猪流行性腹泻病毒荧光免疫层析检测试纸条的研制和应用

为了建立一种快速、高效且灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的现场快速检测技术,本研究以荧光量子点标记鼠抗PEDV单克隆抗体并喷涂到结合垫上,将鼠抗PEDV单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体固定到NC膜上,分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条,并对其敏感性、特异性及临床样品检测性能进行考察。结果:所制备的荧光试纸条可在20 min内完成临床样品中PEDV的现场检测,最低检测限为3.3×103 TCID50/mL,与猪轮状病毒、猪丁型冠状病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌等常见病原无交叉反应,对50份粪便、粪便拭子和肠道组织等临床样品进行检测,与RT-PCR检测结果的符合率为84.0%。本试验表明该试纸条具有较高的灵敏度和较强的特异性,检测时间短,操作简便,可用于PEDV的现场快速筛查。

胶体金免疫层析试纸条在生物毒素检测领域的研究进展

胶体金免疫层析试纸条是一种常用的检测方法,广泛应用于疾病诊断、生物毒素检测等领域。该技术基于胶体金标记的特异性抗原(抗体)与待检样品中的目标分子相互作用,在试纸条上形成可见的测试线或信号变化。其流程包括样品预处理、标记抗体制备、试纸条组装步骤。胶体金免疫层析试纸条可以用于快速检测食品中的毒素残留、环境中的有害物质以及临床诊断中的相关指标。该技术具有无创、快速、灵敏和准确的特点,在临床应急检测和大规模筛查中能快速获得结果。文章总结了胶体金免疫层析试纸条技术及其在生物毒素检测中的研究进展,并分析了当前胶体金免疫层析试纸条技术的优缺点,展望了该技术在生物毒素检测领域的未来发展方向。

量子点荧光微球免疫层析试纸条定量检测恶性疟原虫

以羧基化Cd Te/Zn Se量子点荧光微球为荧光标记物,采用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）法偶联抗恶性疟原虫富组氨酸蛋白（Pf）单克隆抗体制备荧光探针;以羊抗恶性疟原虫组氨酸多克隆抗体和驴抗鼠二抗分别喷涂硝酸纤维膜,形成试纸条检测线和质控线,建立了免疫层析试纸条定量检测血清中恶性疟原虫的方法。所使用的羧基化量子点荧光微球的荧光强度为单个量子点的2800倍。实验结果表明,该荧光试纸条定量检测血清中恶性疟原虫线性范围为5.8-8010 Parasite/μL,最低灵敏度达到5.8 Parasite/μL,单个样品检测时间只需15 min。加标回收实验显示,试纸条批内回收率为93.0%-111.8%,批间回收率为98.3%-115.1%,且批内、批间的相对标准偏差均小于5%。

时间分辨荧光免疫层析试纸条在油料饼粕黄曲霉毒素B_1检测中的应用

采用黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条及配套的时间分辨荧光速测仪,对油料饼粕中黄曲霉毒素B1的快速检测进行了应用研究。该时间分辨荧光免疫分析技术是基于时间分辨荧光免疫层析试纸条和载有Eu（Ⅲ）标记特异性单克隆抗体的样品瓶建立的检测技术。时间分辨荧光速测仪可内置标准曲线,直接输出检测结果。对6种油料饼粕做黄曲霉毒素B1添加回收率实验,回收率在70%~120%之间,批间、批内变异系数〈15%。在实际样品的检测中,时间分辨荧光免疫层析试纸条检测技术与液相色谱-串联质谱法相比,检测结果相对误差〈15%。时间分辨荧光免疫层析试纸条检测技术测定快速、准确,技术稳定、可靠,设备经济、小型,适用于大批量油料饼粕样品的快速检测和风险评估。

二维Otsu和改进区域生长法的荧光免疫层析试条浓度的定量检测

目前荧光免疫层析试条的定量检测方法绝大多数采用光电反射法,该方法需要对试条进行高精度的定位并且需要复杂的传动装置。利用CMOS图像传感器获取荧光免疫层析试条的图像信息,采用图像分割方法用于荧光免疫层析试条检测线和质控线进行自动识别,首先对采集到的原始图像进行增强预处理,并进行初步分割。然后选定处理后图像的种子点并通过改进的二维Otsu法选取生长阈值对图像进行区域生长,以实现对图像检测线和质控线的分割。结果表明该方法能够在目标和背景对比度很低的情况下,将图像检测线和质控线的轮廓清晰的分割出来,且区域一致性测度和对比度都比较理想。该方法检测不同浓度的试条,得到的特征值重复性小于5%,线性度大于0.99,准确度大于0.98。实验证明用该方法对荧光免疫层析试条进行定量检测是可行的,且较对比仪器具有更宽的检测范围。

