“荧光定量PCR溶解曲线法”监测人TCRβ链CDR3谱系漂移技术的建立

目的建立"荧光定量PCR溶解曲线分析技术"监测人外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法提取4例正常人、9例大肠癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell-PBMC)中的总RNA,逆转录成cDNA,以26个人TRBV基因家族设计上游引物,共同的TRBC基因设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增26个TRBV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果正常人外周血T细胞TCRβ链26个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"(melting curve spectratyping)呈现溶点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布;9例大肠癌患者的外周血TCRβ链CDR3谱系的26个家族CDR3表达频率不一致,有的患者部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论"荧光定量PCR溶解曲线分析TCR CDR3谱系漂移技术",方法稳定简便,能较好的监测正常人和临床样本外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。

采用荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCR alpha链CDR3谱系漂移技术的初步探讨

目的:初步探讨荧光定量PCR溶解曲线分析技术监测人外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法:提取4例正常人、2例淋巴瘤型白血病患者PBMC中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCRalpha链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上游引物,共同的TCRalpha胚系链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果:正常人外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的溶解曲线谱型图(melting curve spectratyping)呈现熔点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布,2例淋巴瘤型白血病患者外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的溶解曲线谱型图上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论:荧光定量PCR溶解曲线分析TCRalpha链CDR3谱系漂移技术方法稳定简便,能较好地监测正常人和临床样本外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。

荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用研究

探讨在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,观察分析应用价值。方法 本研究的时长段在2022年6月到2023年6月,统共1000例结核患者接受治疗,所有病患都拓展了抗结核药物的测验,且每一位患者的标本均予以荧光定量PCR探针熔解曲线法检测,药物敏感性测定结果为黄金基准,考察判辨荧光定量PCR探针熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的诊断效能。结果 针对1000例的标本中,经过液体药敏试验检测显示对利福平药物耐药例数250例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者;对异烟肼医药有耐药性的液体药敏试验500例,应用溶解曲线检测耐药性包含了470例;经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数170例,予以熔解曲线法显示耐药140例。经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数300例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者。熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的灵敏度分别为84.00%、84.00%、47.06%、66.67%;特异度分别为96.00%、90.00%、84.34%、94.29%;准确度分别为93.00%、97.00%、91.00%、86.00%。结论 在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,可得到较高的应用价值,灵敏度、特异度、准确度较高,可筛查结核病患者对利福平、异烟肼、乙胺丁醇等药物的耐药性,为临床治疗疾病提供可靠的依据。

荧光定量PCR法与培养法检测解脲支原体结果比对分析

目的通过比较荧光定量PCR法(qPCR)和培养法在解脲支原体(UU)检测中的符合率,为临床解脲支原体检测方法的选择提供参考依据。方法收集近期就诊于该院112例患者的生殖道分泌物标本,分别采用qPCR法与培养法检测UU。结果在112例标本中,UU培养法阳性53例,阳性率为47.32%,qPCR法阳性61例,阳性率54.46%(χ2=1.143,P=0.285>0.05)。61例qPCR法阳性的UU浓度范围1.60×10^(3)-1.04×10^(7)copy/mL,其中10^(3)copy/mL 12例(19.7%),10^(4)copy/mL 15例(24.6%),10^(5)copy/mL 22例(36.1%),10^(6)copy/mL 9例(14.7%),10^(7)copy/mL 3例(4.9%)。培养法阴性而qPCR法阳性病例9例,qPCR法测定浓度范围10^(3)~10^(5)copy/mL。结论qPCR法检测UU的阳性率略高于培养法,两种方法不符合结果的UU测定浓度分布在10^(3)-10^(5)copy/mL之间。

猪萨佩罗病毒VP1基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立

为建立用实时SYBRGreenI荧光定量PCR方法检测PSVVP1基因表达量的标准曲线,试验根据目的基因在NCBI上CDS区的序列设计合成引物,用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接,构建重组质粒,采用real-time RT-PCR的检测方法,建立了检测猪萨佩罗病毒VP1基因表达量的标准曲线。试验结果显示,线性回归系数为0.9981,且熔解曲线只有一个峰值,表明由VP1目的基因所建立的标准曲线线性关系良好。试验成功建立了用SYBRGreenI荧光定量RT-PCR方法检测猪萨佩罗病毒VP1基因表达量的标准曲线,为后续检测基因表达量的变化奠定了基础。

