牛奶β-乳球蛋白质实时荧光定量PCR检测方法的建立

建立一种快速、特异、灵敏的Taqman实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法,用于牛奶主要过敏原β-乳球蛋白质的检测。根据Gen Bank登录的牛β-乳球蛋白质的DNA序列设计,合成一对特异性引物和探针。将扩增产物连接到p MD19-T载体上,制备质粒标准品并测序鉴定,10倍梯度稀释含有β-乳球蛋白质基因的重组质粒,进行实时荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线,检测该方法的特异性、稳定性、灵敏性,同时将建立的方法用于10种市售食品的检测。成功建立了β-乳球蛋白质的实时荧光定量PCR检测方法,标准曲线的Ct值与模板浓度在3.18×103~3.18×107copies范围内线性关系良好,R2值为0.997 8;检测灵敏度高（318 copies/μL）;特异性强,对羊奶、豆浆DNA均无扩增反应;稳定性好,组内、组间的变异系数均在5%以内。对10种食品牛奶过敏原的检测结果与标签相符。表明所建立的实时荧光定量PCR方法可应用于食品中牛奶过敏原β-乳球蛋白质的检测并可推广到其它过敏原的检测。

转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测方法的建立

根据转基因低木质素苜蓿草品系KK179-2 5’端外源插入序列与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,建立了KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测方法,并对其特异性、灵敏度及可重复性进行了测定。结果表明:建立的定量实时荧光PCR检测方法特异性良好;标准曲线线性相关系数(R^2)为0.99,扩增效率E为105%;检测限为20拷贝,定量限为200拷贝。重复性实验显示本方法的标准偏差(SD)及相对标准偏差(RSD)都在可接受范围内。综上,建立的KK179-2品系特异性定量PCR检测方法适于快速、准确、稳定地对转基因苜蓿草KK179-2品系进行检测。

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测肾移植患者IL-2和IL-10基因表达

目的对比肾移植患者和常规手术患者免疫状态,验证以β-actin mRNA为模板参照定量PCR技术的有效性。方法采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR对29例肾移植患者和10例常规手术患者术前、术后3和7天外周血淋巴细胞IL-2和IL-10 mRNA表达进行检测。结果两组术前IL-2和IL-10 mRNA水平无差别;术后肾移植组IL-2mRNA明显降低,而对照组无明显变化;两组术后第3天IL-10 mRNA表达水平均明显升高,肾移植组高于对照组(P<0.01),术后第7天对照组降至正常,肾移植组亦下降,但水平仍高于术前。结论SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术对于监测肾移植患者免疫状况和研究免疫耐受意义重大,以β-actin mRNA为模板参照的定量PCR技术是测定细胞因子基因表达的简单有效方法。

鸡PD-1及其配体实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为了建立并应用鸡相关免疫抑制性受体及其配体的检测方法，试验根据GenBank中程序性死亡因子-1（PD—1）及其配体PD—Ls（PD—L1、PD—L2）的基因序列分别设计特异性引物，建立这3种基因的SYBRGreenI实时荧光定量RT—PCR检测方法，并对鸡法氏囊病毒（IBDV）感染雏鸡7d的外周血单核细胞（PBMC）中3种基因mRNA表达水平进行检测。结果表明：建立的检测方法在1×10^1～1×10^8copies／μL模板范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0．990，重复性试验的组内及组间变异系数均小于3％；应用所建立的方法对临床样品进行检测，IBDV感染组PBMC中PD-1、PD—L1和PD—L2mRNA表达量与对照组相比均显著升高（P〈0．05）。说明所建立的检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性。

免疫磁分离-两重荧光定量PCR法快速检测鲜猪肉中金葡菌和志贺氏菌

本文即尝试以实验方式,利用免疫磁分离-两重荧光定量PCR法对鲜猪肉样本中的金葡萄球菌以及志贺氏菌进行检测。结果显示:免疫磁分离-两重荧光定量PCR法能够在6.0 h时间内完成对鲜猪肉样本中金葡萄球菌以及志贺氏菌的检测,具有检测过程快速性、检测结果灵敏度高、特异性高以及准确可靠等诸多优势,可作为食品样本中常见食源性致病菌的常规检测方法之一,加以推广应用[1]。

人端粒酶催化亚单位mRNA的实时荧光RT-PCR定量检测

目的 :建立可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。方法 :用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA ,然后反转录为cDNA。利用一对基因特异引物和一条TaqManMGB探针 ,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA。同时定量测定人 β 肌动蛋白 (hBA)的mRNA作为内对照。用梯度稀释的克隆的人 β 肌动蛋白基因制作标准曲线。结果 :标准曲线的相关系数为 1.0 0。实时荧光反转录PCR方法的平均变异系数为 7.1%。HepG2细胞hTERTmRNA与hBAmRNA的比值为 (1.3± 0 .3)× 10 -4。结论 :建立了可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。

