荧光定量反转录PCR检测新生儿脐血ζ珠蛋白mRNA的转录水平

目的运用荧光定量反转录PCR技术,检测新生儿脐血ζ珠蛋白mRNA的转录水平。方法以基因型为(αα/αα)的新生儿作为正常对照组,基因型为(--/αα)的新生儿为病例组。选择β肌动蛋白基因为校正基因,ζ珠蛋白基因为目的基因。运用双标准曲线法检测两组新生儿脐血的ζ珠蛋白mRNA的转录水平。结果病例组的ζ珠蛋白mRNA的平均转录水平明显增高。结论通过荧光定量反转录PCR技术能够检测出基因型为(--SEA/αα)的新生儿的ζ珠蛋白mRNA转录水平的增高,具有较好的诊断价值。

荧光定量反转录-聚合酶链反应检测鼻咽癌患者外周血肿瘤细胞微转移的研究

目的探讨荧光定量反转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测外周血CK14mRNA、表皮生长因子受体(EGFR)mRNA的表达在鼻咽癌患者外周血肿瘤细胞微转移诊断中的价值。方法采用FQ-RT-PCR方法检测87例入组鼻咽癌患者外周血CK14mRNA、EGFRmRNA的表达,并分析其与肿瘤TNM分期、临床分期、组织分化程度的关系。结果 87例鼻咽癌患者外周血中,CK14mRNA、EGFRmRNA阳性表达率分别为64.4%(56/87)、58.6%(51/87),两者联合检测的阳性表达率为71.3%(62/87);CK14mRNA、EGFRmRNA的表达水平与T分期、N分期、临床分期、组织分化程度有关(P<0.05),分期越晚,外周血中CK14mRNA、EGFRmRNA的表达水平越高,低分化鳞癌患者外周血中CK14mRNA、EGFRmRNA的表达水平高于高中分化鳞癌患者。结论 FQ-RT-PCR方法检测鼻咽癌患者外周血CK14mRNA、EGFRmRNA的表达,能够较准确反映外周血肿瘤细胞微转移的情况,在诊断鼻咽癌患者外周血肿瘤细胞微转移方面有一定的可行性;鼻咽癌患者外周血肿瘤细胞微转移与肿瘤的恶性程度和病情进展有关。

一步法流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量反转录聚合酶链反应方法的建立及应用

目的建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎（乙脑）病毒的荧光定量RT-PCR方法。方法根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列，应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针，对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化，验证方法的特异性、敏感性和重复性。并通过对蚊虫样本的检测，以评价该方法的实际应用价值。结果优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0．1gmol／L探针浓度，0．2gmol／L引物浓度，5mmol／L Mg^2＋浓度。结果表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性，对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒（SEO型与HTN型）均无交叉反应，检测的灵敏度达0．1TCID50，重复性分析表明同一样品Ct值的重复检测4次，其标准差均在合理范围内，分别为0．033、0．079、0．149和0．411。对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离检测，结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性，而病毒分离则只检测出3份阳性，表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感，可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右，且操作简便、敏感性高。结论研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点，适用于乙脑病原学的快速检测。

利用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应方法检测血液中伤寒沙门菌

目的建立实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,rRT-PCR)方法检测伤寒沙门菌。方法针对伤寒沙门菌STY1631基因设计特异性引物,通过优化反应条件,建立检测该靶基因的rRT-PCR方法,利用51个血清型的纯培养伤寒和非伤寒沙门菌菌株、常见非沙门致腹泻病原菌以及发热为主要症状的8种常见病原菌核糖核酸(RNA)评价该方法的特异性及敏感性,同时对伤寒沙门菌全血模拟标本进行敏感性检测。结果利用该方法检测48株伤寒沙门菌均阳性,其余33种非伤寒沙门菌血清型、致腹泻的其他5种肠道致病菌以及发热为主要症状的8种常见非沙门菌也均扩增阴性。在对纯菌总RNA检测中,rRT-PCR的最低检测限为1 pg/反应,即194个拷贝/反应。以全血模拟样品提取核酸为模板的检测中,敏感性达1×102cfu/ml。结论建立了敏感性高、特异性好的rRT-PCR检测血液中伤寒沙门菌的方法,为伤寒沙门菌感染的快速诊断及不明原因发热症状的病原初步鉴别提供了简便的手段,可用于对伤寒的早期诊断、预防控制及临床治疗。