结核杆菌检验中涂片抗酸染色法与荧光定量PCR法的价值对比

目的比较涂片抗酸染色法与荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法在检验结核杆菌中的价值,为肺结核诊断提供依据。方法选取2021年8月至2023年8月本中心就诊的60例疑似肺结核患者,采集患者痰液标本,分别采用荧光定量PCR法、涂片抗酸染色法对其进行检测,并将痰培养所得结果作为本研究的“金标准”,就两种检测方法的具体诊断效能(特异度、准确度与灵敏度、阳性预测值、阴性预测值)进行对比。结果在疑似肺结核患者60例当中,通过痰培养确诊肺结核患者38例,所占比重为63.33%;荧光定量PCR法诊断阳性36例,涂片抗酸染色法为34例。荧光定量PCR法检测的特异度(95.45%)、准确度(93.33%)、灵敏度(92.11%)、阳性预测值(97.22%)、阴性预测值(87.50%)均较涂片抗酸染色法(68.18%、70.00%、71.05%、79.41%、57.69%)高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用荧光定量PCR法对结核杆菌进行检测,其在诊断肺结核方面的效能,优于涂片抗酸染色法,更具适用性。

胶体硒法HIV快速检测与实时荧光定量PCR法检验的一致性研究

目的:探究胶体硒法人类免疫缺陷病毒(HIV)快速检测与实时荧光定量PCR法检验的一致性。方法:选取2020年1月—2021年1月到艾滋病自愿咨询检测(VCT)门诊就诊的987例患者为研究对象,均接受胶体硒法、实时荧光定量PCR法检验,以免疫印迹法为金标准,比较不同检测方式的诊断效能、不同检测方式之间检验的一致性,对比不同方式对“窗口期”弱阳性抗体检测情况及不同检测方式的一致性。结果:987例疑似HIV高感染风险患者中,经免疫印迹法检测发现,373例阳性,614例为阴性;胶体硒法与实时荧光定量PCR法比较无统计学差异(P>0.05)。胶体硒法诊断结果与免疫印迹法诊断结果之间具有一致性(Kappa值=0.539),等级为中度;实时荧光定量PCR法与免疫印迹法诊断结果之间具有一致性(Kappa值=0.872),等级为高度;经免疫印迹法检测45份“窗口期”弱阳性抗体实时荧光定量PCR法检测43例阳性,胶体硒法检测42例阳性,实时荧光定量PCR法的灵敏度、准确度均显著高于胶体硒法(P<0.05)。胶体硒法与实时荧光定量PCR法胶在“窗口期”弱阳性抗体诊断结果中的一致性较差(Kappa值=0.357)。结论:胶体硒法与实时荧光定量PCR法对HIV检测的效果具有一致性,实时荧光定量PCR法准确性略高;胶体硒法与实时荧光定量PCR法在“窗口期”弱阳性抗体诊断结果中的一致性较差,实时荧光定量PCR法在“窗口期”弱阳性抗体血清检测中具有较高的检测价值。

传统方法、荧光定量PCR法、LAMP法检测痰液标本中肺炎链球菌的价值

目的:分析传统方法、荧光定量聚合酶链反应(PCR)法、环介导恒温扩增技术(LAMP)法检测痰液标本中肺炎链球菌的价值。方法:选取2022年1月—2023年7月医院收治的100例肺炎患者,均按相同方法严格采集患者的痰液标本后,采用痰培养法、荧光定量PCR法、LAMP法检测肺炎链球菌,分析不同检测方法的检测价值。结果:100例肺炎患者痰液标本经痰细菌培养法、荧光定量PCR法、LAPM法检测结果比较,差异无统计学意义(P>0.05),与痰细菌培养法相比,荧光定量PCR法、LAPM法对肺炎链球菌检测一致性高(Kappa=0.826、0.830,P<0.05)。以痰细菌培养法作为金标准,荧光定量PCR法、LAPM法对肺炎链球菌检测价值比较,无统计学差异(P>0.05)。结论:传统方法、荧光定量PCR法、LAMP法检测痰液标本中肺炎链球菌均有较高价值。

荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸的质控结果分析

目的分析浅析荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸的质控结果。方法在2021年5月至2022年11月期间,120例流感病毒感染样本进行研究。对这些样本的流感病毒RNA进行了核酸抽提,并利用PCR实时荧光定量技术进行检测以评估其效果。结果运用该技术检测到乙型流感病毒44例,甲1型40例,以及甲3型36例。所有检测结果均符合分子生物学操作的质控标准,合格率达到100.0%。结论实时核酸PCR技术在临床流感病毒检测中被广泛应用。PCR实时荧光定量检测法在流感病毒核酸检测中的表现精确且迅速,适宜作为应对突发公共卫生事件的首选检测手段。

乙肝肝炎病毒检测中荧光定量PCR法与时间分辨免疫荧光的对比分析

探析荧光定量PCR法与时间分辨免疫荧光在乙肝肝炎病毒检测中的应用效果。方法 选用96例疑似乙肝患者,均进行荧光定量PCR法与时间分辨免疫荧光病毒检测,以细菌培养作为金标准,比较不同检测手段的阳性检出率、检验结果及检测效能。结果 荧光定量PCR法的检测符合率、灵敏度,高于时间分辨免疫荧光法,而特异度低于时间分辨免疫荧光法。结论 荧光定量PCR法和时间分辨免疫荧光两种方法各有优缺点,适用于不同的检测环境和需求。在实际应用中,需要根据检测要求和实际情况进行选择,确保有效性和准确性。

“荧光定量PCR溶解曲线法”监测HIV感染者TCR α链CDR3谱系漂移的研究

目的利用"荧光定量PCR溶解曲线分析技术"监测HIV感染者外周血T细胞TCRα链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法提取6例HIV感染者、4例健康者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的总RNA,逆转录成cDNA,设计人32个TRAV基因家族上、下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果健康者外周血T细胞TCRα链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"显示多克隆增生的高斯分布,呈现溶点不同的CDR3多态性,6例HIV感染者的外周血TCRα链CDR3谱系的32个家族CDR3表达频率不一致,患者各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"显示多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCRα链CDR3谱系漂移的方法稳定、简便,可以用来监测健康者和HIV感染者外周血T细胞TCRα链CDR3谱系漂移。

荧光定量PCR法在乙型肝炎病毒检测中的准确性评价

目的分析荧光定量聚合酶链式反应法(FQ-PCR)应用在乙型肝炎病毒(HBV)检测中的准确性。方法选择2020年1月-2021年6月接诊的100例HBV携带者,均行FQ-PCR、酶联免疫吸附法(ELISA)检测,对比二者检测结果。结果100例HBV携带者中“大三阳(模式1)”共24例,HBV-DNA含量平均为(8.24±1.12)copy/mL,阳性率为95.83%(23/24),均显著高于其他6种模式(P<0.05);100例HBV携带者中"小三阳(模式2)"共31例,HBV-DNA阳性率为83.87%(26/31),均显著高于3,4,5,6,7模式(P<0.05);而其他模式在HBV-DNA阳性率及含量方面均无明显差异(P>0.05)。结论与ELISA相比较,FQ-PCR更能定量反映HBV复制、感染状况,有助于早期确诊乙型病毒性肝炎,以及判断传染性质与监测病情,值得推广。