应用引物-探针能量转换系统(PriProET)实时荧光定量PCR技术检测猪圆环病毒2型的研究

研究应用实时荧光定量PCR技术(以引物-探针能量转换系统(PriProET)为基础)检测了猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV2是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(PM-WS)的重要病原,与其它疾病如猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的发病密切相关。由于PCV2通常发生在猪群中,而且该病的严重程度与器官、血液中的病毒载量有关,因此检测病毒载量也可反应出PCV2的严重程度。为了确定临床症状和不同器官病毒载量的相关性,本试验应用PriProET RT-PCR技术对PMWS的各种病毒及其临床症状进行了研究。试验结果表明,所测数据与前人研究结果相一致,即患PMWS的情况下,1 mL血浆和500 ng组织中DNA的病毒载量均大于107拷贝数。因此,新的PriProET RT-PCR技术可用于检测PCV2,并且具有特异、灵敏和稳定的优点。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒与猪圆环病毒2型双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)TaqMan双重荧光定量PCR检测方法,研究根据Gen Bank中已登录的PRRSV-M基因序列和PCV2cap基因序列,设计了2对特异性引物和2条Taq Man探针。结果显示以含有PRRSV-M基因和PCV2-cap基因的重组质粒为模板绘制的标准曲线,其相关系数(R^(2))均大于0.99,线性关系较好。该方法仅对PRRSV和PCV2检测为阳性,而对PRV、CSFV、PEDV、TGEV检测结果均为阴性,表明其特异性较好。检测下限约为10拷贝/μL,重复性试验结果显示该方法的组内和组间变异系数均小于1.5%,利用国标荧光定量PCR方法与本实验建立的方法分别对42份临床样品进行检测,二者对PRRSV和PCV2检测的符合率分别可达96.4%和100%。研究表明所建立的荧光定量PCR方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于PRRSV和PCV2的双重定量检测。

尼罗罗非鱼MyD88基因荧光定量PCR检测方法的建立

为了准确分析尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)髓样分化因子(myeloid differentiation factor88,MyD88)在天然免疫反应中的作用,根据MyD88EST序列(GenBank登录号:GR679416.1)和β-actin基因序列(GenBank登录号:AB037865.1),分别在保守区域设计并合成引物。实验利用5倍系列稀释的尼罗光罗非实鱼时肝定脏量cPDCNRA检样测品方构法建。标应准用曲2线-ΔΔ并Ct分进析行方融法解初曲步线检分测析了,建尼立罗尼罗罗非罗鱼非肝鱼脏M、脾yD脏88、的血S液Y和BR肌G肉re等en不Ⅰ荧同组织中的MyD88相对表达量。扩增结果表明,MyD88和β-actin基因标准曲线CT值检测范围分别为24～35和19～30,扩增效率分别为100%和96.7%,相关系数分别为0.998和0.995;熔解曲线分析显示产物均形组织成肝单脏一、特脾异脏峰和,血Tm液值中分高别丰为度78表.5达℃和。77.5℃。定量分析结果显示。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

利用实时荧光定量比较Ct法检测转基因小鼠外源基因拷贝数

目的:在建立转基因小鼠模型时,外源基因拷贝数是影响其表达水平和遗传稳定性的重要因素之一。外源基因拷贝数的精确测定,是建立转基因动物模型的重要环节。方法:合成cagA基因和内参基因GAPDH的引物,用标准曲线法测得cagA和GAPDH基因的扩增效率分别为97.6%和98.6%;将128拷贝阴性小鼠基因组和128拷贝cagA打靶质粒的混合物作为参照样品,取6只来自同一母本的F2阳性小鼠的128拷贝基因组作为待测样品;选取GAPDH作为内源参照基因,用比较Ct法对待测样品进行定量。结果:经计算,6只待测小鼠的cagA基因拷贝数平均值为8。结论:利用实时荧光定量PCR仪,采用改良后的比较Ct法对转基因小鼠的外源基因拷贝数进行了精确测定。

动力学模型在荧光定量PCR数据处理中的优势

近年来荧光定量PCR技术凭借其基因定量的优势而得到了广泛应用,上游技术的发展保障了原始数据的精确性,但定量结果的可靠性仍取决于PCR扩增效率和所采用的数据处理模型,基于不同数学模型对原始数据处理后的结果会有较大差异。试验通过对样品进行5倍梯度稀释后获得相应梯度的荧光定量PCR原始数据,并应用2-△△Ct法、相对标准曲线法和动力学模型处理原始数据,所得定量结果(x-±s)依次为1.76±0.70、0.89±0.14和0.99975±0.06,与理论值1比较表明,动力学模型在定量结果的可靠性、方便性及经费节约方面都具有良好应用前景。