直接免疫荧光与实时荧光定量反转录PCR检测常见呼吸道病毒抗原比较

目的观察病毒抗原直接免疫荧光检测(direct fluorescence assay,DFA)和实时荧光定量反转录PCR(real-time reverse-transcription PCR,rt-RT-PCR)检测住院儿童鼻咽分泌物呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)和流感病毒(influenza virus,FLU)的一致性。方法应用DFA、rt-RT-PCR方法检测92例呼吸科住院患儿鼻咽分泌物RSV,应用DFA、rt-RT-PCR方法检测162例呼吸科住院患儿鼻咽分泌物FLU-A和FLU-B,比较2种方法检测的阳性率,Kappa检验分析2种检测方法的一致性。结果 DFA检测RSV的阳性率56.5%低于rt-RT-PCR检测RSV的阳性率70.7%(P<0.05),一致性良好(Kappa=0.517);DFA检测FLU-A、FLU-B的阳性率分别为3.7%和7.4%,rtRT-PCR检测FLU-A、FLU-B的阳性率分别为8.0%和15.4%,2种方法检测FLU-A阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05),一致性较差(Kappa=0.168),检测FLU-B阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05),一致性良好(Kappa=0.489)。结论 rt-RT-PCR检测呼吸道病毒的阳性率明显高于DFA,但2种方法的一致性良好,DFA因设备简单适合用于呼吸道病毒的早期诊断。

基于单基因的实时荧光定量反转录-聚合酶链反应定性检测猪霍乱沙门菌

目的建立基于单基因的猪霍乱沙门菌的实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)检测方法。方法通过对猪霍乱沙门菌基因组及其他血清型沙门菌基因组、人类基因组的生物信息学比对及普通PCR检测分析,获得猪霍乱沙门菌特有而其他细菌及人类基因组中不存在的特异基因SC1242,针对该基因设计特异性引物,通过优化反应条件,建立检测该靶基因的rRT-PCR方法,利用123株多种血清型沙门菌及非沙门菌菌株RNA评价该方法的特异性及敏感性。同时对猪霍乱沙门菌全血模拟标本进行敏感性检测。结果利用该方法检测20株猪霍乱沙门菌均为阳性,其余菌株均扩增阴性。对纯菌RNA检测中,rRT-PCR的最低检测限度为50 fg/反应,约为96个拷贝/反应。在以全血模拟样品提取核酸为模板的检测中,敏感性达90 cfu/ml。结论 rRT-PCR方法检测猪霍乱沙门菌特异性好、灵敏度高,对猪霍乱沙门菌的早期诊断具有潜在应用价值。

实时荧光定量反转录多聚酶链反应技术检测TEL-AML1融合基因阳性急性淋巴细胞白血病

目的建立实时荧光定量反转录(qRT)-PCR方法检测小儿急性淋巴细胞白血病TEL-AML1融合基因的表达水平,探讨其临床意义。方法采用TaqMan探针qRT-PCR技术,2-△△ct相对定量法动态检测20例TEL-AML1融合基因阳性急性淋巴细胞白血病患儿初诊期(20例)、缓解期(20例)、复发期(2例),及15例骨髓形态学正常的非肿瘤非血液病儿童作为对照组的TEL-AML1融合基因表达水平。结果初诊期、缓解期、复发期及对照组的TEL-AML1中位数表达水平分别为0.62、0.31、0.76、0.23,初诊期和复发期基因表达水平均显著高于缓解期及对照组(Pa<0.05),初诊期和复发期的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。诱导缓解第33天TEL-AML1水平高表达(>对照组的P75)患儿的复发率、无病生存率期间显著高于和低于低表达患儿(Pa<0.05)。20例患儿首次诱导治疗第33天骨髓均达完全缓解,高表达8例均在强化治疗、维持治疗后TEL-AML1水平下降,但其中1例患儿在维持治疗期间TEL-AML1水平又异常升高后复发,另1例患儿在停药后2个月TEL-AML1水平再上升后复发。诱导缓解第33天qRT-PCR检测8例微小残留病阳性,骨髓形态学、染色体核型分析均阴性,实时反转录-PCR检测5例阳性。结论 qRT-PCR是一种快速、灵敏度高、特异性好的方法,诱导缓解第33天TEL-AML1融合基因水平可用于早期判断预后,TEL-AML1水平的变化可用于监测微小残留病、预测复发,指导个体化治疗。

