转基因烟草荧光定量检测方法研究

依据实时定量PCR原理,参照35S启动子、NOS终止子、GUS基因和NPTII基因序列设计TaqMan引物和荧光标记探针。采用美国MJ公司OpticonTM2荧光定量PCR检测系统对烤后烟叶进行转基因定量检测技术研究,从中筛选出扩增效率高,灵敏度好的PCR引物和探针序列,同时通过对扩增体系,扩增条件的梯度实验,优化出荧光定量检测的最佳反应体系和反应条件,从而建立了转基因烟草定量检测方法。该方法经验证其检测灵敏度达到0.05％。在2003年6月参加CORESTA(国际烟草科研与合作中心)组织的国际烟草转基因定量检测合作试验中,该优化转基因烟草定量检测技术获得了较好成绩,对盲检样品检测结果评价(Z-score)列国际12家实验室之首,证明此法灵敏度高、稳定性好。

猪代尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其S基因分子特征分析

猪代尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCo V)是一个新发现的致病性猪肠道冠状病毒,目前在中国部分省份养殖场的腹泻病猪中已检测到,并已证实在中国流行。本研究旨在探明PDCo V在浙江省的流行现状和分子演化特征。结果显示,建立的PDCo V一步法Taq Man探针荧光定量检测方法特异,检测灵敏度可达3.94×10~2拷贝·μL^(-1),扩增效率为108%,R^2值为0.997,标准曲线方程为Y=-3.156X+1.826。2013年4月—2016年12月收集的258份仔猪临床腹泻样本中没有检测到,但在2017年1—4月检测阳性率达到50%(12/24)。获得的7个临床分离株的S基因与参考株相比,其核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.98%~100%和99.99%~100%;与最初在香港分离到的毒株和美国流行株相比,存在3个碱基缺失和一定数量的突变。以S蛋白进行分子演化分析,发现7株临床分离株均在代尔塔冠状病毒属进化分支上,且与中国分离到的其他PDCo V毒株在进化关系上较近,与美国、泰国等地分离到的PDCo V在进化关系上较远,提示PDCo V的流行株分布有一定的地域性。研究结果提供了浙江省地区PDCo V临床分离株的基因特性,为防控PDCo V引起的仔猪腹泻、加快流行株疫苗的开发提供了数据。

黄瓜花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立检测香蕉中黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的实时荧光定量方法.【方法】根据CMV外壳蛋白(CP)保守序列设计了TaqMan实时荧光定量PCR特异性探针及引物,优化反应体系检测TaqMan探针实时荧光定量方法的灵敏度、特异性和重复性.【结果和结论】该方法检测灵敏度为4.2×102μL-1,比普通PCR高100倍,且与香蕉束顶病毒Banana bunchy top virus(BBTV)、香蕉线条病毒Banana streak virus(BSV)无交叉反应,特异性和重复性都较好.用实时荧光定量PCR检测14份田间香蕉样品有5份样品为阳性,进一步证明建立的实时荧光定量方法可用于香蕉CMV的检测.

实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎标准方法的建立

根据GenBank（登录号：EF417996）中鸭病毒性肠炎病毒U31基因的序列，设计了1对特异性引物及TaqMan探针，扩增片段长度为76bp。以鸭病毒性肠炎弱毒疫苗株DNA为阳性标准品模板，建立了实时荧光定量PCR检测鸭病毒性肠炎病毒的方法。该方法能在鸭病毒性肠炎病毒DNA样本中检出荧光信号，定量范围为：2．1×10^0～2．1×10^0个拷贝数，最小检出量为2．1×10^0个拷贝；用该方法对人工感染试验的4只鸭组织器官、粪便、血液等样品重复测定3次，病毒模板DNA的检出率为100％，对鸭正常组织、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌和鸭病毒性肝炎、鹅源禽流感H5毒株、新城疫、小鹅瘟病毒等DNA检测不出现特异性荧光信号。经过重复性和实际临床样本检验证实，该方法真实可靠，而且从核酸提取到报告检测结果耗时不超过4h，不仅实现了对鸭病毒性肠炎的快速诊断，也实现了对该病毒DNA由定性到定量的检测。

猪伪狂犬病病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究基于猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gE基因设计引物和探针,建立起一种可区分PRV野毒株及基因缺失疫苗株的Taq Man荧光定量检测方法。该方法特异性良好;在9.2×101-9.2×109copieμL-1模板范围内具有良好的线性关系;敏感性是常规PCR方法的100倍;重复性试验变异系数小于1.5%。与常规PCR方法相比,该方法对临床样品的检出率更高。该方法的建立为PRV野毒的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。

肺炎支原体抗体与荧光定量PCR检测法的比较

目的比较肺炎支原体(MP)抗体检测法与荧光定量检测方法(PCR)在肺炎支原体感染中的应用。方法对本院住院部362例下呼吸道感染的患儿的血液标本运用酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行抗体检测(MP-IgM),同时运用PCR方法对其痰液标本进行检测(FQ-MP-DNA)。结果血MP-IgM与痰FQ-MP-DNA两种方法差异无统计学意义(P>0.1),但后者对1岁以下的患者检出率更高(P<0.005)。结论两种检测方法结合可以取长补短,提高支原体感染的检出率。

