实时荧光定量-PCR和酶联免疫吸附法检测巨细胞病毒-IgM抗体的比较

目的:比较实时荧光定量-PCR和酶联免疫吸附法检测巨细胞病毒-IgM抗体水平的敏感性及准确率。方法:收集108例孕前筛查妇女,同时采用实时荧光定量-PCR和酶联免疫吸附法检测外周血巨细胞病毒-IgM抗体水平,并对这两种检测方法的阳性率进行比较。结果:实时荧光定量-PCR法阳性率为74%,酶联免疫吸附法为57%,两者差异有统计学意义(P<0.05);18例荧光定量-PCR法阳性的妇女血清巨细胞病毒-IgM拷贝数低于10-4/ml。结论:实时荧光定量-PCR与酶联免疫吸附法相比,对巨细胞病毒-IgM抗体检测具有较高的敏感性和准确率,值得临床推广使用。

荧光定量-PCR检测乙肝患者血清HBV-DNA及其临床应用

目的 探讨HBV -DNA基因含量与HBV -M两者的关系及其在临床中的应用。方法 采用酶联免疫吸附试验 (ELISA)和荧光定量 -PCR(FQ -PCR)法对 5 5 3例乙肝患者及无症状携带者血清进行HBV -M以及HBV -DNA定量检测。结果 乙肝患者血清HBV -DNA阳性率和基因含量与HBV -M模式有很大关系 ,与HBeAg(+)高度相关 ,显著高于其他各组 (P <0 .0 0 1,P <0 .0 1) ,在抗 -HBe(+)组或抗 -HBs(+)组也检出了一定浓度的HBV -DNA ;不同临床类型乙型肝炎患者血清中HBV -DNA的阳性率和含量无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 单凭血清免疫标志物模式难以准确判断HBV的复制程度及传染性的强弱 ,定量检测HBV -DNA能真实反映HBV的复制情况 ,对诊断、治疗乙肝患者及疗效观察具有较大的指导意义。

荧光定量-PCR检测HBV-DNA与ELISA法检测HBV-M的关系研究

为了探讨HBV -DNA基因含量与乙型肝炎病毒标志物 (HBV -M )两者的关系 ,用FQ -PCR检测HBV -DNA ,ELISA法检测HBV -M。发现乙肝患者血清HBV -DNA含量与HBV -M有很大关系 ,与HBeAg(+)高度相关 ,在抗 -HBe(+)组或抗 -HBs(+)组也检出了一定浓度的HBV -DNA。说明FQ -PCR法检测HBV -DNA能准确反映HBV真实感染和低复制状态 ,对诊断、治疗乙肝患者具有非常重要的指导意义。FQ -PCR与各种证型的HBV

应用Q-PCR定性检测KIR基因有无方法的建立

目的建立定性检测KIR基因有无的Q-PCR方法。方法根据高分辨水平中国人群KIR等位基因的多态性,并参考国际IPD-KIR数据库,针对16种KIR基因及2DS4-Normal、2DS4-Deleted两种亚型,设计KIR基因特异性引物用于Q-PCR扩增反应;同时设置一孔阴性对照、一孔阳性对照(特异性扩增人体生长激素HGH基因片段),以监控假阳性、假阴性的结果。为验证Q-PCR方法的可靠性,随机选择302份已采用KIR PCR-SSP商品化试剂盒检测的标本,采用Q-PCR方法盲检和对比。结果300人份的Q-PCR检测结果与已知的PCR-SSP检测结果相符,有2份标本结果不一致,其中1例标本的2DS5基因Q-PCR检测结果为阴性,而PCR-SSP检测结果为阳性;另一例标本2DS1基因Q-PCR检测结果为阳性,而PCR-SSP检测结果为阴性。对2份标本分别进行2DS5、2DS1基因测序分型,证实Q-PCR定性检测结果正确。结论本文建立的KIR Q-PCR方法结果准确、可靠,可用于KIR基因有无的定性检测。

应用荧光定量RT-PCR检测J亚群禽白血病病毒

针对J亚群禽白血病病毒(ALV-J)基因序列保守区域设计一对特异性引物和一条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒作为阳性标准品,建立了检测ALV-J核酸的荧光定量PCR方法。优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如A亚群禽白血病病毒(ALV-A)、B亚群禽白血病病毒(ALV-B)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)和马立克病病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.2×102拷贝/μL的病毒核酸,与常规RT-PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。研究结果表明,建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于ALV-J的定量检测。

