实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测结肠癌中Syndecan-1 mRNA和HPA-1 mRNA的表达及临床意义

背景与目的:侵袭转移是导致结肠癌死亡率增加的主要原因,如何阻断肿瘤的侵袭转移成为目前研究的热点。本研究旨在检测Syndecan-1基因和HPA-1基因在结肠癌组织中的表达水平,探讨二者与结肠癌侵袭转移及预后的关系。方法:用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测49例结肠癌、49例配对的癌旁组织(距癌2cm)和49例配对远离结肠癌的手术切缘正常组织(距癌5cm以上)的Syndecan-1和HPA-1基因的表达水平,分析二者与结肠癌临床病理特征的关系。结果:结肠癌中HPA-1mRNA的表达水平(40.56±11.75)显著高于癌旁组织(18.28±11.33)和正常组织(10.80±10.20)(P均<0.001),癌旁组织明显高于正常组织(P<0.05);正常结肠组织中Syndecan-1mRNA表达水平(61.21±12.96)显著高于癌旁组织(14.35±11.06)和结肠癌组织(10.12±8.58)(P均<0.001),癌旁组织明显高于结肠癌组织(P<0.05)。Syndecan-1mRNA的表达减弱和HPA-1的表达增强与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期显著相关(P均<0.05)。Spearman等级相关分析证明了Syndecan-1mRNA和HPA-1的表达呈明显负相关(r=-0.405,P<0.05)。结论:Syndecan-1mRNA在结肠癌组织中呈低表达,HPA-1mRNA在结肠癌组织中呈高表达,且Syndecan-1mRNA的表达减弱与HPA-1的表达增强可促进结肠癌的侵袭转移。联合检测Syndecan-1mRNA及HPA-1mRNA对于指导结肠癌临床治疗及判断预后有重要价值。

荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA

目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,利用荧光标记半定量RT-PCR技术检测大鼠肾GAPDHmRNA在死后48h内相对表达量的变化情况。结果在死后即刻至40h内大鼠肾均可检测出GAPDHmRNA,且其扩增产物呈规律性下降。结论荧光半定量RT-PCR技术检测大鼠死后肾GAPDHmRNA含量变化对PMI推断具有一定的应用价值。

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白的表达

目的应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测兔火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白(BMP)-2mRNA水平。方法建立外固定架固定一期治疗兔股骨火器伤骨折的动物模型和BMP-2 mRNA表达水平的SYBR G reenⅠ荧光定量RT-PCR方法,分别于术后第1、2、3、4周取断端组织,通过实时荧光定量RT-PCR检测标本标本中BMP-2 mRNA水平。结果在对照组,创伤后的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平在1周开始增高,在第2周达到高峰后下降,第4周即可恢复正常。而实验组,受枪伤的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平在第3周表达最高,与对照组相比,升高较慢,表达量也偏低(P<0.05)。结论BMP-2mRNA SYBR G reenⅠ荧光定量RT-PCR可以很好地反应枪击伤对兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平的影响。枪击伤后的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平与对照组相比升高较慢,表达量也偏低。

荧光定量逆转录聚合酶链反应检测脑星形细胞瘤中多药耐药基因

目的 探讨用荧光定量聚合酶链反应方法检测脑星形细胞瘤中多药耐药 (multidrugresistance ,MDR1 )基因的表达。方法 在逆转录聚合酶链反应的基础上 ,采用荧光定量方法对经病理证实的 38例星形细胞瘤进行实时检测MDR1基因 ,并进行统计学分析。结果 复发病人MDR1基因阳性率为 88 9% ,比初发病人 (48 3 % )高 ,Ⅰ级星形细胞瘤病人MDR1基因阳性率为 2 2 2 % ,Ⅱ级病人为 66 7% ,Ⅲ级病人为 71 4%。结论 星形细胞瘤中MDR1基因的阳性率较高 ,且有原发耐药现象。荧光定量实时检测MDR1基因的方法具有较高的准确度和灵敏度 。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