基于金纳米棒免疫层析试纸条快速检测玉米中的黄曲霉毒素B_(1)

传统的基于球状胶体金(Au spheres,AuSPs)试纸条由于检测灵敏度偏低,无法满足食品安全高灵敏检测的需求。因此,建立高灵敏、快速分析方法尤为重要。以黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))为检测对象,金纳米棒(Au nanorods,AuNRs)作为信号标签,偶联抗AFB_(1)单克隆抗体作为金标探针,基于竞争法制备免疫层析试纸条对玉米中AFB_(1)进行检测,试验结果通过便携式试纸条定量分析仪定量检测。结果表明:在单抗加入量为0.6μg、T线抗原质量浓度为0.1 mg/mL、探针使用体积为2.5μL的条件下制作标准曲线,基于AuNRs的试纸条检出限为0.124 ng/mL,IC50为1.593 ng/mL,此外实际玉米样品中对AFB_(1)的回收率为89.50%~111.70%;对玉米质控样进行检测,结果与所建立的方法一致。该方法可应用于玉米中AFB_(1)的快速检测,检测结果符合国家标准,具有良好的应用前景。

基于STM32的荧光侧流免疫层析试条定量检测仪

介绍了以STM32为微控制器的荧光侧流免疫层析试条定量检测仪的设计,可实现对C-反应蛋白进行定量检测。检测仪由光学模块、光电传感器、荧光信号采集及调理电路、液晶显示及机械扫描装置等组成。通过对比试验表明:检测仪对C-反应蛋白标准溶液检测下限为1.95μg·m L^(-1),在1.95~256μg·m L^(-1)质量浓度范围内有良好的线性特性,检测仪的线性度和稳定性较好,可应用在生物医学、临床、环境检测等多个领域的快速检测。

荧光免疫层析试条定量检测仪的研制

为了对AMI疑似患者进行现场快速筛查,研制了一款可对AMI荧光免疫层析试条进行定量、快速检测的仪器。该仪器主要由光路单元、数据采集单元、处理及显示单元组成,激发光聚焦于试条上产生荧光,荧光通过收集光路聚焦于线阵CCD,ARM9芯片通过CCD的灰度值对试条进行判断。测试结果表明,仪器检测得到试条的相对荧光强度与心肌标志物浓度成正比,该仪器可实现对患者心肌标志物浓度的定量检验,为患者病情的诊断和康复提供了有力保证。

检测棘球蚴病患者血清内循环抗原的免疫层析试条的制备和评价

目的以棘球蚴囊液纯化抗原特异性单克隆抗体为基础建立一种快速、简便诊断棘球蚴病的胶体金免疫层析试条方法,并对其进行评价。方法纯化棘球蚴囊液抗原,并以此免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,对所制备的单克隆抗体确定其亚类和效价。筛选基于棘球蚴囊液纯化抗原制备的单克隆抗体对,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记筛选到的单克隆抗体,并将其吸附于交联垫;将另一筛选到的单克隆抗体划线包被于同一硝酸纤维素膜适当位置,制成免疫层析试条。用该试条检测手术确诊的细粒棘球蚴病(87例)、多房棘球蚴病(40例)、囊尾蚴病(25例)、日本血吸虫病(10例)、弓形虫病(5例)、并殖吸虫病(5例)、华支睾吸虫病(5例)患者血清,以及60例健康者血清,以评价其检测的敏感性和特异性。结果以棘球蚴囊液纯化抗原为免疫源制备单克隆抗体,共筛选了11株能高效分泌效价在1∶25600~1∶102400特异抗体的细胞株,抗体亚类为IgG_(1)或IgG_(2)a。筛选到的单克隆抗体F 3B 6作为标记抗体,单克隆抗体C 4H 6作为包被抗体制成免疫层析试条,用该试条检测127份棘球蚴病患者血清的敏感性为88.12%(112/127),其中试条检测囊型包虫病患者血清的敏感性为88.51%(77/87),检测泡型包虫病患者血清的敏感性为87.50%(35/40),试条法检测两型包虫病患者血清敏感性之间差异无统计学意义(χ^(2)=0.03,P=0.86)。与25份囊尾蚴病患者血清、10份日本血吸虫病患者血清、5份弓形虫病患者血清、5份并殖吸虫病患者血清和5份华支睾吸虫病患者血清均无交叉反应,60份健康者血清也均为阴性,总特异性为100.00%。结论成功制备了棘球蚴囊液纯化抗原的单克隆抗体,以此单抗为基础研制出的快速诊断棘球蚴病胶体金免疫层析试条敏感性、特异性均较高。