乳腺癌患者c-erBb-2基因荧光定量PCR方法的研究

目的:建立乳腺癌中c-erbB-2基因的荧光定量PCR(FQ-PCR)方法。方法:乳腺癌细胞中的c-erbB-2基因与质粒PGEM-Teasy vector重组,转化大肠杆菌E.coliDH5α,获得克隆的c-erbB-2基因标准模板。用ABI PRISM7700PCR仪检测FQ-PCR扩增产物制成标准曲线来检测未知标本中c-erbB-2的含量。结果:FQ-PCR扩增产物呈“S”形动力学曲线;ct(循环阈值)与PCR体系中起始模板拷贝数的对数值之间存在严格的线性关系,显示了FQ-PCR定量的准确性。结论:FQ-PCR是一种快速、简便、灵敏、准确的定量c-erbB-2基因的方法。

实时荧光定量PCR在EB病毒检测的临床应用

EB病毒在人群中广泛感染,中国3-5岁儿童EB病毒VCA-IgG抗体阳性率达90%以上,幼儿感染后多数无明显症状,或引起轻症咽炎和上呼吸道感染,青年期发生原发感染,约有50%出现传染性单核细胞增多症。主要通过唾液传播,也可经输血传染。EB病毒在口咽部上皮细胞内增值,然后感染B淋巴细胞,这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染。

沙门氏菌荧光实时定量PCR检测试剂的研制及应用

荧光实时定量PCR技术是近年来广泛应用于沙门氏菌快速检测的现代方法之一,本研究建立了检测沙门氏菌快速、敏感、特异以及准确定量的FQ-PCR方法。采用沙门氏菌fimY基因序列,设计特异引物和探针,通过对Taq酶、Mg2+和引物探针浓度等反应体系和条件的优化,然后进行特异性和适用性实验。最优化结果为:Taq酶用量2.5U;Mg2+浓度为3.75×10-3mol/L;引物浓度为0.65×10-6mol/L,探针浓度为0.30×10-6mol/L;循环条件为step1:95℃2min,step2:95℃5s,60℃40s,40cycles。结果表明该FQ-PCR检测试剂具有快速、简单、灵敏度高、特异性强和适用范围广等优点,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等领域。

乙型肝炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及临床应用

目的建立 SYBR Green I实时荧光定量 PCR检测乙型肝炎病毒 DNA的快速方法，并探讨其临床应用价值。方法根据GenBank公布的Hepatitis B virus gp1基因序列设计引物，建立SYBR Green I实时荧光定量PCR，并对反应体系和扩增程序进行优化。定量标准品通过基因克隆方法获得，同时以浙江省夸克公司 HBV DNA定量检测试剂盒作对照，应用于随机选取的100份乙型肝炎患者血清检测。结果 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 检出限范围为5＆#215;102 copies／ml～5＆#215;108 copies／ml，HBV DNA浓度与CT值有良好线性关系，无交叉反应，整个过程仅需2.5 h。在随机抽取的100份临床标本应用中，与浙江省夸克公司的 HBV荧光定量 PCR检测试剂相比，建立的 SYBR Green I实时荧光定量PCR体系灵敏度100％，特异度92.5％。结论 SYBR Green实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强，可用于乙型肝炎患者病情监测，有效指导临床用药，准确评价 HBV感染者的病情。

H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法的建立及初步应用

虽然H3、H9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）是低致病性禽流感病毒，但其具有跨宿主感染哺乳动物的能力，对社会公共卫生安全具有重大的潜在危害，因而对这些亚型病毒的监测极其重要。通过比对GenBank上H3、H9亚型禽流感病毒HA基因序列，设计了分别针对H3 AIV和H9 AIV的特异性探针。特异性试验和标准曲线试验的结果显示，这两个探针仅分别特异性识别H3、H9亚型AIV，且具有较好的扩增效率。通过重组质粒pMD19-T-H3HA和pMD19-T-H9HA 10倍梯度稀释液为模板，进行敏感性实验。结果表明，本研究所建立的荧光定量PCR方法能检测到100个DNA拷贝数H3 AIV和10个DNA拷贝数的H9 AIV，比传统PCR方法敏感性分别提高了100倍和1000倍。此外，本方法还能检测到10 EID50的H3亚型AIV或H9亚型AIV，比传统PCR方法检测敏感性均提高了1000倍。批间和批内试验的变异系数均小于3%，表明本研究建立的方法具有较好的重复性。此外，与传统PCR方法相比，用H3、H9亚型AIV双重荧光定量PCR方法检测人工感染动物的肺组织时，针对H3 AIV的敏感性提高了10~100倍，针对H9 AIV的敏感性提高了100倍。综上所述，本研究所建立的H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法具有较高的特异性和敏感性，对H3、H9亚型禽流感病毒监测具有重要的应用价值。

