实时荧光定量检测人血浆中RASSF1A基因启动子甲基化

目的建立检测人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化的方法。方法以肺癌细胞株NCI-H460作为RASSF1A基因启动子区甲基化阳性样本,传统酚/氯仿法提取细胞DNA,经紫外分光光度计定量后以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200μl健康人血浆中,制备得到模拟肺癌患者血浆。用磁珠法从模拟血浆样本和15例早期肺癌患者血浆中提取总DNA。对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以TaqMan技术的实时荧光定量甲基化特异性PCR(MSP)进行检测。以模拟血浆样品作为标准品,用外标准曲线法对肺癌患者血浆中的甲基化RASSF1A进行定量。结果实时荧光定量MSP对模拟肺癌患者血浆的检测最低限为150拷贝(甲基化的肿瘤DNA)/ml(血浆)。15例肺癌患者5例RASSF1A甲基化阳性(33.3%)。5例肺癌患者血浆中甲基化的RASSF1A基因的浓度分别为2.56×103,8.20×104,1.45×104,3.31×104和4.24×104拷贝/ml。结论实时荧光定量MSP法检测肺癌患者血浆DNA中RASSF1A基因甲基化,灵敏度高,特异性强。

Wnt通路基因启动子甲基化在非小细胞肺癌诊断中的作用

目的:对Wnt信号通路中的基因进行分析以改善其作为诊断非小细胞肺癌(NSCLC)生物标志物的作用。方法:使用荧光定量甲基化特异性聚合酶链式反应(qMSP)分析SFRP1、SFRP2、PRKCB和WIF14种基因启动子在111例NSCLC组织及其配对的癌旁组织中甲基化水平表达,并结合临床资料及TCGA数据库进行分析。结果:SFRP1、SFRP2、PRKCB和WIF1甲基化水平在肺癌组织中的表达较相应配对的癌旁组织中的表达高,且SFRP1、SFRP2的表达水平在男性患者较女性高;结合4种基因启动子甲基化水平对NSCLC诊断的敏感性和特异性分别为83.3%和96.0%。结论:结合分析Wnt信号通路的4种基因的甲基化水平可用于NSCLC的早期诊断。

不同甲基化检测技术对模拟肺癌患者血浆中APC基因甲基化的检测

目的研究模拟肺癌患者血浆DNA中APC基因甲基化最低检测限,确定不同甲基化检测技术在早期肺癌诊断中的价值。方法用普通甲基化特异性基因扩增(methylation specific PCR,MSP)方法检测肺癌细胞株NCI-H460细胞APC基因,以酚-氯仿经典方法提取NCI-H460细胞DNA,紫外分光光度计定量并以10倍稀释的浓度梯度依次投入相同的健康人血浆200μl中去,得到模拟肺癌患者血浆,利用磁珠核酸提取方法从模拟血浆样本中提取血浆DNA。对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以Sybr-GreenⅠ为染料进行实时荧光定量MSP检测,同时进行普通MSP检测。结果NCI-H460细胞中的APC基因启动子1A区719位点存在甲基化,实时荧光定量MSP检测模拟肺癌患者血浆APC基因甲基化的最低检测限为在200μl血浆中能检测出102个肿瘤细胞的DNA,而以普通MSP检测,200μl血浆中需投入103个以上肿瘤细胞的DNA才有弱阳性条带。实时荧光定量MSP检测技术比普通MSP检测的敏感性至少高出10倍。结论实时荧光定量MSP比普通MSP检测灵敏度高,该技术用于肺癌患者血浆DNA甲基化检测,可能有助于肺癌早期诊断。