应用荧光定量PCR-探针熔解曲线法快速鉴定分枝杆菌菌种方法的建立及初步评价

目的应用荧光定量PCR-探针熔解曲线法建立一种快速、简便、高效的分枝杆菌菌种鉴定新方法,为临床医师正确诊断提供理论依据。方法以DNA直接测序法为对照,通过荧光定量PCR技术-探针熔解曲线法(包括反应A、B、C)分析22种分枝杆菌标准株、11种非分枝杆菌标准株和32株分枝杆菌临床分离株的菌种。结果应用荧光定量PCR-探针熔解曲线法分析22种分枝杆菌标准株和11种非分枝杆菌标准株,结果与标准株DNA测序一致,成功地建立鉴定方法。32株分枝杆菌临床分离株中,经DNA测序和荧光定量PCR-探针熔解曲线法分析显示,4株为结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex,MTC),7株为胞内分枝杆菌,6株为龟分枝杆菌脓肿亚种,4株为瘰疬分枝杆菌,4株为偶然分枝杆菌,3株为堪萨斯和胃分枝杆菌,2株为戈登分枝杆菌;另有2株分离株反应A的熔解曲线显示为分枝杆菌属的熔解温度(melting temperature,Tm)值,反应B和C的熔解曲线Tm值与22株分枝杆菌标准株的Tm值均不同,经DNA测序证实与戈登分枝杆菌标准株序列不同,与报道的戈登分枝杆菌分离株一致。结论用荧光定量PCR-探针熔解曲线法可简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种,提高分枝杆菌病的正确诊断率,指导临床合理用药。

多系统萎缩患者TCR α链CDR3谱系的荧光定量PCR溶解曲线

目的:利用荧光定量PCR溶解曲线分析技术检测1例多系统萎缩患者TCRα链CDR3谱系。方法:提取1例多系统萎缩患者和1例正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCRα链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上游引物,共同的TCRα链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单、寡、多克隆增生,挑选单克隆进行PCR扩增,扩增产物行普通琼脂糖凝胶回收后测序分析。结果:多系统萎缩患者和正常人PBMC的32个TCRα链TRAV家族CDR3谱型的FQ-PCR产物的各家族相对定量表达不一;正常人的32个TCRα链TRAV家族CDR3谱型的溶解曲线图表现为多个峰型的高斯分布,多系统萎缩患者的TRAV10、TRAV15、TRAV29家族CDR3谱型的溶解曲线表现为单峰的克隆性增生,其他家族为多峰、寡峰的多克隆及寡克隆增生,未出现缺失的家族,对单峰的TRAV15家族的测序得到的CDR3区的氨基酸组成为:SAIYFCAEDRDSTLTFG。结论:该多系统萎缩患者的PMBC中,存在TCRα链CDR3谱系漂移。

毛细管电泳片段分析法、荧光定量PCR法在ALRTI患儿咽拭子标本病原体诊断中的应用对比观察

目的毛细管电泳片段分析法、荧光定量PCR法在急性下呼吸道感染患儿咽拭子标本病原体诊断中的应用。方法急性呼吸道感染患儿65例(65份咽拭子标本),分别采用毛细管电泳片段分析法、荧光定量PCR法检测患儿咽拭子病原体,比较两种方法病原体检出率,并分析两种检测方法与金标准(Sanger测序法)检测结果的一致性。结果毛细管电泳片段分析法病原体检出率为52.3%(呼吸道合胞病毒21份、副流感病毒4份、衣原体病毒2份、腺病毒2份、鼻病毒2份、偏肺病毒3份、博卡病毒1份,其中1份为合胞病毒与鼻病毒混合感染),荧光定量PCR法病原体检出率为45.0%(呼吸道合胞病毒20份、副流感病毒3份、衣原体病毒2份、腺病毒1份、鼻病毒1份),两种方法病原体检出率比较,P>0.05。毛细管电泳片段分析法与Sanger测序法检测结果阳性一致率为100.0%,阴性一致率为100.0%,准确率为100.0%;荧光定量PCR法与Sanger测序法检测结果阳性一致率为86.2%,阴性一致率为93.5%,准确率为90.0%。结论毛细管电泳片段分析法与荧光定量PCR方法病原体检出率无差异,但毛细管电泳片段分析法能检测出病原菌混合感染,且与Sanger测序法检测结果有高度一致性,有更高的临床应用价值。