实时荧光定量PCR检测皱纹盘鲍Δ5脂肪酸去饱和酶基因表达方法的建立及应用

研究以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)体内存在的2条Δ5 Fad(Hdhfad1和Hdhfad2)为目的基因,β-肌动蛋白(β-actin)和核糖体蛋白S9(Ribosomal protein S9,RPS9)为内参基因,应用2–ΔΔCt方法建立了实时荧光定量PCR(Real-Time quantitative PCR,RT-qPCR)检测体系,并应用此体系分析了鲍鱼肌肉组织Δ5 Fad在不同饲料处理下的表达差异。实验饲料含有不同的脂肪源,分别是棕榈酸甘油酯(Tripalmitin,TP饲料)、富含二十碳四烯酸(Arachidonic acid,ARA)的油脂(AO饲料)和富含二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)的油脂(EO饲料)。结果表明:针对Hdhfad1、Hdhfad2、β-actin和RPS9所设计的引物特异性强。各引物对的PCR扩增效率(Efficiency,E)分别为1.05、0.99、0.97和0.98,满足2–ΔΔCt方法对E的要求。当退火温度为52℃,反应体积为25μL时,RT-qPCR的扩增效果最好。所建立的体系能够准确定量Δ5 Fad的基因表达。利用该方法分析Δ5 Fad在不同饲料处理下的表达结果显示,与TP对照组相比,EO和AO饲料显著降低了鲍鱼肌肉组织Δ5 Fad(Hdhfad1和Hdhfad2)的表达量。

鹿布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究依据布鲁氏菌的特异性基因Omp25c的部分片段作为靶基因,设计探针引物,且优化了反应体系,筛选出引物、探针的最优浓度配比。将扩增产物连接到PGEM-T载体上,制备标准品及标准曲线,建立鹿布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、稳定性、敏感性进行评价。由标准曲线可知该方法的最低检测浓度可达到36拷贝/μL,比常规PCR灵敏度高出很多。

多通道Taqman-探针荧光定量PCR鉴定MRSA方法的建立

目的建立基于mec A／nuc／fem B三基因联合的 Taqman-探针荧光定量 PCR鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的方法。方法以常规检验标本中分离和采用 VITEK 2 Compact微生物分析仪鉴定为凝固酶阳性的 MRSA为研究对象，通过PrimerPremier5.0和Beacon Designer 7软件设计针对mec A／nuc／fem B特异性PCR引物及Taqman荧光探针，荧光探针5’端分别采用 FAM，HEX及 ROX标记，3’端采用BHQ1标记，在荧光定量PCR仪进行检测。结果①1 g／dl凝胶电泳结果显示mec A／nuc／fem B三个基因引物特异性较好，扩增出的条带分子量与预期分子量一致且未见非特异性扩增；②在单管单通道及单管多通道的 PCR检测中 mec A／nuc／fem B均获得特异性扩增，且三个基因在单管多通道的PCR扩增效果与单管单通道的相类似。结论成功建立了多通道 Taqman-探针荧光定量 PCR鉴定 MRSA的方法， mec A／nuc／fem B三种基因联合检测可有效区分凝固酶阴性和阳性的 MRSA，提高鉴定 MRSA的准确率。

不同荧光定量PCR对于HBVcccDNA水平的检测差异对比

目的研究对比不同荧光定量聚合酶链反应PCR对于乙型肝炎病毒HBVccc DNA水平的检测差异。方法选择20例从2007—2008年在广州市第八人民医院接受住院治疗的乙肝患者作为研究对象。提取其血清及肝组织进行实验分析,另取2份不含HBV感染的患者血清和肝组织作阴性对照组。将其中经或未经脱氧核糖核酸酶DNase处理的样本分别使用HBVccc DNA跨单缺口PCR和跨双缺口PCR检测。分析Taq Man探针跨单缺口PCR测定HBVccc DNA的结果,对比跨单、双缺口PCR测定结果以及不同荧光定量PCR的测定结果。分析血清和肝组织中HBVDNA与HBVccc DNA病毒载量的关系。结果血清及肝组织经过DNase消化后的有关拷贝数显著低于未消化者。血清和肝组织跨双缺口PCR测定结果较跨单缺口PCR测定结果均显著降低。血清中的HBVDNA及ccc DNA实验结果均显著低于在肝组织中的测定结果,差异均有统计学意义(均P<0.05)。阴性对照组经四种荧光定量PCR检测后均呈阴性。20例E抗原呈阳性的乙肝病人,其机体病毒载量总体趋势为血清HBVDNA的载量较肝组织更低,差异显著。结论 DNase可有效减少HBVccc DNA在检测过程中的假阳性情况,经DNase处理后的跨双缺口PCR检测特异性最高。同时,血清中基本不含ccc DNA。