应用双重实时荧光定量反转录-聚合酶链反应方法同时检测A组轮状病毒和星状病毒

目的建立能同时检测轮状病毒A群和星状病毒双重实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)方法。方法根据上述2种病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析多重rRT-PCR的重复性、特异性、敏感性;以所建立方法对128例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果所建立的双重rRT-PCR检测方法对轮状病毒A群和星状病毒具有很好的特异性和重复性,轮状病毒A群灵敏度达到每个反应101拷贝,星状病毒灵敏度达到每个反应102拷贝。128例粪便标本中,轮状病毒A群和星状病毒的检出率分别为18.0%和3.1%。通过基因测序比对结果相符。结论构建可用于轮状病毒A群及星状病毒的双重rRT-PCR方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。

新城疫强毒特异性反转录荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种敏感性高、特异性强、成本更低的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)特异性反转录荧光定量PCR(reverse transcription fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测方法,基于对所有已知NDVF基因序列特征的分析,设计了一对强毒特异性引物,以体外转录制备的RNA标准品为阳性模板,构建了标准曲线,并对该方法的敏感性、特异性和准确性进行了验证。结果表明,基于SYBRGreenⅠ嵌合荧光技术建立的检测方法能够特异性扩增NDV强毒,最低可检测1拷贝/μL的RNA,用于临床毒株的检测结果与序列测定一致,可作为适合大规模监测NDV强毒的方法和工具。

反转录荧光定量聚合酶链反应联合检测hMAM和BCL-2在乳腺癌诊断中的应用

目的研究反转录荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(BCL-2)和乳腺癌人乳腺珠蛋白(hMAM)基因在外周血循环肿瘤细胞(CTCs)中的表达水平,探讨BCL-2和hMAM 2种乳腺癌相关基因联合检测在乳腺癌诊断中的临床应用价值。方法采用RT-qPCR法,并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内对照检测健康对照组(55例)、乳腺癌组(171例)和良性乳腺疾病组(91例)外周血CTCs中BCL-2和hMAM的表达水平。结果外周血CTCs中BCL-2和hMAM在健康对照组和良性乳腺疾病组表达水平差异无统计学意义(P>0.05),乳腺癌组表达水平高于健康对照组、良性乳腺疾病组,差异有统计学意义(P<0.05)。hMAM和BCL-2联合检测灵敏度显著高于单一基因。结论联合检测外周血CTCs中hMAM和BCL-2基因表达水平可提高乳腺癌诊断的灵敏度,有效辅助临床诊断乳腺癌。

樱桃病毒A实时荧光定量PCR检测技术的建立与应用

在樱桃病毒A(CVA)mp基因保守区域设计了3对检测引物,经特异性筛选后,获得可用于病毒定量研究的引物。制备质粒标准品,建立标准曲线,同时验证该方法的灵敏度和特异性,并应用于田间果树样品CVA定量检测。最终成功筛选出1对检测效率高、特异性强的引物(CVA-dF2、CVA-dR2),基于SYBR Green I荧光染料建立反转录实时荧光定量PCR检测CVA的方法。该方法重复性好、灵敏度高,无需借助内参基因即可准确检测目的病毒载量,绝对定量标准曲线斜率为-3.5746,决定系数R2为0.9986,扩增效率为0.9044,比常规RT-PCR检测灵敏度高10倍。该方法的建立为CVA定量研究提供了有力工具,可用于果树中CVA批量检测或低丰度病毒样品检测。