肠炎沙门氏菌种特异性FQ-PCR快速检测方法的建立

根据肠炎沙门氏菌（SE）种特异性DNA序列，设计合成了一对能特异性扩增130bp片段的引物和TaqMan探针，首次建立了SE的种特异性荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR）诊断方法。该法在SEDNA含量为9×10^8-9X104拷贝有较好的线性关系；检测SEDNA模板的灵敏度为4拷贝／μL，检测SE细菌数的灵敏度为6CFU／mL；特异性试验表明只对SE基因组呈阳性反应。分别应用该技术和传统细菌分离法检测60份来自人工感染鸭、小白鼠和肉兔的心、肝、脑和直肠粪便，结果显示两种方法对心、肝、直肠粪便的阳性检测结果符合率为100％，而FQ-PCR对脑的阳性检测率极显著（P〈0．01）高于细菌分离。研究结果表明，该方法快速、灵敏、特异、重复性好且能实时定量检测，可用于SE分离鉴定、SE感染疑似病例检测、SE体内动态分布规律研究及其分子流行病学调查。

胰腺癌中人RUNT相关转录因子3基因启动子区甲基化及其临床意义

目的检测胰腺癌人RUNT相关转录因子3(RUNX3)基因启动子的甲基化情况并探讨其临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)检测56例胰腺癌组织及癌旁组织、14例正常胰腺组织、3株人胰腺癌细胞株(PANC1、CFPAC-1、SW1990)、1株正常肝细胞株(HL-7702)中RUNX3基因启动子区CpG岛甲基化状态。检测用甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-cdR)处理前后胰腺癌细胞株RUNX3 mRNA的表达。分析RUNX3异常甲基化与胰腺癌临床特征的关系。结果56例胰腺癌组织中,51.79%(29/56)存在RUNX3基因启动子区CpG岛的异常甲基化,癌旁胰腺组织有10.7%(6/56)存在异常甲基化,而正常胰腺组织中未检测到RUNX3基因异常甲基化。RUNX3基因异常甲基化与患者病理分化程度(r=0.314,P=0.018)、淋巴结转移(r=0.370,P=0.005)显著相关。在5-Aza-cdR处理前,胰腺癌细胞株PANC1、CFPAC-1、SW1990的RUNX3 mRNA无表达或低表达,经5-Aza-cdR处理后各胰腺癌细胞株RUNX3 mRNA恢复表达。结论胰腺癌组织及胰腺癌细胞株均存在RUNX3基因CpG岛异常甲基化;RUNX3启动子的高甲基化与其基因表达降低有关,与胰腺癌组织分化程度、淋巴结转移相关。

Igr5启动子甲基化在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义

目的:探讨lgr5甲基化与人类卵巢癌临床病理之间的联系,以及其作为判定总的生存率的价值。方法:采用甲基化特异性聚合酶链式反应(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)方法分析卵巢癌患者石蜡组织中lgr5启动子DNA甲基化情况。结果:lgr5在正常卵巢组织中几乎无甲基化改变,而在良性卵巢肿瘤中频率升高,上皮性卵巢癌组织中甲基化频率明显升高(P<0.01);lgr5甲基化与低分化上皮性卵巢癌(P<0.01)、肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ(P<0.05)以及淋巴结转移(P<0.01)相关,但与组织类型关系不明显(P>0.05)。在70例上皮性卵巢癌患者组织中,lgr5甲基化频率为62.9%(44/70),并且5年总的生存率明显低于未甲基化的患者(P<0.05)。结论:lgr5甲基化与上皮性卵巢癌分化程度、肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ以及淋巴结转移密切相关,同时也可以作为上皮性卵巢癌患者总的生存率的判定指标之一。

食管癌组织中SFRPs基因异常甲基化检测及意义

目的检测食管鳞状细胞癌和癌旁正常组织SFRPs基因启动子区甲基化变化特征及其与临床病理变化的关系。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)。结果 110例食管鳞癌组织SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5基因启动子区甲基化阳性率分别为61.8%(68/110)、66.7%(73/110)、62.7%(69/110)、64.3%(71/110),明显高于癌旁正常组织的13.3%(4/30)、13.3%(4/30)、20%(6/30)、26.7%(8/30)。淋巴结转移组和中、低分化食管鳞癌组织甲基化阳性率明显高于无淋巴结转移组及高分化食管癌组织,但是与性别,年龄及肿瘤分期无明显关联。结论本研究结果显示,SFRPs基因启动子区甲基化与食管鳞癌发生发展密切相关.这些基因的甲基化检测可为食管癌的防治和预后评价提供遗传学理论依据。。