免疫组织化学、荧光原位杂交和逆转录——多聚酶链反应在滑膜肉瘤诊断中的价值

滑膜肉瘤是一种恶性程度很高的软组织肉瘤,起源于具有滑膜分化的间叶细胞,滑膜肉瘤也可发生于某些罕见部位,这经常造成了滑膜肉瘤的误诊。本文对目前用于滑膜肉瘤的3种组织化学病理诊断技术进行综述,比较各种诊断方法的优劣,指导临床实践。

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法 ,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份,好=8.1,P<0.005。结论 通过该实验,验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3mRNA表达水平

目的采用SYBR Green I实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,建立检测前列腺癌抗原3(DD3)mRNA的标准,定量检测人体不同组织中该基因的表达水平。方法从LNCaP细胞中采用RT- PCR法扩增特异性DD3基因片段,将其与pMD18-T载体连接,转化宿主菌JM109,对质粒标准进行聚合酶链反应(PCR)检测及测序。纯化后检测质粒拷贝浓度,制备梯度浓度标准品。应用LightCycler荧光定量PCR仪对标准品进行检测。取正常人乳腺组织、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢、正常前列腺组织、前列腺增生及前列腺癌组织,定量检测DD3 mRNA表达。结果建立稳定的检测DD3 mRNA的标准,正常人乳腺、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢中无DD3 mRNA表达,在正常前列腺及前列腺增生组织中低表达,两者间差异无显著性 (P>0．05);在前列腺癌中高表达(P<0．05)。结论应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR技术检测 DD3 mRNA表达水平简便、可行、经济。DD3基因的表达具有良好的前列腺癌特异性。

逆转录多聚酶链反应方法研究乳腺癌的微小转移

目的 通过分子生物学与常规免疫组化法比较 ,以寻求更好地检测乳腺癌微小转移的方法。方法 采用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)方法检测 2 6例乳腺癌患者的外周血与骨髓中细胞角蛋白 19(KT19)mRNA的表达 ,并用链酶亲和素 生物素 过氧化物酶复合物 (SABC)免疫组化法检测乳腺癌患者骨髓涂片中上皮膜抗原 (EMA)。结果 2 6例外周血中KT19mRNA阳性 4例(15 4% ) ,骨髓阳性 10例 (38 4% )。免疫组化结果显示 2 6例骨髓中有 7例 (2 6 9% )EMA阳性 ,其KT19mRNA都阳性 ,有 3例 (11 5 % )免疫组化结果阴性而KT19mRNA阳性。结论 RT PCR方法检测KT19mRNA是一种比较敏感的方法 ,免疫组化也是一种比较可靠的检测方法 。

实时逆转录-聚合酶链反应绝对定量实验优化的研究

目的 探讨优化实验反应条件 ,使实时逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)绝对定量能获得准确可靠的结果。方法 建立质粒标准品作为外参照 ;以管家基因GAPDH作为内参照 ,并对Mg2 + 、引物与探针比例、Buffer等进行优化。结果 优化条件后 ,RT PCR反应的扩增效率接近了理论最佳值 ,并可使靶基因与管家基因扩增效率保持一致 ,保证了方法的稳定性和可靠性。结论 为了获得可靠、重复性好的实时RT PCR绝对定量结果 ,应对实验方法进行优化。

人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达的竞争性逆转录-聚合酶链反应定量分析

为建立人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达检测方法 ,研究载脂蛋白E基因与儿童健康的关系 ,我们抽取 2 6例健康儿童外周静脉血 ,分离血单核细胞 ,抽提RNA ,采用逆转录—聚合酶链式反应检测载脂蛋白E基因表达 ,并以正常人cDNA作定量标准物 ,待测样品与定量标准物共扩增 ,计算出待测样本的个体的mRNA量。研究发现载脂蛋白E基因能在健康儿童周围血单核细胞表达 ,健康儿童载脂蛋白E基因表达量为 0 .37± 0 .15mol/molmRNA。表明采用竞争性逆转录—聚合酶链反应方法来检测人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达的分析方法快速、简便、灵敏、实用、可靠 ,且能准确定量 ,值得推广应用。

