲑TBA值和失水率增加程度较明显,经噬菌体处理后有所降低。结论噬菌体v B_PF_Y1-MI的加入,能够降低大西洋鲑鱼肉脂质氧化速率,可以延缓其腐败变质,从而延长大西洋鲑保质期。

荧光假单胞菌YG-1对烟草根黑腐病菌的体外拮抗

为丰富烟草根黑腐病菌高效拮抗菌资源,从玉溪烟草种植区根际土壤中分离烟草根黑腐病高效拮抗菌,结合生理生化特性和16S rDNA序列分析鉴定高效拮抗菌,测定菌株发酵液挥发性物质及发酵液粗提物对根黑腐病菌的拮抗活性。结果表明,筛选得到的12株拮抗菌中YG-1表现出最强的拮抗活性,经生理生化特性和16S rDNA序列分析鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluroescens)。菌株YG-1发酵液挥发性物质可有效抑制烟草根黑腐病菌的生长,使菌丝扭曲畸形,并且降低产孢量,经GC-TOF-MS测定,YG-1发酵液含有酸、醛、酯以及一些含硫化合物,其中酸类物质和含硫化合物抑菌效果强。菌株YG-1发酵液粗提物能破坏烟草根黑腐病菌孢子质膜,当粗提物质浓度为0.25 mg/mL时,孢子失膜率达55.42%,同时检测到有明显的离子和核酸渗漏。拮抗菌YG-1具备开发为生防菌剂的潜力。

荧光假单胞菌株SE-6产铁载体的发酵条件

在摇瓶发酵条件下,研究了荧光假单胞菌SE-6在各种培养条件下的铁载体分泌量,确定了适合铁载体分泌的最佳培养条件：起始pH6．5,装瓶量200/500(mL),接种量2%,最佳培养时间为46h左右,Fe^(3+)浓度为0．8mg/L．在此条件下,铁载体在发酵液中含量最高,为大规模的发酵提供了有价值的数据．

外源AHLs培养下荧光假单胞菌qPCR内参基因的筛选

目的:荧光假单胞菌是冷藏食品的优势腐败菌,其致腐基因受到群体感应系统的调控。为了准确定量腐败基因的表达,研究群体感应调控食品腐败的机制,需筛选荧光假单胞菌的内参基因。方法:以荧光假单胞菌PF-08为研究对象,选择8个常见的内参基因(dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16S rRNA),添加不同类型群体感应信号分子培养后,利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测其基因表达量,采用geNorm、Normfinder、BestKeeper和RefFinder综合评估候选内参基因的表达稳定性,筛选最适内参基因。结果:在不同类型外源信号分子培养下,荧光假单胞菌中Ct值变化程度最小的是gltA,16S rRNA的Ct值过低;geNorm分析表达最稳定的内参基因是atpD和rpoD,且二者联用能准确定量目的基因表达水平;Normfinder和BestKeeper的分析结果都显示gltA是最稳定的内参基因;进一步用RefFinder综合评估,内参基因中表达较稳定的是rpoD和gltA。结论:rpoD和gltA在荧光假单胞菌经不同QS信号分子处理后均稳定表达,可用于后续荧光假单胞菌腐败基因的表达研究,也可为研究其它腐败菌的QS相关基因表达提供内参基因参考。

莫匹罗星产生菌荧光假单胞菌株培养的关键影响因素分析

为了显著提高莫匹罗星的产量以满足生产需求,针对莫匹罗星产生菌荧光假单胞菌株MF21-25的菌落特性、发酵工艺和发酵原材料等培养条件进行了优化研究,获得了最适的菌落培养条件和关键的发酵摇瓶培养影响因素。在优化后的实验条件下,莫匹罗星摇瓶效价达到6693μg/mL,比优化前的摇瓶效价4398μg/mL提高了52.2%。该研究结果可以为后续中试放大及工业化生产提供参考。

荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens RN-88抑菌特性研究

本研究旨在利用拮抗菌防治植物病害,为桃的病害生物防治提供更多可行性的方案。以前期筛选获得的一株桃褐腐病拮抗细菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RN-88为试验材料,采用杯碟法测定发酵液对桃褐腐菌(Monilinia fructicol)的抑菌活性,并结合抑菌圈法,研究了该菌在pH、温度、紫外线(UV)等不同环境中的稳定性。实验结果表明,细菌RN-88能显著降低桃褐腐病的发病率,其发酵液对褐腐病菌(M.fructicol)的抑制率可达44.69%。在过滤除菌后,相对于高温灭菌,发酵液中抑菌物质的损失较小。在pH 7.5~9.0的碱性溶液中,发酵液的抑菌活性有较好的稳定性,但在酸性溶液(3.0≤pH≤6.5)中处理后,其抑菌能力减弱。发酵液的抑菌率几乎不受温度和紫外线(UV)的影响。Pseudomonas fluorescens RN-88细菌具有较好的环境稳定性,具有开发成桃褐腐病生物拮抗剂的潜在价值,本研究为荧光假单胞菌作为新型生防菌的应用提供了理论依据,同时为实现桃病害的生物防治提供了更多可行性的方案。

实时荧光PCR法检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的研究

近年来,包装饮用水中铜绿假单胞菌超标的现象时有发生,运用国家安全标准方法进行检验,过程烦琐,周期较长,不利于监管。然而,实时荧光PCR检验法具有灵敏、快速、准确等优点,被广泛应用于各种检验检测中。本文采用实时荧光PCR法,利用特异性引物和探针对目标基因进行扩增。然后通过实时荧光PCR法对其他5种细菌和梯度含量的铜绿假单胞菌菌悬液进行检测,验证方法的特异性和灵敏度。结果表明,只有铜绿假单胞菌的实时荧光PCR检测结果为阳性,其他细菌的检测结果为阴性,说明本方法对铜绿假单胞菌的特异性较好,方法的灵敏度为1×10^(3)CFU·mL^(-1)。同国家安全标准方法相比,实时荧光PCR法所用时间更短,明显提高了检测效率。

低温等离子体处理模式对冷藏南美白对虾中假单胞菌的抑菌效果及机制研究

目的 探究低温等离子体(cold plasma,CP)处理模式对冷藏南美白对虾中常见荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的抑菌效果及其作用机制。方法 通过CP直接处理和循环处理P. fluorescens,研究了两种处理模式下臭氧含量动态变化对P. fluorescens的生长曲线、细胞活力、生物膜形成、细胞壁、细胞膜完整性和南美白对虾菌落总数及假单胞菌数等指标的影响。结果 两种处理模式在CP处理3 min或3 cycles后,包装内臭氧含量达到最高值,分别为(850±10) mg/m^(3)和(874±20) mg/m^(3)。CP循环处理模式使得臭氧含量随处理循环数递增,因此获得更长的臭氧存在时间从而具有更大的抑菌能力。P. fluorescens生长曲线表明CP处理使得菌体延迟期变长且对数生长期推迟。此外, CP处理后的P. fluorescens细胞活力显著下降(P<0.05), CP-1 min、CP-3 min和CP-3 cycles组的细胞活力分别为33.03%、5.90%和4.82%。同时相比CP-3 min组, CP-3 cycles组的P. fluorescens生物膜OD值下降27.61%。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性和核酸蛋白泄漏量结果表明,细胞壁和细胞膜完整性受损可能是P. fluorescens失活的直接原因。对虾保鲜测试结果证实,贮藏第6 d, CP-3cycles组虾体中的菌落总数和假单胞菌数相比CP-3 min组分别降低了58.02%和79.54%。结论 CP循环处理模式通过延长臭氧与对虾的暴露时间,提高了对P. fluorescens的灭活效果,同时还具有更优越的保鲜能力。本研究为开发基于CP技术的新型保鲜技术应用提供了理论参考。