实时荧光定量PCR检测结直肠腺癌患者组织中广泛型线粒体肌酸激酶基因的表达

目的建立检测人广泛型线粒体肌酸激酶（ubiquitous mitochondrial creatine kinase，uMtCk）mRNA荧光定量的方法，并检测了结直肠腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织中uMtCk基因表达的水平。方法基于TaqMan荧光探针技术，以GAPDH作为内参，建立实时荧光定量RT-PCR方法，并检测了30名结直肠腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织uMtCk mRNA的表达。结果30倒结直肠肿瘤患者肿瘤组织中有uMtCk mRNA的表达，范围为7.4×10^5－5.3×10^8拷见／μg RNA，均值为（9.4±5.7）×10^6拷贝／μg RNA；30例癌旁组织uMtCk表达为4.5×10^3－6.9×10^5拷贝／μg RNA，均值为（8.6±3.4）×10^4拷贝／μg RNA。结论成功地建立了人uMtCk基因表达含量的荧光定量检测方法，检测结果可用绝对拷贝数表示，定量准确可靠。且结直肠腺癌病人肿瘤组织uMtCk mRNA的含量是升高的，提示uMtCk mRNA含量的检测有助于结直肠腺癌病人临床诊断。

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测肾移植患者CsA效用

目的:检测肾移植患者外周血淋巴细胞(PBL)有关细胞因子基因表达,判定环孢素A(CsA)效用,进一步验证CsA服用后2h浓度(C2)测定的必要性。方法:采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR对20例肾移植患者术后第7天PBL的IL-2和IFN-γmRNA表达进行检测,判定CsA的免疫抑制效用,对比CsA空腹浓度(C0)和C2与细胞因子抑制关系。结果:C2对应IL-2和IFN-γmRNA/β-actin mRNA相对模板数分别为0.038±0.006和0.018±0.004,C2对IL-2和IFN-γmRNA表达抑制率分别为(72.42±3.95)%和(69.52±6.97)%;C2与IL-2和IFN-γmRNA表达的抑制率有良好的线性关系(P<0.01);C0与IL-2和IFN-γmRNA表达的抑制率无良好的线性关系(P(0.05)。结论:SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术检测肾移植患者术后PBL的IL-2和IFN-γmRNA的表达,是判定CsA效用和研究免疫耐受的有效方法;C2仍为判定CsA生物利用度的重要指标。

荧光定量RT-PCR技术检测健康人外周血γδT细胞细胞受体分子Vδ1～8亚群分布

目的：检测和分析健康成人外周血中γδT细胞的T细胞受体（ TCR）分子Vδ1~8亚群分布情况。方法：采集16名健康成人外周血，荧光定量反转录聚合酶链式反应检测其γδT细胞TCR分子Vδ1~8亚群的基因相对表达量，计算各亚群所占百分比。结果：健康成人外周血γδT细胞TCR分子Vδ1~8亚群的比例分别为：Vδ1（7.19±0.33）%、Vδ2（54.27±7.9）%、Vδ3（20.23±0.03）%、Vδ4（3.80±0.02）%、Vδ5（2.08±0.02）%、Vδ6（0.81±0.25）%、Vδ7（7.21±0.02）%、Vδ8（4.41±0.04）%。 Vδ2亚群均明显高于其他亚群（P〈0.01）。结论：我国健康成年人外周血γδT细胞TCR分子Vδ1~8亚群分布由多到少依次为Vδ2〉Vδ3〉Vδ1〉Vδ8〉Vδ7〉Vδ4〉Vδ5〉Vδ6。

阿龙山病毒及松岭病毒多重实时荧光定量RT-PCR快速检测方法的建立

目的 建立一种多重实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(多重实时qRT-PCR)法,用于阿龙山病毒(Alongshan virus,ALSV)及松岭病毒(Songling virus,SGLV)核酸的快速检测。方法 针对ALSV NS 3基因和SGLV S基因保守区设计特异性引物及TaqMan探针,建立针对2种病毒的多重实时qRT-PCR检测方法,评价方法的特异性、灵敏度和重复性,并应用蜱标本对该方法进行应用评价。结果 该检测方法与森林脑炎病毒等其他6种虫媒病毒无交叉反应,灵敏度达1×101拷贝/μl,重复性检测的循环阈值(Ct)变异系数均<2.00%;运用该方法,从2019年黑龙江省采集的30组蜱标本中检出2组ALSV阳性,1组SGLV阳性。经验证,该方法与普通PCR方法检测结果的一致性为100%。结论 建立了敏感性高、特异性好的ALSV和SGLV多重实时qRT-PCR快速检测方法。