建立实时荧光定量逆转录PCR方法检测非小细胞肺癌棘皮动物微管相关蛋白4-间变淋巴瘤激酶融合基因

目的建立一种实时荧光定量逆转录PCR方法,对非小细胞肺癌间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因进行快速、敏感和特异检测。方法首先,应用Primer Premier 5.0软件,针对棘皮动物微管相关蛋白4(EML4)-ALK常见融合变异V1、V2、V3a和V3b设计引物和Taqman水解探针。然后,以包含EML4-ALK融合变异V1、V2、V3a和V3b的假病毒颗粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性和特异性。最后,用所建立的方法检测50例非小细胞肺癌临床标本,其中包含3例ALK-荧光原位杂交(FISH)(+)样本。结果在无背景RNA干扰情况下,建立的实时荧光定量逆转录PCR方法检测灵敏度高达10拷贝/!l。在500拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达1%,在5000拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达0.5%。对于检测特异性,以正常人白细胞及血浆RNA为研究对象,均未见非特异性扩增。对50例非小细胞肺癌临床标本进行检测,47例阴性标本检测均为阴性,3例ALK-FISH(+)标本2例检测阳性,1例未检出,未检出原因与标本RNA提取失败有关。结论本研究建立的实时荧光定量逆转录PCR方法是一种快速、简便以及具有高灵敏度和特异性的EML4-ALK融合基因检测方法,值得在临床进一步验证和推广。

逆转录—聚合酶链反应—酶联夹心杂交法定量检测人IL-6mRNA

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的逆转录—聚合酶链反应—微孔板酶联夹心杂交技术定量检测人IL-6mRNA的方法。方法:从人外周静脉血单个核细胞提取总RNA,进行RT-PCR扩增,PCR产物经热变性后与检测探针一起加入已包被捕获探针的微孔板内进行夹心杂交,用链亲和素—辣根过氧化物酶(SAV—HRP)及底物系统检测杂交信号。结果:该方法检测IL-6mRNA的灵敏度明显高于逆转录—聚合酶链反应—琼脂糖凝胶电泳;特异性高,RT-PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现;重复性良好。结论:本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化,适合于细胞因子mRNA的定量检测。

16S rRNA/DNA荧光定量多聚酶链反应检测肺炎婴幼儿肠道菌群变化

目的了解肺炎婴幼儿肠道菌群的变化,探讨16S rRNA/DNA荧光定量多聚酶链反应(PCR)技术在临床细菌定量分析中的可行性和实用性。方法提取23例健康儿童(健康对照组)和23例肺炎患儿(观察组)治疗后粪便标本的细菌DNA,测量和比较二组标本细菌的吸光度(A)260值;采用16SrRNA/DNA荧光定量PCR技术对二组粪便标本中的乳酸杆菌和大肠杆菌进行定量分析和比较。采用SPSS13.0软件进行统计学分析。结果健康对照组和观察组治疗第1、3、7天的粪便标本中细菌的A260值分别为(3381.2±817.2)mg/L、(1643.5±498.4)mg/L、(859.6±165.2)mg/L、(1263.8±337.3)mg/L;健康对照组和观察组治疗第1、3、7天比较,均有显著性差异(Pa<0.01);观察组患儿治疗第1、3、7天和健康对照组的肠道乳酸杆菌数量(拷贝数/g湿便)的对数值分别为(5.19±0.48)、(6.94±0.66)、(6.05±0.57)和(9.13±0.53);大肠杆菌数量的对数值分别是(6.99±1.17)、(7.38±1.08)、(6.76±1.17)、(7.52±0.44),健康对照组和观察组比较,均有显著性差异(Pa<0.01)。结论肺炎患儿随治疗时间长短菌群数量有差异;16S rRNA/DNA荧光定量PCR技术在临床细菌定量分析中是切实可行的。