胃腺癌患者术前腹腔冲洗液细胞中APC基因异常甲基化状态分析

目的探讨胃腺癌(GAC)患者术前腹腔冲洗液细胞DNA中结肠腺瘤性息肉(APC)基因启动子区域5'-CpG岛异常甲基化及其临床意义。方法用实时荧光甲基化特异性聚合酶链反应(real time-MSP)检测92例GAC患者术前腹腔冲洗液细胞中APC基因异常甲基化状况,分析APC基因异常甲基化与患者临床病理因素及预后之间的关系。结果在92例GAC患者术前腹腔冲洗细胞标本中,有49例(53.26%)APC基因异常甲基化,其中28例(30.43%)完全甲基化,21例(22.83%)半甲基化。APC基因异常甲基化分别与GAC的生长方式、分化程度、浸润程度、淋巴结转移、远处转移及临床分期有统计学意义(P<0.05);生存分析表明,胃癌患者中APC基因异常甲基化组的中位生存时间为21.5个月,非甲基化组为41.5个月,差异有统计学意义(P<0.05),COX回归分析显示APC基因异常甲基化与淋巴结转移、远处转移及TNM分期影响GAC患者的预后。结论术前腹腔冲洗液细胞DNA中APC基因异常甲基化可反映GAC进展状况,并提示患者预后不良。

嗜铬细胞瘤PLAGL1基因表达及甲基化水平与SDHB基因突变相关性研究

背景与目的:PLAGL1基因是一种新发现的肿瘤抑制基因,具有诱导凋亡和细胞周期阻滞的功能。本研究旨在检测PLAGL1在嗜铬细胞瘤组织基因表达水平及上游调控区甲基化状态,并分析PLAGL1基因表达、甲基化情况与SDHB基因突变的关系,以探讨其在嗜铬细胞瘤诊断及治疗中的意义。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术检测PLAGL1基因在13例正常肾上腺髓质、32例良性嗜铬细胞瘤组织及54例恶性嗜铬细胞瘤组织中的表达;甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)技术检测PLAGL1基因上游调控区甲基化水平。SDHB基因扩增后直接测序分析突变情况。结果:PLAGL1基因在恶性肿瘤组织、良性肿瘤组织及正常肾上腺髓质中的相对表达量分别为(0.527±0.201)、(1.517±0.662)和(1.734±0.756),在恶性肿瘤组织与良性肿瘤组织及正常组织间表达水平差异显著,良性肿瘤组织与正常组织间差异无统计学意义(P>0.05),PLAGL1的低表达与恶性嗜铬细胞瘤组织PLAGL1基因上游调控区甲基化密切相关,在恶性肿瘤组织、良性肿瘤组织及正常肾上腺髓质中甲基化发生率分别为68.5%(37/54)、18.8%(6/32)和15.4%(2/13),7例恶性肿瘤组织SDHB基因发生突变,在良性肿瘤组织与正常组织中未检测到突变的发生。结论:PLAGL1基因的低表达与嗜铬细胞瘤恶性程度相关,其低表达与上游调控区甲基化有关,与SDHB基因突变情况有待进一步验证。

PCDH10基因在前列腺癌组织中的甲基化测定及临床意义

目的检测PCDH10基因在前列腺癌组织中的甲基化状态,并分析其临床意义。方法应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术检测PCDH10基因在3株前列腺癌细胞系、1株前列腺上皮细胞、13例前列腺增生组织和40例前列腺癌组织样本中的甲基化情况,同时分析40例前列腺癌患者的临床资料。结果 3株前列腺癌细胞系中有2株检出PCDH10基因甲基化;40例前列腺癌样本中24例(60%)检出PCDH10基因甲基化,13例前列腺增生组织中未检出PCDH10基因甲基化。PCDH10基因出现甲基化患者与未出现甲基化患者相比,在年龄、前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)和临床分期等指标的差异无统计学意义(P>0.05),但在Gleason评分的差异存在统计学意义(P<0.05)。结论 PCDH10基因在前列腺癌组织中甲基化程度较高,高Gleason评分的前列腺癌可能具有更高的PCDH10基因甲基化率,提示PCDH10基因甲基化可能与前列腺癌的发生发展有关。

