荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)技术被广泛应用于活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用的实时研究.针对光谱串扰和供体受体间的浓度比等困扰FRET效率定量检测的两大难题,已经发展了多种定...荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)技术被广泛应用于活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用的实时研究.针对光谱串扰和供体受体间的浓度比等困扰FRET效率定量检测的两大难题,已经发展了多种定量检测FRET效率的方法.作者结合自己的研究结果介绍了多种FRET效率定量检测技术在细胞信号转导机制研究中的应用.展开更多
目的荧光共振能量转移(fluorescent resonance energy transfer,FRET)探针由于自身仍存在诸多局限,其在活体成像领域尚未得到广泛应用。本文旨在解决FRET探针在活体定量分子影像应用中所存在的瓶颈问题,即如何利用FRET探针精准计算目标...目的荧光共振能量转移(fluorescent resonance energy transfer,FRET)探针由于自身仍存在诸多局限,其在活体成像领域尚未得到广泛应用。本文旨在解决FRET探针在活体定量分子影像应用中所存在的瓶颈问题,即如何利用FRET探针精准计算目标物浓度,以及如何基于FRET探针实现三维成像。方法基于探针和目标物结合时的化学反应平衡关系,提出一种新型分析方法,以精确定量待测物[钙调素(calmodulin,Ca M)]的浓度。同时对于FRET探针的活体分子成像,结合荧光透射成像(3DFMT)方法,建立了可进行三维时空动态FRET检测的平台系统,对FRET探针的测量结果(即待测物浓度)进行实时定量的三维重建。结果准确地定量了待测物Ca M浓度,并得到了高质量的3D-FRET分布影像。结论提出FRET探针在活体成像应用领域两个关键问题的解决方案,为基因编码FRET探针向活体分子影像领域的推广奠定了重要的技术基础。展开更多
目的构建信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription factor 3,STAT3)二聚化抑制剂筛选模型,为STAT3抑制剂筛选提供实验方法。方法分别构建pECFP-N1-STAT3和pEYFP-N1-STAT3的荧光报告载体,利用脂质体...目的构建信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription factor 3,STAT3)二聚化抑制剂筛选模型,为STAT3抑制剂筛选提供实验方法。方法分别构建pECFP-N1-STAT3和pEYFP-N1-STAT3的荧光报告载体,利用脂质体转染技术将二者共转入HEK-293T细胞,利用ECFP和EYFP 2种荧光蛋白之间能量共振转移,检测磷酸化STAT3分子的二聚化水平,并检测Stattic对二聚化的影响。结果成功构建了pECFP-N1-STAT3和pEYFP-N1-STAT3的荧光报告载体。将2种荧光报告载体共转染HEK-293T细胞后,Western Blot检测结果显示STAT3以及p-STAT3的表达水平明显增加。以458nm波长激发ECFP,其发射波长可激发EYFP。加入STAT3二聚化抑制剂Stattic后,荧光强度降低,且呈现一定的剂量依赖性。结论基于荧光共振能量转移技术的STAT3二聚化抑制剂筛选模型构建成功。展开更多
文摘荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)技术被广泛应用于活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用的实时研究.针对光谱串扰和供体受体间的浓度比等困扰FRET效率定量检测的两大难题,已经发展了多种定量检测FRET效率的方法.作者结合自己的研究结果介绍了多种FRET效率定量检测技术在细胞信号转导机制研究中的应用.
文摘目的构建信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription factor 3,STAT3)二聚化抑制剂筛选模型,为STAT3抑制剂筛选提供实验方法。方法分别构建pECFP-N1-STAT3和pEYFP-N1-STAT3的荧光报告载体,利用脂质体转染技术将二者共转入HEK-293T细胞,利用ECFP和EYFP 2种荧光蛋白之间能量共振转移,检测磷酸化STAT3分子的二聚化水平,并检测Stattic对二聚化的影响。结果成功构建了pECFP-N1-STAT3和pEYFP-N1-STAT3的荧光报告载体。将2种荧光报告载体共转染HEK-293T细胞后,Western Blot检测结果显示STAT3以及p-STAT3的表达水平明显增加。以458nm波长激发ECFP,其发射波长可激发EYFP。加入STAT3二聚化抑制剂Stattic后,荧光强度降低,且呈现一定的剂量依赖性。结论基于荧光共振能量转移技术的STAT3二聚化抑制剂筛选模型构建成功。