利用Hoechst 33342-PI荧光双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌生物活性的影响

本试验以茄病镰刀菌(Fusarium solani)为研究对象,探索了Hoechst 33342及PI荧光染剂对病菌不同活性孢子的色泽差异,明确了病原菌经Hoechst 33342染色后的活孢子发蓝色荧光,最佳染色浓度和时间为1μg/mL、20 min;碘化丙啶(PI)染色后的死孢子发红色荧光,最佳染色浓度和时间为3μg/mL、10 min。并由此建立了Hoechst 33342-PI荧光双染技术,应用该技术可快速、清晰地甄别出不同浓度氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活性和萌发的影响,结果表明,氰氨化钙对茄病镰刀菌的灭杀效果随着浓度增高而增强,且与处理时间呈正相关。2000 mg/L氰氨化钙处理3 h,孢子致死率高达83.97%;500~1000 mg/L处理3 h,孢子致死率为7.15%~26.80%,孢子萌发率为2.40%~3.59%,处理48 h时,孢子致死率达92.07%~100%。250 mg/L氰氨化钙对茄病镰刀菌的致死效果微弱或没有影响。本研究通过菌丝速率法和生物量法进一步验证了应用Hoechst 33342-PI荧光双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活力的影响是可行的。这为突破植物病原微生物药剂室内常规筛选方法提供了新的思路和技术手段。

大鼠脑组织冰冻切片BrdU/DCX免疫荧光双染优化条件探讨

目的:探讨在脑组织冰冻切片上进行溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和双皮质素(DCX)免疫荧光双染的方法,并在此基础上进一步优化。方法:选取雄性SD大鼠脑组织的冰冻切片,通过漂片法,利用大鼠抗BrdU抗体和兔抗DCX抗体两种不同种属来源的一抗在混合孵育和分开孵育的条件下分别进行免疫荧光双染,采集图像并观察实验结果。结果:混合孵育法BrdU阳性标记定位准确,但与之双标的DCX未能正常显色;先孵育抗BrdU抗体后孵育抗DCX抗体:BrdU阳性标记定位准确,但与之双标的DCX仍未能正常显色;先孵育抗DCX抗体后孵育抗BrdU抗体:BrdU和DCX均可正常显色,DCX荧光亮度偏暗,在此基础上提高抗DCX抗体的比例,荧光亮度适中,效果较理想。结论:结果表明,抗BrdU抗体和抗DCX抗体混合孵育后,DCX未能正常显色,可能与两种一抗产生拮抗有关,先孵育抗DCX抗体后孵育抗BrdU抗体是BrdU/DCX荧光双染一种较理想的方法。

荧光染料双染法观察汉防己对胸腺细胞的作用

目的观察防己(Radix Stephaniae Tetrandrae)对小鼠胸腺细胞增殖的影响。方法取昆明种小鼠的胸腺细胞,分为对照组和药物组,药物组用100μg/ml汉防己煎剂对胸腺细胞分别作用1h、6h、12h、24h后,采用DNA荧光染料双染法观察胸腺细胞增殖的影响。结果实验组可见典型凋亡细胞,对照组细胞大小比较均一,无明显形态学变化。随着药物作用时间的延长,凋亡小体的比例显著增加。结论防己可以诱导小鼠胸腺的细胞的凋亡。

荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法检测CAR-T细胞杀伤的方法学研究

目的:比较荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法两种杀伤实验方法在嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor-T,CAR-T)细胞针对不同性质靶细胞开展杀伤实验时的适用性。方法:针对两种不同性质的靶细胞(悬浮细胞和贴壁细胞),采用荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法开展CAR-T细胞的杀伤实验,比较实验结果的精确性和趋势的一致性。结果:荧光染料双染流式法在靶细胞为悬浮细胞的杀伤实验中能检测到具有统计意义的显著杀伤(P<0.01),但在靶细胞为贴壁细胞的实验中差异不显著;萤火虫荧光素酶法在悬浮和贴壁两种靶细胞的杀伤实验中都能检测到显著的杀伤(P<0.01)。结论:荧光染料双染流式法更适合靶细胞为悬浮细胞的杀伤实验,而萤火虫荧光素酶法对悬浮细胞和贴壁细胞都适合,因此在具体应用过程中应注意区别对待。