荧光定量PCR检测志贺菌方法的建立

目的：建立一种检测志贺菌属快速敏感的荧光定量PCR方法．方法：根据志贺菌属侵袭性质粒抗原H （ipaH）编码基因序列，设计1对PCR引物特异性靶基因片段，通过检测3株志贺菌属菌株和9株非志贺菌属菌株来评价该方法的特异性；对福氏志贺菌菌液做一系列10倍稀释后进行荧光定量PCR分析敏感性，PCR 扩增产物经电泳和测序鉴定．结果：3株志贺菌属菌株出现特定大小的目的条带，9株非志贺菌属菌株未出现目的条带；测序也证实了PCR产物的特异性；荧光定量PCR检测福氏志贺菌ipaH基因的下限为200拷贝/mL．结论：本研究建立的方法快速、特异、敏感．

实时荧光定量PCR在食品致病菌及转基因成分检测中应用

与传统定性PCR技术相比,实时荧光定量PCR有更多的优点,其速度快,特异性更强、灵敏度更高、无污染性、自动化水平高等,且能对DNA模板进行定量。本文综述了实时荧光定量PCR技术原理、分类及其应用,并对其存在的问题和发展前景进行了展望。

HB-VM模式与定量PCR关系

目的 :探讨血清HBVDNA水平与HBV标志物 (HBV M)表现模式的关系。方法 :对 12 0 7例慢性乙型肝炎患者进行血清HBVDNA荧光定量PCR分析 ,HBVM检测采用ELISA法。结果 :血清HBVDNA水平与HBVM表现模式有关 ,HBsAg与HBeAg的存在影响HBVDNA水平变化。结论 :HBeAg和HBVDNA有明显的相关 ,抗 HBe、抗HBc阳性者病毒未完全停止复制 。

急性心肌梗死患者血浆游离线粒体DNA拷贝数定量分析及临床意义

目的探究急性心肌梗死(AMI)后血浆游离线粒体DNA拷贝数变化及其临床意义。方法采集50例健康体检者血浆标本为对照组,50例AMI患者为AMI组,应用荧光定量PCR法测定其循环游离线粒体DNA拷贝数。结果对照组血浆游离线粒体DNA拷贝数为4×10~4(2.5×10~4,9.5×10~4)copies/mL;AMI组血浆游离线粒体DNA拷贝数为2.2×10~5(4.9×10~5,0.8×10~5)copies/mL,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 AMI患者血浆游离线粒体DNA拷贝数升高,血浆游离线粒体DNA拷贝数检测可能成为辅助诊断心肌梗死的生物学标志。

荧光定量RT-PCR检测柯萨奇病毒A组6和10型的方法建立及应用

目的 建立柯萨奇病毒A组6（Coxsackievirus A6,CVA6）和10型（CVA10）的SYBRGreen Ⅰ荧光定量RT-PCR方法并进行评价及初步应用.方法 根据GenBank上的CVA6和CVA10序列,分别设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法体系,并分别进行灵敏度,重复性和特异性检测,然后利用该方法对649份2014年天津市未明确分型的肠道病毒阳性标本进行检测.结果 成功建立CVA6和CVA10的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法及定量标准曲线,其检出限均为101 copies/μL,重复性实验的变异系数均小于2％.该方法特异性强,与柯萨奇病毒（A组2、4、5、16型）、肠道病毒EV71型、诺如病毒、轮状病毒、麻疹病毒和乙型流感病毒均无交叉反应.利用该方法检测649份未分型标本,发现136份为CVA6阳性和174份为CVA10阳性,分别占未分型阳性标本的20.96％和26.81％.结论 本研究建立的检测CVA6和CVA10荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、重复性好、特异性强,应用于2014年天津市手足口病监测,发现C VA6和CVA10已成为优势型病原体.