禽流感病毒荧光免疫层析检测试纸条的研制

禽流感是重要的人兽共患病,建立现场快速灵敏的检测方法是防控其发生和流行的前提和基础。本研究采用不同亚型流感毒株交叉免疫小鼠法来免疫小鼠,通过多个亚型的NP表达蛋白来筛选杂交瘤阳性细胞株,获得分泌针对NP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞4株。通过抗体的两两配对,基于荧光量子点作为免疫层析抗体的标记探针,借助免疫层析试纸条双抗夹心法原理,筛选出了适用于免疫层析的两株单克隆抗体,研制了禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV )荧光免疫层析检测试纸条[A lateral-flow immunoassay strip with quantum dots(QDs)against AIV , AIV -QD-LFIA],并对该试纸条进行了特异性、敏感性、可重复性及可靠性分析。试验结果显示:本研究所建立的 AIV -QD-LFIA试纸条检测禽流感标准抗原H5N1-HK的敏感性达到104 EID50 ,检测标准抗原H9N2-HK的灵敏度为102 EID50 ,比商品化的禽流感病毒抗原检测卡灵敏度高100倍,比国家标准实时荧光RT-PCR(rRT-PCR)灵敏度低约100倍;可特异性地检测出H5亚型、H7亚型、H9亚型、H1亚型、H3亚型等A型流感病毒,与 IBV 、 NDV 等常见禽呼吸道传染病病原无交叉反应,且经过了国家流感中心标准样本盘的样品测试,特异性强;同时该法具有良好重复性,连续4周检测20个样品重复结果均为阳性;小规模田间试验显示该法用于禽流感病毒的普查监测结果可靠。可见本研究所建立的 AIV -QD-LFIA试纸条可满足禽流感病毒快速、高灵敏的检测需求,具有广阔的应用空间。

量子点荧光微球免疫层析试纸条定量检测玉米中赭曲霉毒素A

采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)法将抗赭曲霉毒素A(OTA)腹水与量子点荧光微球偶联制备荧光探针,以牛血清白蛋白-OTA偶联物及驴抗鼠二抗喷涂硝酸纤维膜形成试纸条检测线(T线)和质控线(C线),建立了基于T/C荧光强度(FI_T/FI_C)比值法免疫层析试纸条高灵敏度、快速定量检测玉米中OTA的新方法。量子点荧光微球试纸条定量检测OTA线性范围为0.05~1.0ng/mL(Y=0.259lnX+0.897,R^2=0.995),半数抑制浓度(IC_(50))为(0.215±0.023)ng/mL(n=5),玉米提取液中OTA的检出限为0.05 ng/mL,单个样品检测时间10min。加标回收实验表明,3个OTA加标浓度的平均回收率为107.2%-125.5%,相对标准偏差均小于10%。40个实际玉米样品检测结果表明,量子点荧光微球试纸条与酶联免疫吸附分析方法检测OTA的结果具有良好的相关性(R^2=0.975)。

牛布鲁菌荧光标记免疫层析试纸条快速检测方法的建立

为建立一种快速诊断牛布鲁菌病的方法,以原核表达、纯化的外膜蛋白OMP22作为抗原,以带荧光标记的IgG抗体作为标记物制备免疫层析试纸条,建立一种布鲁菌病快速检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行验证。结果显示,制备的试纸条最低可检出1∶100稀释的牛布鲁菌标准阳性血清,且与牛结核、牛蓝舌病、牛病毒性腹泻、牛口蹄疫、牛巴氏杆菌病、牛白血病的血清无交叉反应;试纸条检测结果与商品化ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为93.5%。以上结果表明,建立的荧光标记免疫层析试纸条方法能快速检出牛血清中的布鲁菌抗体,具有良好的敏感性和特异性,是一种适合现场初筛的检测方法。