实时荧光定量PCR快速检测对虾IHHNV载量方法的创建

近年来,因感染虾肝肠胞虫,对虾生长缓慢现象频发。虾肝肠胞虫在宿主肝胰腺小管上皮细胞质内复制,目前主要通过组织学观察及LAMP检测方法诊断。为建立快速定量灵敏的PCR方法,用于对虾传染皮下及IHHIV(传染性皮下及造血组织坏死病毒)早期诊断监测,本文使用生物学软件进行序列化对比,优化实时荧光定量PCR反应条件,提高特异性灵敏度。研究表明,线性范围5×102^(5)×107拷贝/ml,灵敏度超过普通PCR的1/5。

ELISA法和荧光定量PCR法在检测儿童肺炎衣原体感染中的比较

目的比较ELISA法与荧光定量PCR法在检测儿童肺炎衣原体感染中的应用。方法对我院213例呼吸道感染患儿的血液标本运用酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行肺炎衣原体抗体检测(CP-IgM),同时运用荧光定量PCR方法对其深部呼吸道标本进行检测(FQ-CP-DNA)。结果血CP-IgM与深部呼吸道标本CP-DNA两种方法差异无统计学意义(P>0.05),但后者对3～6岁的患者检出率更高(P<0.05)。结论两种检测方法结合可以取长补短,提高衣原体感染的检出率。

兔源强毒力金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、特异性强且敏感性高的兔源强毒力金黄色葡萄球菌检测方法,本试验根据金黄色葡萄球菌pvl基因的保守序列设计了特异性的引物和探针,通过反应条件的优化,建立了检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法耗时短,仅需约50 min就能完成检测,较已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法均省时;该方法特异性强,对兔源低毒力金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌、大肠杆菌和阴性对照(灭菌ddH2O)均无交叉反应;该方法敏感性高,最低检测限为10拷贝/μL,分别是已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的1000倍和10倍。此外,该方法重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。应用该方法检测126份已知结果的临床样品,检测结果与已知结果、已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的检测结果完全一致。该方法的建立不仅丰富了兔源强毒力金黄色葡萄球菌的检测方法,也为该菌的快速检测提供了更有力的技术支持。

牛副流感病毒3型实时荧光定量PCR检测方法的建立及在牛源样本检测中的应用

目的建立用于牛源性样本牛副流感病毒3型(BPIV3)实时荧光定量PCR (Q-PCR)快速检测方法。方法选择已发表的BPIV3 HN基因高度保守区域作为靶基因,设计合成引物和探针,建立BPIV3Q-PCR方法。并对方法的线性、特异性、敏感性、重复性、稳定性等进行方法学评价。同时用建立的Q-PCR方法检测105批次牛源性样本。结果建立的BPIV3Q-PCR方法线性范围为1×101拷贝/μl^1×108拷贝/μl;与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛鼻气管炎病毒(BHV-1)、仙台病毒(SV)均无交叉反应;检测敏感度可以达到1.0×10~1拷贝/μl;3个不同浓度梯度标准品3次不同实验平均变异系数均小于5%。应用建立的方法检测105批次牛源性样本,BPIV3核酸阳性率为12.4%。结论建立的BPIV3QPCR检测方法线性关系良好,具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源性样本BPIV3的快速定量检测。

入境旅客携带苹果中粉红聚端孢菌的检测与鉴定

首次建立了粉红聚端孢菌(Trichothecium roseum)实时荧光定量PCR检测方法,该检测方法扩增效率高、特异性好,灵敏度可达0.1 pg菌丝体DNA量;结合形态学观察及致病性测定,对从机场入境旅客携带的苹果中分离到的1株疑似菌株Tr-1685进行检测和鉴定。Tr-1685实时荧光PCR检测结果为阳性。该菌株在PDA培养基上生长较快,菌落平展,边缘不规则,表面形成淡粉红色的霉层,产孢量丰富。分生孢子梗直立,长短不一,顶端着生分生孢子。分生孢子双细胞、光滑、棍棒状,平均大小为17.5μm×8.7μm,基部细胞弯曲状。该病原菌接种苹果4 d后,出现褐色腐烂,8 d后出现淡粉色霉层及分生孢子。分离获得的菌株Tr-1685鉴定为粉红聚端孢菌,与实时荧光PCR结果一致。

荧光定量PCR检测HBV-DNA与乙肝两对半检测结果的相关性探讨

分析荧光定量PCR检测HBV-DNA与乙肝两对半检测结果的相关性,为乙肝诊断研究提供依据。方法:研究时间:2019年8月到2020年12月,研究对象为240例疑似乙肝患者,均实施荧光定量PCR检测HBV-DNA(A方法)与乙肝两对半检测(B方法),分析两组方法检测结果与相关性。结果:240例疑似乙肝患者HBV-DNA阳性检出率为70.83%(170/240),HBV-DNA阴性检出率29.17%,HBsAg、HBeAg、HBcAb均为阳性者HBV-DNA水平最高,其阳性检出率最高,HbsAb(+)、HbeAb(+)、HbcAb(+)者对应的HBV-DNA水平最低。结论:荧光定量PCR检测HBV-DNA与乙肝两对半检测结果相关性较好,从实际应用角度分析,建议采取荧光定量PCR检测HBV-DNA联合乙肝两对半检测方法,提高诊断可靠性。