c-Kit和n-NOS2双重染色在豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的表达

提要:目的研究c-Kit与n-NOS2在豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的共表达情况。方法采用培养成年豚鼠膀胱Cajal样间质细胞,c-Kit免疫荧光和n-NOS2免疫荧光双重染色。结果豚鼠膀胱内Cajal样间质细胞体为梭形或卵圆形,常见2～3个细长的突起。c-Kit和n-NOS2免疫荧光双重染色发现两种抗体在Cajal样间质细胞共表达。结论本研究结果提示在豚鼠膀胱Cajal样间质细胞内c-Kit和n-NOS2共存,Cajal样间质细胞具备产生NO的功能,Cajal样间质细胞存在调节膀胱自律活动的结构基础。

CD151和c-Met在大肠癌中的表达及临床意义

目的探讨CD151和c-Met在大肠腺癌组织中的表达及其与临床各个病理因素之间的关系。方法应用双重免疫荧光标记法对正常大肠黏膜和大肠腺癌组织各120例进行CD151和c-Met检测,及进行Kaplan-Meier生存分析。采用Spearman等级相关分析CD151和c-Met之间的相关性。结果 CD151大肠正常黏膜和腺癌组织的阳性率分别为21.7%(26/120)、72%(86/120),两者比较具有统计学意义(P<0.001)。c-Met大肠正常黏膜和腺癌组织的阳性率分别为17.5%(21/120)、60%(72/120),腺癌组织与正常黏膜比较具有统计学意义(P<0.001)。在大肠腺癌中,CD151和c-Met的表达与患者年龄、性别和肿瘤的部位、大小无相关性,与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及Duke分期有关(P<0.05)。CD151和c-Met在大肠正常黏膜和腺癌组织中的表达经双变量相关分析,Spearman系数r=0.970,表达呈正相关(P<0.001)。CD151+、α3β1+、CD151+α3β1+与大肠癌患者5年生存期密切相关,是影响大肠癌预后的因素(P<0.01、P<0.05、P<0.0001)。结论 CD151和c-Met在大肠癌的表达密切相关。CD151与c-Met联合表达是大肠癌临床预后判断的可靠指标。

人参皂苷Rg1通过自噬抑制Raw 264.7巨噬细胞凋亡

目的探讨人参皂苷Rg1在血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬和凋亡中的作用及其机制。方法体外培养小鼠Raw 264.7巨噬细胞随机分为空白对照组、不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+不同时间(24、36和48h)血清剥夺处理组;依据最佳血清剥夺时间进一步分为空白对照组、血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)+3-甲基腺嘌呤(3-MA)(5mmol/L,1h)处理组。采用Western blotting检测LC3、Atg 5、Beclin 1、cleaved Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平的表达变化;采用免疫荧光双标记检测细胞内LC3蛋白水平表达的变化;采用Hoechst 33342/PI荧光双染检测细胞凋亡的变化。结果不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺诱导Raw264.7巨噬细胞凋亡;与血清剥夺处理组相比,人参皂苷Rg1处理组LC3、Atg 5及Beclin 1蛋白表达水平显著上调;加入3-MA抑制剂后,凋亡细胞较人参皂苷Rg1处理组明显增多,且Bcl-2蛋白表达水平明显下调的同时,cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达水平则显著上调。结论人参皂苷Rg1通过促进血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬,发挥抗凋亡的保护作用。

小胶质细胞α7-nAChR表达及意义

目的观察巨噬细胞烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChRR)在体外培养的小胶质细胞中的表达,为进一步研究其作用提供理论依据。方法采用RT-PCR及细胞免疫荧光双标法,用针对α7-nAChRR特异性的引物进行PCR,分析α7-nAChRR在小胶质细胞中的表达。结果可扩增出450 bp目的条带;细胞免疫荧光双标分析显示,小胶质细胞抗CD11b/c和抗α7-nAChRR染色均呈阳性。结论α7-nAChRR在体外小胶质细胞中能正常表达;此可能是小胶质细胞发挥作用的分子学基础。