PCDH10基因DNA甲基化在胃癌中的研究

目的:探讨PCDH10(原钙粘蛋白10)基因DNA发生甲基化后,其表达与胃癌发生的关系。方法:采用甲基化特异性PCR (methy-lation specific PCR)法和实时荧光定量逆转录–多聚合酶链反应(real-time RT-PCR)方法检测100例胃癌组织及正常组织中PCDH10基因启动子区的甲基化情况。结果:胃癌组织中PCDH10基因的甲基化阳性率较正常组织明显升高,差异具有统计学意义。结论:PCDH10的基因DNA甲基化可能与胃癌发生有关。

粪便中SDC2、SEPT9基因甲基化在结直肠癌筛查、早期诊断中的意义分析

目的 本研究对人粪便中的SDC2、SEPT9基因甲基化情况进行探讨,分析其在结直肠癌筛查、早期诊断中的意义。方法 随机选取25例结直肠癌患者作为结直肠癌组,20例结直肠腺瘤患者作为结直肠腺瘤组,15例结直肠正常者作为正常对照组。分别从三组研究对象粪便中提取DNA,检测DNA纯度,采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术分析SDC2、SEPT9基因甲基化状态。观察SDC2、SEPT9基因甲基化检测结果,比较三组粪便中SDC2、SEPT9基因甲基化检出率。结果 结直肠癌组粪便中SDC2基因甲基化检出率为76.00%,高于正常对照组的13.33%,差异具有统计学意义(P<0.05);结直肠腺瘤组粪便中SDC2基因甲基化检出率为80.00%,高于正常对照组的13.33%,差异具有统计学意义(P<0.05);结直肠癌组与结直肠腺瘤组粪便中SDC2基因甲基化检出率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结直肠癌组、结直肠腺瘤组、正常对照组粪便中SEPT9基因甲基化检出率分别为16.00%(4/25)、5.00%(1/20)、0(0/15),比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 粪便中SDC2基因甲基化程度有利于筛查、早期诊断结直肠癌,对于癌前病变更好地发现、追踪。因此,粪便中SDC2基因甲基化程度是一个重要的分子指标,使结直肠癌的筛查、诊断更加便利、无创、快捷;SEPT9基因的甲基化状态敏感性较低,检测发现的可能性较小,因此仍需要增加样本数量,多角度开展研究,从而保证研究的真实性、可靠性。

血栓调节蛋白基因甲基化修饰与脑梗死发病关系的研究

目的探讨血栓调节蛋白(TM)基因启动子区域甲基化修饰与脑梗死发病的相关性。方法 2017年1—12月在我院神经内科住院的脑梗死病人96例,根据颅脑MRI-弥散加权成像结果将脑梗死病人分为腔隙性脑梗死组(B组)41例,中等面积梗死组(C组)34例,大面积梗死组(D组)21例。同期在我院体检中心进行健康体检的志愿者38例(A组)作为对照。采用巢式甲基化特异性聚合酶链式反应(nMSP)检测所有受试者TM基因启动子区域甲基化状态;同时检测各组血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、空腹血糖(FPG)水平。采用ELISA法检测各组血清同型半胱氨酸(hcy)水平。结果脑梗死组病人血清TG、FPG、hcy水平均明显高于A组(F=3.33～249.98,P<0.05)。脑梗死病人TM甲基化率明显高于A组(χ~2=13.071,P<0.05);D组病人TM甲基化率明显高于B组病人(χ~2=4.397,P<0.05)。Spearman相关分析显示,脑梗死病人TM基因启动子区甲基化水平与病人入院24h内NIHSS评分呈正相关(r=0.537,P<0.05)。Logistic多元回归分析结果显示,病人年龄(OR=1.299,95%CI=1.075～6.678,P<0.05)、饮酒史(OR=6.654,95%CI=3.456～8.987,P<0.05)以及hcy水平升高(OR=5.098,95%CI=2.876～7.845,P<0.05)是影响病人发生TM基因甲基化的独立危险因素。结论脑梗死病人TM基因甲基化程度明显高于健康受试人群,且与脑梗死灶面积和疾病严重程度呈正相关。