肉鸡心脏热应激损伤和热休克蛋白mRNA转录水平的相关性

通过分光光度计、组织病理学和荧光定量反转录PCR检测技术,研究肉鸡心脏热应激损伤和热休克蛋白mRNA变化的相关性。试验结果显示,热应激过程中肌酸激酶和谷丙转氨酶的活性呈现波动性变化,肌酸激酶的变化更明显;心脏的组织病理学变化主要表现为心肌纤维变性和坏死;热应激过程中HSC70mRNA也呈现波动性变化,而HSP70mRNA水平呈现上升趋势。结果提示,HSC70mRNA与肌酸激酶活性变化呈现一定负相关,HSC70有可能作为心脏热应激损伤的标志物。

SYBR GreenⅠ定量RT-PCR快速检测H5亚型禽流感病毒方法的建立

针对H5亚型禽流感H基因保守序列设计引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测模式的荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR,RRT-PCR),最低检测限为2.1×102拷贝质粒DNA,扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm=(79.5±0.3)℃,对H5N1亚型和H5N2亚型禽流感病毒灭活抗原均有阳性扩增,对H7、H9亚型禽流感病毒、健康鸡、鸭组织及其它家禽常见病原RNA无扩增,可重复性好,批内变异系数及批间变异系数分别为2.99%和5.12%;检测速度快,从样本处理到报告结果仅需5h。

GSTP1基因在急性低压低氧大鼠模型肺组织中的定量检测

通过模拟低压低氧(7000±50 m)考察谷胱苷肽转移酶p1基因(G lu tath ione S-transferase p1,G STP 1)对低压低氧的敏感性,以探讨G STP 1在机体适应急性低压低氧环境中的分子机制。30只雄性SD大鼠随机分为5组:0、1、3、5、7 d组,每天在模拟7000±50 m高度的低压低氧舱内暴露12 h,连续暴露6 h后,休息1 h,再继续暴露6h。采用荧光定量-反转录-聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)技术对急性低压低氧大鼠模型肺组织中G STP 1基因表达进行定量分析,同时用分光光度法测定了肺组织中谷胱苷肽转移酶(g lu tath ione S-transferases,G ST s)的活性和丙二醛(M a le ic d ia ldehyde,M DA)的变化。结果显示,与未暴露组相比,G STP 1基因从第1 d到第7 d的表达有显著性差异(P<0.05);G ST s活性从第1 d到第7 d呈下降趋势,M DA呈上升趋势,与未暴露组相比,均有显著性差异(P<0.05)。结果表明:G STP 1基因对低压低氧敏感,并可考虑作为机体适应特殊环境进行基因选材的一个新指标。

持家基因作为相对定量内标物的稳定性比较

定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术,定量检测时常用编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶、β-肌动蛋白、28S和18SrRNA等的持家基因作为内部参照,这些基因被认为在某些类型细胞中的表达是恒定的。近年来,很多研究者发现上述持家基因的表达水平并不稳定,利用它们作为内标来定量并不准确。因此,在进行定量实验时应选择适当的2种或2种以上的内参基因,以减少检测标本间的差异。

TaqMan实时荧光RT-PCR快速检测H5亚型禽流感病毒

根据GenBank中100个H5亚型禽流感病毒分离株的HA基因核苷酸保守序列设计引物和TaqMan探针，对荧光定量RT—PCR反应体系和条件进行优化，并对该方法进行评价。结果表明：该方法对H5N1亚型和H5N2亚型禽流感病毒灭活抗原均有阳性扩增，对H7、H9亚型禽流感病毒、健康鸡、鸭组织及其他家禽常见病原RNA无扩增；敏感度高，最低检测限为21个拷贝质粒DNA；可重复性好，批内变异系数及批间变异系数分别为2．01％和4．93％；检测速度快，从样本处理到报告结果仅需4h。