铜绿假单胞菌对肺血管内皮细胞功能的影响及其机制

目的探究铜绿假单胞菌(PA)感染对肺血管内皮细胞功能的影响,并探讨其加重小鼠肺部炎症反应的可能机制。方法PAO1菌株感染人肺微血管内皮细胞HULEC-5a 2 h后,采用逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测自噬相关基因5(ATG5)、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)和钙黏蛋白5(CDH5)的mRNA表达,免疫荧光检测ATG5、PFKFB3和血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)的蛋白表达。采用小干扰RNA(siRNA)分别敲减ATG5、PFKFB3后,RT-qPCR检测ATG5、PFKFB3和CDH5的mRNA表达,免疫荧光检测PFKFB3和VE-cadherin的蛋白表达,并采用乳酸测定试剂盒检测细胞内乳酸的水平。采用PAO1菌株感染小鼠后,肺组织切片病理染色观察小鼠肺部炎症,激光共聚焦显微镜观察并分析荧光标记的内皮细胞PFKFB3和VE-cadherin的表达量。结果与对照组比较,PAO1感染HULEC-5a细胞后,PFKFB3 mRNA和蛋白表达均增加(P均<0.05),CDH5 mRNA表达减少(P=0.023),VE-cadherin蛋白表达减少(P<0.001),且连续性被破坏,乳酸含量升高(P=0.017)。与PAO1感染HULEC-5a细胞比较,PAO1感染敲减PFKFB3的HULEC-5a细胞后,CDH5 mRNA表达增加(P=0.043),VE-cadherin荧光连续性得到恢复,乳酸含量降低(P=0.047);PAO1感染敲减ATG5的HULEC-5a细胞后,PFKFB3 mRNA(P=0.013)和蛋白表达(P=0.003)均增加,CDH5 mRNA(P=0.020)和VE-cadherin蛋白表达(P=0.001)均减少,乳酸含量升高(P=0.015)。PAO1感染小鼠后,病理HE染色结果显示,肺泡内明显的红细胞渗漏,炎症细胞浸润,肺泡间隔增宽和部分血管内皮细胞脱落。免疫荧光染色结果显示,与正常小鼠比较,PAO1感染小鼠内皮细胞PFKFB3表达增加,VE-cadherin荧光减弱,且不连续。结论PA可能通过AGT5调控PFKFB3通路,破坏肺血管内皮细胞功能,进而加重小鼠肺部炎症反应。

石仙桃多糖对铜绿假单胞菌致大鼠肺部感染的作用机制研究

目的探讨石仙桃多糖(PCP)抑制铜绿假单胞菌(PA)致肺部感染模型大鼠作用并初步探讨其可能的作用机制。方法制作PA大鼠肺部感染模型,雄性SD大鼠48只,用水合氯醛腹腔注射麻醉,行气管切开术,将PA注射到气管内,将大鼠随机分为PCP高、中、低剂量组和模型组,每组12只;另用未经处理的12只大鼠作为空白对照组。PCP低、中、高剂量组大鼠每天灌胃PCP 15、20、30 mg/kg,共7 d,模型组和空白对照组大鼠每天按5 ml/kg体重灌胃生理盐水。末次用药后次日用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,采集肺组织及肺泡灌洗液,测定肺组织湿/干比,计数各组支气管肺泡灌洗液(BALF)的白细胞总数,BALF离心取上清液检测肝素结合蛋白、白细胞介素-6(IL-6)、降钙素原(PCT)细胞因子表达水平,用免疫印迹法(WB)检测BALF中NF-κB等蛋白磷酸化表达水平。结果与空白对照组比较,模型组肺组织湿/干比显著增加(P<0.05),肺泡灌洗液中白细胞数量明显增加(P<0.05),肝素结合蛋白、白细胞介素-6、降钙素原等表达明显上升(P<0.05),并可诱导模型组肺组织NF-κB p65和p-1κBα磷酸化(P<0.05);用PCP治疗PA致肺部感染SD大鼠模型可明显抑制NF-κB p65和p-1κBα磷酸化(P<0.05),且低、中、高剂量组作用指标呈梯度改变(P<0.05)。结论PCP对PA引起的大鼠肺部感染模型炎症反应保护作用机制可能通过下调肝素结合蛋白等细胞因子的表达和抑制NF-κB的活化及炎症因子的产生。

包装饮用水中铜绿假单胞菌实时荧光定量PCR快速检测

目的:有效弥补传统微生物学检验方法的缺陷。方法:针对GB 8538—2022中铜绿假单胞菌的毒力基因pcrL和16S rRNA基因的V3~V4区保守序列设计合成引物和探针,建立实时荧光PCR方法。结果:该方法可以有效扩增常见标准储备菌株的16S rRNA基因,且对铜绿假单胞菌标准储备菌株的毒力基因pcrL的检测效果良好,观察到明显的“S”型扩增曲线,但对常见的食源性致病菌无扩增曲线。当菌液浓度<10 CFU/mL时,pcrL基因仍有扩增曲线,其检测范围为10~10~7 CFU/mL,检测限为10 CFU/mL;不同菌液浓度下毒力基因pcrL的Ct平均值为18.0~38.6。对近3年湖南省14个县、市抽查检验(瓶)桶装水中铜绿假单胞菌不合格样品进行进一步检测,符合率达到100%。结论:该方法对铜绿假单胞菌携带毒力因子pcrL检测的灵敏度较高;且操作简便、特异性强,具有良好的实用性。