FAM19A4基因启动子甲基化检测在宫颈癌组织中的临床价值

目的:探讨FAM19A4基因启动子甲基化检测在宫颈癌组织中的临床价值。方法:选取2017年1月至2018年12月广东医科大学顺德妇女儿童医院病理科采集的宫颈病理样本,其中宫颈癌样本32例,高度鳞状上皮内病变(HSIL)样本28例,正常宫颈样本24例,通过荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测对三组样本中FAM19A4基因启动子甲基化检出情况进行分析。结果:宫颈癌甲基化检出率高于HSIL组以及正常宫颈组,差异具有统计学意义(P < 0.05),HSIL组甲基化检出率高于正常宫颈组,差异具有统计学意义(P < 0.05);在患者年龄、组织学类型、临床分期、肿瘤大小以及淋巴结转移等方面,FAM19A4基因启动子甲基化检出情况差异无统计学意义(P > 0.05)。结论:FAM19A4基因启动子甲基化可能是宫颈癌特异性诊断标志物,可能与宫颈癌的发生以及发展存在一定相关性。

汾酒发酵过程中的微生物菌群变化

研究采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR),对发酵过程中的大茬、二茬发酵0、7、15、28 d酒醅样品进行总细菌、总真菌、耐酸乳杆菌、芽孢杆菌和酵母菌的定量分析。分析结果表明汾酒发酵过程中耐酸乳杆菌和酵母为酒醅中的主体微生物,占总细菌和总真菌总和的80%以上。大茬、二茬发酵中,功能微生物在发酵前期(0~7 d)演替规律相似,二茬发酵中后期菌群呈现显著衰亡趋势,且大茬发酵期间各菌群生物量均高于二茬发酵。大茬发酵期间总细菌、耐酸乳杆菌和芽孢杆菌的生物量整体呈上升趋势,分别于28、15、7 d达到最大值(5.53×10^(16)、1.40×10^(13)、1.21×10^(6) copies/g酒醅DNA)。在大茬和二茬发酵中总真菌和酵母的生物量在发酵0~7 d差异不大,呈快速增长趋势,大茬发酵在15 d后至发酵结束逐渐上升至最高值(1.07×10^(15)、1.56×10^(14) copies/g酒醅DNA)。二茬发酵中总真菌和酵母生物量在第7天达到最大值(3.03×10^(14)、1.43×10^(14) copies/g酒醅DNA)。

胃癌中钙黏附分子启动子甲基化与幽门螺杆菌感染及肿瘤生物学特性的关系

目的建立甲基化特异性聚合酶链式反应方法检测组织中钙黏附分子(CDH1)的甲基化程度;探索CDH1启动子的甲基化与幽门螺杆菌(HP)感染及与肿瘤分化、浸润、淋巴及远处转移之间的关系。方法采用热转化甲基化特异性聚合酶链式反应法检测2008年1月-2009年12月共40例胃癌手术标本中CDH1的启动子甲基化情况,并回顾性地分析CDH1的启动子甲基化与HP感染、肿瘤分化、浸润、淋巴及远处转移等肿瘤生物学特性的统计学关联。结果胃癌组CDH1基因甲基化阳性率高于对照组(67.5%、12.5%,P<0.05)。胃癌组中低-未分化肿瘤组CDH1基因甲基化阳性率高于高-中分化肿瘤组(80.6%、22.2%,P<0.05);胃癌组中HP阳性患者的CDH1基因甲基化率高于HP阴性患者(78.1%、25.0%,P<0.05);而胃癌组中CDH1基因甲基化阳性率与患者性别、肿瘤浸润程度、淋巴转移及远处转移无明显关系(P>0.05)。结论 CDH1基因甲基化可能参与了胃癌的发展过程,并且CDH1基因甲基化可能导致了肿瘤分化程度的降低。CDH1基因甲基化与胃癌患者的HP感染之间可能存在密切关系,提示HP感染可能参与了抑癌基因甲基化失活及肿瘤演变的发展过程。