同时检测玉米中黄曲霉毒素B_(1)和赭曲霉毒素A的时间分辨荧光免疫层析试纸条的研制

研究制备了一种可同时快速定量检测黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))和赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)的二联时间分辨荧光免疫层析试纸条。采用铕系时间分辨荧光微球分别标记AFB_(1)和OTA单克隆抗体,优化荧光微球活化pH值、标记的抗体浓度、荧光探针使用量、检测线包被原浓度、质控线羊抗鼠IgG浓度、样品前处理条件等因素。结果表明:检测AFB_(1)和OTA的IC_(50)分别为1.58、3.91μg/kg,线性范围分别为0.26~9.73、1.14~13.29μg/kg,肉眼检测限分别为3.70、5.55μg/kg;与黄曲霉毒素类似物交叉率为12%~62%,与赭曲霉毒素B交叉率为58%,与其他真菌毒素无明显交叉反应;选择玉米样品进行添加回收实验,2种毒素回收率在92%~103%之间,变异系数小于15%;对实际样品的检测与高效液相色谱法和市售胶体金试纸检测结果一致;且该试纸条可在4℃稳定保存5个月以上,稳定性较好。本研究所制备的时间分辨荧光免疫层析试纸条具有灵敏、准确、快速和简便等特点,非常适用于玉米等食品和农产品中AFB_(1)和OTA的现场快速筛查。

基于BHHCT-Eu^(3+)@SiO_2荧光稀土二氧化硅纳米颗粒的免疫层析试纸条检测卡那霉素

采用微波辅助合成的荧光稀土二氧化硅纳米颗粒(BHHCT-Eu^(3+)@SiO_2)为标记物,建立了快速定量检测卡那霉素(Kana)残留的荧光免疫层析方法。实验结果表明,微波辅助合成的BHHCT-Eu^(3+)@SiO_2纳米颗粒呈球形,粒径约36 nm,具有良好的荧光发射性能,最大吸收波长和最大发射波长分别为343和615 nm。将BHHCT-Eu^(3+)@SiO_2与卡那霉素抗体(Kana-ab)通过醛基化葡聚糖交联,合成了荧光标记抗体Eu^(3+)-Kana-ab,结合定量侧向层析读数仪,建立了牛奶中Kana残留的快速定量检测方法,对Kana的检出限(IC_(10))为0.85 ng/mL,半数抑制浓度(IC_(50))为12.76 ng/mL,检测范围(IC_(20)-IC_(80))为3.0~76.0 ng/mL,牛奶中的Kana的加标回收率范围为93.7%~97.4%,RSD为3.1%~4.6%,与Kana类似物的交叉反应均<1%。牛奶中Kana残留的测定结果与ELISA方法相关性良好。

构建下转换荧光-适配体的免疫层析试纸条用于快速检测黄曲霉毒素B_(1)

构建下转换荧光-适配体免疫层析试纸条用于食品中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B_(1),AFB_(1))的快速高效检测。体系中AFB_(1)存在会减弱下转换荧光-适配体纳米颗粒层析至T线时与AFB_(1)半抗原的结合能力,从而导致下转换荧光信号衰减,进而实现对AFB_(1)的高效检测。该方法在AFB_(1)质量浓度1~40 ng/mL范围内与荧光信号呈良好的线性关系,线性相关系数为0.994,检测限为0.287 ng/mL。该方法利用稀土掺杂荧光纳米颗粒的长寿命发光及近红外荧光特性,有效降低了生物背景荧光干扰并提高了检测体系的特异性。该方法在AFB_(1)的快速高灵敏检测中具有良好的应用前景。

上转换荧光-适配体免疫层析试纸条的构建及其在黄曲霉毒素B1检测上的应用

食品及农产品中,因真菌而产生的黄曲霉毒素B1是人们健康的一大威胁.因此,探寻一种简便快速检测黄曲霉毒素B1的方法对食品安全、农产品质量等方面具有重要意义.该文通过配体交换的方法,使用磷酸化的黄曲霉毒素B1适配体将油酸分子包裹的油溶性上转换纳米颗粒改性为水溶性纳米颗粒.在构建水溶性纳米荧光探针的同时,保留了适配体识别黄曲霉毒素B1的能力,结合免疫层析试纸条,采用小分子竞争法快速定量检测黄曲霉毒素B1.该检测方法的线性范围为5~100 ng/mL,检测限为2.4 ng/mL.将该方法用于花生中黄曲霉毒素B1的检测,其加标回收率为93.8%~111.6%.