16S rDNA用作荧光定量PCR靶基因快速检测铜绿假单胞菌

对20余种细菌16SrDNAs进行多序列比对与进化树分析,设计铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR)特异性引物。提取PA基因组DNA,以特异性引物扩增16SrDNA靶片段,并构建重组质粒pMDT-Pfr。将梯度稀释的pMDT-Pfr质粒作为模板,用于建立定量标准曲线。以SYBRGreenI荧光染料建立20μL反应体系,对不同浓度的PADNA样品进行FQ-PCR检测。同时,以金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、福氏志贺菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和结核杆菌的基因组DNA作阴性对照,验证FQ-PCR方法检测PA的特异性。结果显示,设计的FQ-PCR引物的靶向序列,仅对PA16SrDNA有高度同源性;FQ-PCR方法检测PA,其灵敏度达3.6pg/μL的基因组DNA或(2.1×103±3.1×102)拷贝/μL的16SrDNA基因,并且具有很强的特异性;从细菌DNA提取到FQ-PCR检测,可在2h左右完成PA鉴定。较传统的培养鉴定法而言,以16SrDNA作为FQ-PCR靶基因快速检测PA,具有很好的研究价值与应用前景。

发光酶基因标记的荧光假单胞菌Xl6L2在小麦根圈的定殖动态

在土壤微宇宙系统内及田间土壤中,采用发光酶基因标记检测技术研究了荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens,简称Pf)Xl6L2在小麦根圈的定殖动态。研究结果表明:在不灭菌灰潮土微宇宙中,Pf·Xl6L2在小麦播种后36d定殖密度可达最高水平(32×104cfu.g-1根),然后开始下降,最后保持在一个相对稳定的较低水平(约32×102cfu.g-1根))。在田间条件下,Pf·Xl6L2通过种子表面接种在小麦根圈的定殖动态与微宇宙中的相似,可散布至种子下方10cm以内,水平移动距离在植物播种后125d不超过40cm。

2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌A46抗噬菌体菌株的选育

从2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)A46的异常发酵液中分离到1种噬菌体,将其命名为KS461。透射电镜观察表明,KS461呈近球形,直径为52nm。以荧光假单胞菌A46为出发菌株,利用紫外诱变的方法,获得了4株对噬菌体KS461具有抗性的2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株,并研究了这些变异株的遗传稳定性。研究结果表明,经8次传代,这些变异株对噬菌体的抗性及其发酵产酸能力没有改变。

荧光假单胞菌Pf.X16L2与丛枝状小麦根圈内的相互关系

运用发光酶基因标记及其发光强度检测、ＳＤＨ酶活染色等技术，在根盒－土壤微宇宙及塑料盆栽系统中，研究了发光酶基因（ｌｕｘＡＢ）标记的荧光假单孢菌菌株Ｐｆ．Ｘ１６Ｌ２与丛枝状菌根真菌摩西球孢囊霉Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ两者在小麦根圈的相互关系。 Ｇｌ．ｍｏｓｓｅａｅ对Ｐｆ．Ｘ１６Ｌ２的种群密度和生理活性都有着抑制作用，因而能降低小麦根圈对Ｐｆ．Ｘ１６Ｌ２的富集作用，而Ｐｆ．Ｘ１６Ｌ２在一定程度上能提高Ｇｌ．ｍｏｓｓｅａｅ的菌根感染率，但会降低菌丝中琥珀酸脱氢酶（ＳＤＨ）活性。两者可共同促进小麦中后期的生长。

抗噬菌体菌株荧光假单胞菌A46在D-异抗坏血酸钠工业生产中的应用研究

荧光假单胞菌A4 6是通过紫外线诱变K10 0 5菌株所得到的一株抗噬菌体菌株。在噬菌体存在的情况下 ,使用菌株A4 6和K10 0 5在 50kL的发酵罐上进行了 2 酮基 D 葡萄糖酸的发酵生产。结果表明 ,荧光假单胞菌A4 6对噬菌体的抗性稳定 ,其发酵周期短 ,发酵转化率高 ;经过多次传代 ,荧光假单胞菌A4 6对噬菌体的抗性及其发酵生产 2 酮基 D 葡萄糖酸的能力没有改变 ;该菌株的发酵产物可以用于D