实时荧光定量RT-PCR检测结直肠癌中外周血端粒酶逆转录酶mRNA的表达及其临床意义

目的:建立外周血端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达量检测的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)系统,检测结直肠癌患者hTERT mRNA的表达并探讨其对结直肠癌微转移的诊断价值.方法:用实时荧光定量RT-PCR技术检测53例结直肠癌患者和21名健康人的外周血标本hTERT mRNA表达情况,分析其表达与肿瘤临床病理特征的关系并应用接受者操作特征曲线(ROC曲线)分析hTERT mRNA检测对结直肠癌的诊断价值.结果:结直肠癌组外周血hTERT mRNA表达水平显著高于正常对照组(t'=7.953,P<0.05),其表达与肿瘤淋巴结转移、血行转移和TNM分期相关(t'/t=2.334,2.149,2.460,均P<0.05).hTERT mRNA诊断结直肠癌的ROC曲线下面积0.91,诊断界值为Ct≤32.结论:应用实时荧光定量RT-PCR技术克服了传统PCR只能定性检测而不能定量检测的缺点;外周血hTERT mRNA可作为诊断结直肠癌微转移的标记物.

实时荧光逆转录聚合酶链反应对疑似甲型H1N1流感样本的检测结果及分析

目的对流感疑似患者咽拭子样本进行检测,保证患者早诊断和及时分析湘西自治州甲型H1N1疫情流行动态。方法依据世界卫生组织2009年4月30日颁布的检测甲型H1N1流感操作规程,利用实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及7300型实时荧光定量PCR仪的SDS操作软件进行检测。结果 737例流感疑似患者咽拭子样本中,甲型H1N1流感病毒阳性率为25.5%。结论运用RT-PCR检测结果显示湘西自治州甲型H1N1流感疫情具有传播快,强度大,但其病死率较低的流行特征,与全国流行规律基本一致。

多重荧光定量聚合酶链反应法检测肉制品中的3种食源性致病菌

目的建立多重荧光定量聚合酶链反应法(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)快速检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌的方法。方法根据沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌的hemolysin基因、大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列分别设计特异性引物及探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌多重qPCR方法。结果该方法只扩增3种靶细菌,对其他供试菌不扩增;沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的检出限分别为10^(1)、10^(2)、10^(2)拷贝数/μL,并且拥有良好的重复性和特异性。人工污染的猪肉样品经SLE培养基富集8 h后,分别可以检测到初始菌液浓度为1.56×10^(2)CFU/25 g的沙门氏菌,2.13×10^(2)CFU/25 g的单增李斯特菌,2.32×10^(2)CFU/25 g的大肠杆菌O157:H7。结论所建立的多重qPCR灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌,在提高食品安全和保护人类健康方面有重要意义。

荧光定量多聚酶链反应检测HBV-DNA

目的 探讨荧光定量多聚酶链反应 (FluorescencequantitativePCR ,FQ PCR)检测HBV DNA的可行性及优缺点。方法 采用FQ PCR、斑点杂交分别检测由ELISA定性的 2 0 3份血清样品 (大三阳、小三阳、乙肝疫苗免疫者、健康人 )。结果 FQ PCR和斑点杂交阳性检出率分别是 96 4 9%、2 8 2 4 % (大三阳 ) ,85 96 %、5 88% (小三阳 ) ,P <0 0 5 ;斑点杂交阴性血清FQ PCR定量高达4 7× 10 5COPY/ml。结论 FQ PCR检测HBV DNA灵敏、可靠 。

实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测HLA-DRα基因mRNA表达

目的建立实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HLA-DRα基因mRNA表达。方法应用T-A克隆技术构建含HLA-DRα基因的载体作为标准模板,采用荧光Taqman方法及探针标记技术,建立实时荧光定量RT-PCR方法,制备标准曲线,检测牛膝多糖(ABPS)诱导人外周血单核细胞的HLA-DRαmRNA表达水平变化,并与半定量RT-PCR检测结果进行比较。结果实时荧光定量RT-PCR检测ABPS诱导人外周血单核细胞实验组HLA-DRαmRNA表达明显升高,而无ABPS诱导人外周血单核细胞对照组HLA-DRαmRNA表达没有改变,且半定量RT-PCR结果显示HLA-DRα出现类似的变化趋势。结论所建立的实时荧光定量RT-PCR用于检测HLA-DRαmRNA表达,结果用拷贝数表示,比半定量RT-PCR更灵敏、准确。