荧光定量PCR溶解曲线分析技术检测多系统萎缩患者TCRβ链CDR3谱序初探

目的利用荧光定量PCR溶解曲线分析技术检测多系统萎缩病人TCRβ链CDR3谱序。方法提取1例多系统萎缩病人外周血单个核细胞中的总RNA逆转录成cDNA,以26个人TRBV基因家族设计上游引物,共同的TRBC基因设计下游引物,用荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增26个TRBV基因各家族CDR3谱系,根据其溶解曲线图分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果该病例外周血T细胞TCRβ链26个家族CDR3表达频率不一致,有的家族呈现缺失状态,有的家族出现寡克隆状态。结论该多系统萎缩病人TCRβ链CDR3存在谱系漂移,有的表达呈寡克隆,有的无表达呈缺失。

便携式实时荧光定量PCR仪数据处理方法研究

实时荧光定量PCR越来越多被用来定量核酸的表达水平,随着经济与社会的发展进步,个人的自我保护意识和自身健康都重视了起来,使得人们对健康有了更高的要求,适应于现场核酸分析技术的需求日渐显著,不同的仪器有不同稳健的、合适的测量分析方法。本研究针对一种基于转盘式荧光检测的便携式实时荧光定量PCR仪的数据进行处理分析,通过对比优化不同峰值拟合算法及扩增曲线拟合算法优化提升了光学系统检测性能。结果表明,针对该系统峰值拟合算法采用正弦拟合对原始数据进行处理有较好的效果,扩增曲线拟合算法采用4参数logistic拟合,标准品浓度梯度样本扩增结果线性拟合优度R^(2)>0.990,变异系数CV值小于5%,使得光学系统检测性能有所提升,为该类检测模型仪器的数据处理方法提供了一定参考。

TaqMan荧光定量PCR法检测CHO细胞中外源基因拷贝数的方法建立

目的以β2-微球蛋白(B2M)为内参基因,建立一种检测CHO细胞中外源基因H拷贝数的TaqMan荧光定量PCR方法。方法使用含有目的基因H和内参基因B2M的质粒作为标准品,分别建立目的基因H和内参基因B2M的标准曲线。提取重组CHO细胞基因组DNA,并对所提基因组中目的基因H和内参基因B2M的拷贝数同时进行qPCR检测。结果成功建立了目的基因H和内参基因B2M的标准曲线,扩增效率分别为92.09%和94.96%。标准曲线的相关系数均在0.99以上,且具有良好的重复性。随着细胞传代的增加,目的基因的拷贝数相对稳定。结论成功建立了TaqMan荧光定量PCR法检测CHO细胞中外源基因拷贝数的方法,该方法可用于外源基因在CHO细胞中的遗传稳定性研究。

基于实时荧光定量PCR的番木瓜多重PCR高效检测方法

以pCaMV35S基因核酸检测试剂盒反应体系为基础,添加多重PCR反应所需的目标基因引物和番木瓜(Carica papaya L.)DNA,进行多重PCR反应,同时考察不合成荧光探针的情况下对目标基因进行实时荧光定量检测。结果表明,在实时荧光定量PCR反应体系中,多重PCR扩增的基因条带比常规PCR扩增的基因条带更亮,在不合成荧光探针的情况下实现目标基因的实时荧光定量PCR反应,以期建立一种基于实时荧光定量PCR的多重PCR检测方法。

SYBR Green II荧光定量PCR结合熔解曲线鉴别不同亚型兔病毒性出血症病毒方法的建立

本研究建立了一种荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR)结合熔解曲线区分不同亚型兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)方法。根据GenBank数据库中已公布的不同亚型RHDV(经典RHDV和RHDV2)的衣壳蛋白VP60序列保守区设计了1对特异性引物,利用SYBR Green II荧光染料,在实时荧光定量PCR方法的基础上结合熔解曲线进行分析,经典RHDV和RHDV2熔解温度(Tm)分别为(86.3±0.1)℃和(85.1±0.1)℃,扩增产物的熔解曲线分析均只出现单特异峰。结果表明,本研究建立的方法能够快速地鉴别经典RHDV和RHDV2。