Rap1GTP酶激活蛋白甲基化状态与结肠癌关系的研究

目的 探讨结肠癌中抑癌基因Rap1GTP酶激活蛋白（Rap1GAP）启动子甲基化情况,为结肠癌的早期诊断、早期治疗、靶向治疗及改善预后等提供理论依据及研究方向.方法 回顾性分析山西省忻州市人民医院病理科2010年1月至2014年9月病理诊断为结肠腺癌的患者33例,其中男性19例,女性14例,年龄41~72岁,取手术切除石蜡包埋标本.选取同期16例结肠腺瘤患者的石蜡包埋标本,包括男性9例,女性7例,年龄34~58岁.选取肿瘤远端（距肿瘤〉15 cm）切缘正常组织13例.使用定量甲基化特异性聚合酶链反应（q-MSP）技术检测Rap1GAP基因启动子区甲基化水平.比较3种组织间及临床病理因素亚组间Rap1GAP基因启动子区甲基化水平的差异.结果 Rap1GAP启动子甲基化率[中位数（四分位数间距）]在结肠癌、结肠腺瘤和癌旁正常组织中分别为65.43%（50.35%）、21.37%（8.39%）、17.43%（15.71%）,结肠癌组高于结肠腺瘤组及癌旁正常组织组,差异有统计学意义（P〈0.05）.结肠癌组男性、女性Rap1GAP启动子甲基化率分别为42.74%（70.44%）、21.98%（80.00%）;≤60岁与〉60岁分别为36.26%（62.62%）、26.23%（76.42%）;高分化癌、中低分化癌分别为21.98%（40.32%）、42.74%（74.20%）;TNMⅠ~Ⅱ期、Ⅲ~Ⅳ期分别为25.31%（48.27%）、36.26%（75.55%）.结肠癌中Rap1GAP甲基化率与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、TNM分期均无关（均P〉0.05）.结论 Rap1GAP启动子甲基化可能与结肠癌的发生、发展有关,可能作为结肠癌早期诊断的靶标.

5-氮杂脱氧胞苷对肝癌细胞HepG2中抑癌基因FHIT表达的影响

背景与目的:肝癌细胞中由于FHIT基因过度甲基化而导致其表达降低。本实验应用甲基化酶抑制剂5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)作用肝癌细胞株HepG2,观察用药后肝癌细胞中FHIT mRNA和蛋白表达的变化,并观察5-Aza-dC对细胞增殖的影响。方法:以5-Aza-dC作用HepG2细胞,采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)检测HepG2细胞中FHIT甲基化变化;采用RT-PCR检测FHIT mRNA的表达;采用细胞免疫组织化学染色和Western blot方法检测FHIT蛋白表达,MTT法检测HepG2细胞增殖情况。结果:5-Aza-dC处理前,HepG2细胞FHIT基因呈甲基化状态,mRNA及蛋白表达缺失;经5-Aza-dC作用后,MSP显示HepG2细胞FHIT基因甲基化逆转;经1.0μmol/L、2.0μmol/L及4.0μmol/L的5-Aza-dC作用48h后,FHIT基因mRNA扩增出产物的吸光度值分别为0.80±0.32、1.41±0.54和1.51±0.61,Western blot检测产物积分灰度值分别为0.33±0.20、1.00±0.26和1.12±0.38;当药物浓度达到1.0μmol/L时出现了对HepG2细胞增殖的抑制作用。结论:5-Aza-dC能明显逆转HepG2细胞的FHIT基因异常甲基化,激活因高甲基化所致基因沉默的再转录,诱导该基因的表达;同时抑制细胞增殖。