CD133、CD68和PD-L1在不同病理级别脑胶质瘤组织中的表达及相关性

目的探讨人脑胶质瘤组织中胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)标志物CD133、肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociated macrophages,TAMs)标志物CD68和负性共刺激分子PD-L1在不同病理级别人脑胶质瘤组织中的表达及其相关性。方法采用免疫荧光双染法检测不同病理级别脑胶质瘤组织中CD68和PD-L1蛋白的共表达情况;采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time fluorescent PCR,q RT-PCR)技术检测30例低级别脑胶质瘤(Ⅰ级和Ⅱ级)组织和30例高级别脑胶质瘤(Ⅲ级和Ⅳ级)组织中CD133、CD68和PD-L1 m RNA的表达,并分析其与临床病理级别之间的相关性。结果脑胶质瘤组织中PD-L1和CD68共表达在肿瘤相关巨噬细胞上,即大部分PD-L1阳性细胞为肿瘤相关巨噬细胞,高级别组CD68和PD-L1蛋白的共表达明显高于低级别组。在脑胶质瘤组织中,CD133、CD68和PD-L1 m RNA的表达水平均与病理分级呈正相关(r=0.647,P<0.001;r=0.499,P<0.001;r=0.445,P=0.001);三者在高级别脑胶质瘤组织中的表达均高于低级别脑胶质瘤组织(P<0.05);脑胶质瘤组织中CD133与CD68 m RNA的表达呈正相关(r=0.525,P<0.001),低级别组和高级别组中两者表达亦呈正相关(r=0.518,P=0.005;r=0.500,P=0.007);脑胶质瘤组织中CD133与PD-L1m RNA表达呈正相关(r=0.431,P<0.001),低级别组和高级别组两者表达亦呈正相关(r=0.398,P=0.036;r=0.417,P=0.027)。结论脑胶质瘤组织中PD-L1主要由肿瘤微环境中的TAMs表达;CD133、CD68和PD-L1表达与脑胶质瘤的恶性程度密切相关。

原位定量评价组织工程研究中细胞生长状态的新方法

目的探讨一种能原位定量评定细胞在高分子聚合物载体上生长情况的方法。方法采用CFDA-AM和PI双染结合激光扫描共聚焦显微镜技术,用平均荧光强度代表细胞数量,对组织工程骺软骨中骨骺软骨细胞在聚乳酸载体上1、2及3周时的死活细胞数量进行评价。结果骨骺软骨细胞在聚乳酸载体上的530nm的平均荧光强度随时间逐渐增加,而603nm的荧光强度在第2周时有所增加,而到第3周时则无明显增加。与细胞在载体上重量增加的结果一致。结论首次采用的原位定量检测载体上死活细胞的方法是可行的,解决了在不透明载体上即不影响细胞和载体结构,而可以原位快速定量评定细胞生长的难题。

大鼠全脑缺血后各脑区p38α MAPK的表达

【目的】探讨全脑缺血性损伤后p38α MAPK和GFAP在不同脑区以及各时相的表达特点及其相互关系。【方法】复制四血管脑缺血模型,取缺血10、20、30 min再灌注6、24、72、96 h的脑切片行甲苯胺蓝染色,p38α MAPK、GFAP免疫组化染色并作平均光密度(IOD)分析,p38α MAPK、GFAP荧光双染。【结果】随着缺血、缺血再灌注时间的延长,p38α MAPK主要表达在海马、皮质、尾状核,平均光密度在缺血10 min、20 min,再灌注6h时与假手术组无差异,后随缺血、再灌注时间增长逐渐加强至72 h后下降;双染结果显示部分细胞GFAP、p38α MAPK共表达。【结论】p38αMAPK和GFAP参与早期脑缺血再灌注时神经元的损伤,p38α MAPK与脑缺血后星形胶质细胞活化有关。