基于Android平台便携式荧光免疫层析试条检测装置的设计

荧光免疫层析定量分析具有精度高、检测速度快、操作简单等优点,广泛应用于环境保护、食品安全、临床医疗等领域。本文基于Android平台、OpenCV计算机视觉库的图像降噪等处理技术,开发便捷操作的人机交互应用程序;制作便于携带且与手机匹配良好的荧光试条图像采集暗盒;设计滑动窗口图像分割算法,提取试条测试线、质控线和背景区域的灰度值,最终计算出试条的特征值。使用标准试条图片,对装置检验结果的重复性、有效性、计算耗时等进行测试。实验结果表明:检测装置准确定位荧光试条图像中的测试线和质控线;在试条有效测试范围内,测试线的灰度值降低时,荧光试条图像特征值随之单调递减;改变滑动窗口的宽度对特征值的影响微小。

荧光免疫层析法汗液CRP快速检测试纸条的研发及不同保存条件对汗液CRP的影响

背景研究发现人体汗液C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)与炎症有一定关联,但国内外未见关于汗液CRP快速检测和保存条件的研究。目的利用荧光免疫层析技术研发一种快速半定量检测汗液CRP含量的试纸条并探讨人体汗液不同保存条件下CRP的变化。方法利用双抗体夹心法研发汗液CRP试纸;于2021年5月24日7:00-16:00收集54例青年男性野外徒步50 km状态下的汗液,利用试纸条检测汗液CRP浓度并确定正常参考范围。取其中10例CRP相对高值汗液样本,设置不同保存温度和时间分别检测汗液CRP浓度变化。结果CRP抗原标准品和T/C值的标准曲线方程为Y=(7.5362+0.0105)/[1+(X/2186.5735)^(-0.7549)]-0.0105,R2值为0.9999;空白限(LoB)为1.94 ng/mL;检出限(LoD)为5.94 ng/mL;用相对偏差的绝对值验证准确度,结果均<10%;该测定结果与血清淀粉样蛋白A和降钙素原的交叉反应率分别为0和0.01%;重复性和实验室内精密度均<10%;目标青年男性人群汗液CRP正常参考范围为≤25 ng/mL;不同温度(4℃、25℃、37℃)条件下汗液保存1 h,CRP检测结果差异无统计学意义;保存3 h后,4℃和25℃条件下CRP浓度显著下降,37℃条件下浓度变化不显著。结论荧光免疫层析法快速半定量检测人汗液CRP的试纸条具有较好的准确度、特异性、重复性、实验室内精密度,应扩大样本量进一步研究,未来或可用于人汗液CRP含量快速检测。

CdTe/ZnSe核壳量子点免疫层析试纸条检测克伦特罗的研究

采用巯基丁二酸作为表面修饰剂,水相法合成水溶性的CdTe/ZnSe核壳量子点,然后在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的作用下,将CdTe/ZnSe核壳量子点与抗克伦特罗多克隆抗体(Anti-CLE pAb)连接。通过凝胶电泳和斑点杂交实验,验证CdTe/ZnSe核壳量子点与Anti-CLE pAb连接成功,并且CdTe/ZnSe-Anti-CLE pAb偶联物能识别克伦特罗-BSA抗原(CLE-BSA)。光谱分析表明,量子点与抗体连接后荧光增强,荧光峰位从628nm红移至635nm。将合成的CdTe/ZnSe-Anti-CLE pAb偶联物作为指示克伦特罗(CLE)分子的荧光标记物,制备出一种用于检测CLE的免疫层析试纸条,其最低检测量可达1μg/L。与ELISA法的对比实验表明,此试纸条能应用于CLE残留的快速检测。

大肠杆菌O157:H7荧光微球免疫层析试纸条的研制

目的:建立快速、灵敏检测大肠杆菌O157:H7荧光微球免疫层析试纸条法。方法:以羧基化荧光微球作为标记物,共价偶联抗大肠杆菌O157:H7鼠源单克隆抗体,将大肠杆菌O157:H7兔多抗和驴抗鼠抗体喷涂于硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,以双抗体夹心反应模式制备大肠杆菌O157:H7荧光微球免疫层析试纸条。结果:通过优化实验确定偶联缓冲液为0.02mol/L pH5.0磷酸盐缓冲液,抗体偶联微球量为100μg/mg,试纸条可在加样5min后判读结果。制备的荧光微球试纸条对纯培养大肠杆菌O157:H7进行检测,肉眼观察检测限在1.2×104CFU/mL,借助荧光读取仪检测限能提高到6.1×103CFU/mL。试纸条除与金黄色葡萄球菌有微弱交叉反应外,与实验室保存的30株细菌无交叉反应。结论:大肠杆菌O157:H7荧光微球试纸条具有操作简便、快速灵敏、易于量化的特点,为该菌的检测提供了一种新型的手段。