P物质在溃疡性结肠炎发病中作用的实验研究

目的对P物质在溃疡性结肠炎发病中的作用进行分析探讨,为今后的研究工作提供可靠的参考依据。方法 经DNCB涂腹建立大鼠溃疡性结肠炎模型,将P物质注入到大鼠脊髓。结果 P物质可诱发结肠炎,经P物质拮抗剂与白头翁汤处理后可以使P物质致结肠炎的作用得以减轻。结论 P物质在溃疡性结肠炎发病中具有显著作用。

TSP-1及其受体CD47在肾缺血再灌注损伤大鼠模型中的作用及机制初步探讨

目的构建肾缺血再灌注损伤(IRI)大鼠模型,观察血小板反应蛋白-1(TSP-1)及其受体CD47在肾脏的分布及变化,并探讨其在肾IRI发病机制中的作用。方法成年雄性SD大鼠42只,随机分为正常对照组(n=5)、假手术组(n=5)和模型组(n=32),模型组下设IRI后1小时、6小时、12小时、24小时4个时间点(4个小组),每个时间点各8只大鼠。通过阻断肾血流45分钟后再灌注构建肾IRI大鼠模型。观察肾IRI后各组大鼠尿量变化,采用全自动生化分析仪检测各组大鼠的肾功能,通过HE染色了解肾脏病理损害,采用酶联免疫吸附法测定肾组织中羟自由基和丙二醛的浓度。通过肾组织免疫组化及免疫荧光双染,观察TSP-1和CD47蛋白在肾脏中的表达。结果与正常对照组和假手术组相比,模型组大鼠尿量明显减少,血肌酐和尿素氮水平明显升高,差异具有显著性;随着缺血再灌注后时间的延长,肾小管出现不同程度的扩张、变性与坏死。肾间质出现炎性细胞浸润、充血水肿等变化。模型组大鼠肾小管HE染色病理损伤评分较正常组升高,差异具有显著性;IRI肾组织中的羟自由基和丙二醛水平呈逐渐升高趋势。在肾IRI早期,肾小管TSP-1、CD47表达水平即明显增加,至肾IRI 24小时时TSP-1、CD47在残存肾小管中仍有较高表达。通过免疫荧光双染发现,在肾IRI肾小管TSP-1和CD47存在共表达。相关性分析发现羟自由基和丙二醛的浓度与TSP-1及CD47积分光密度呈正相关。结论肾IRI时大鼠肾脏TSP-1和CD47表达水平明显升高,与氧化应激反应密切相关。TSP-1及其受体CD47共同参与了肾IRI过程。

血管内皮生长因子和血小板凝集素-1在膀胱癌中的表达

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)与血小板凝集素-1(TSP-1)在不同分级的膀胱肿瘤中的表达.方法 2000年4月～2003年9月的70例膀胱肿瘤患者切除标本,其中G1期28例、G2期27例、G3期15例(采用WHO病理分级),采用免疫组化法对标本进行染色,VEGF和TSP-1的表达均采用平均血管密度(MVD)表示,SPSS 10.0软件进行统计学分析,然后采用免疫荧光双染判断共表达,用激光扫描共聚焦显微镜观察.结果 VEGF表达的MVD值与肿瘤分级呈正相关;G1与G2期有非常显著性差异( P＜0.01),G2期与G3无显著性差异( P＞0.1);TSP-1表达的MVD值随着肿瘤分级增加而降低,但无相关关系,但G1期与G2、G3期有非常显著性差异( P＜0.01),G2期与G3无显著性差异( P＞0.1);在G1期,TSP-1的表达与VEGF的表达无相关关系( rs=0.167, P＞0.1);激光扫描荧光双染显示,VEGF与TSP-1可以同时表达.结论 VEGF的表达随膀胱肿瘤分级增加而增强;VEGF是促进肿瘤形成的因素;TSP-1是抑制肿瘤血管形成的因素,但其抑制作用仅发生在初期;荧光双染仅可提供共同表达的证据,不能判断表达的高低.