用荧光定量PCR及金标法检测不孕妇女生殖道沙眼衣原体感染的比较

目的检测73例不孕妇女宫颈分泌物中沙眼衣原体感染情况。方法应用荧光定量PCR及金标法并将两种方法作比较。结果表明用荧光定量PCR法检测不孕的沙眼衣原体阳性为41例(56.1%),阴性32例(43.9%),金标法检测阳性为19例(26.0%),阴性54例(74.0%),荧光定量PCR检测的阳性率明显高于金标法检测(P <0.01)。结论荧光定量PCR法在检测沙眼体较金标法更敏感、快速,是早期诊断生殖道沙眼衣原体感染的一种极有价值的方法。

不同引物及数据分析方法对定量PCR结果的影响

目的:研究不同引物及数据分析方法对实时荧光定量PCR SYBR Green染料法检测基因表达差异结果分析的影响。方法:通过Primer Express 2.0软件对目的基因CCND1、C-JUN分别设计4对不同引物进行SYBR Green染料法定量PCR扩增,并分别使用2-△△CT法、Pfaffl法及相对标准曲线法计算肺癌紫杉醇敏感细胞株及耐药细胞株间目的基因的表达差异,分析不同引物和数据计算方法对实验结果的影响。结果:统计学分析表明,引物的扩增效率对定量PCR结果分析有显著影响,不同引物特异性扩增得到的样本间表达倍数有显著差异(P<0.05)。3种计算方法中,Pfaffl法与相对标准曲线法无统计学差异(P>0.05),而2-△△CT法与其他2种方法均有显著差异(P<0.05)。结论:引物的选择对于定量PCR结果有显著影响;Pfaffl法是更准确,更合理的相对定量计算方法。

PCR反向膜杂交法在CT、UU、NG三种性病筛查中的应用价值

目的:探讨PCR反向膜杂交法在CT、UU、NG三种性病筛查中的应用价值。方法:对1486例疑为泌尿生殖道感染患者分别采用PCR反向膜杂交法及荧光定量PCR(FQ-PCR)检测,并将检测结果与培养结果比较。结果:FQ-PCR检测CT、UU、NG阳性率高于培养法,比较差异有统计学意义(P<0.01);PCR反向膜杂交法与培养法及FQ-PCR检测阳性率比较差异均无统计学意义;PCR反向膜杂交法、FQ-PCR检测敏感性比较差异无统计学意义,但PCR反向膜杂交法检测特异性高于FQ-PCR,比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:PCR反向膜杂交法筛查CT、UU、NG准确,快速,且筛查特异性高于FQ-PCR,值得临床推广适用。

意大利蜜蜂防御素-2蛋白序列分析及表达特性研究

【目的】对意大利蜜蜂(Apis mellifera)防御素-2蛋白(Defensin-2,Def-2)进行蛋白序列分析和表达特性研究,以期为意大利蜜蜂防御素基因的免疫防御机制、发育和代谢途径研究提供理论基础。【方法】利用生物信息学在线网站及软件对Def-2蛋白进行预测分析,并采用实时荧光定量PCR对意大利蜜蜂不同发育时期(幼虫期、蛹期及1、5、10、15、20、25和30 d成年期工蜂)的基因相对表达量进行检测分析。【结果】意大利蜜蜂防御素-2基因(Def-2)编码104个氨基酸残基,相对分子量为11858.90 Da,理论等电点(pI)为8.54,为两性不稳定蛋白。该蛋白N-末端有一段含21个氨基酸的信号肽,存在1个跨膜结构域,亚细胞主要定位于内质网、液泡和高尔基体,无糖基化位点,存在15个磷酸化位点,其二级结构以无规卷曲(54.81%)为主、延伸链(28.85%)分布较多,α-螺旋(16.35%)分布较少,蛋白序列高度保守,与Def-1、GB44032-PA、Dl-2、Imd等蛋白存在基因互作关系,具有防御蛋白样结构域(DEFL),结构域采用以半胱氨酸稳定的α/β支架为特征的结构,亲缘关系与小蜜蜂极为相近。Def-2基因在意大利蜜蜂不同发育时期的表达水平存在差异且随日龄增大而升高,30 d的相对表达量显著高于其他日龄(P<0.05)。【结论】意大利蜜蜂Def-2蛋白属于两性不稳定蛋白,参与细胞间信号传输并维持细胞正常形态;蛋白序列高度保守,亲缘关系与小蜜蜂最近,且该基因在30 d成年期工蜂中高丰度表达,推测其可能调节免疫基因转运而影响蜜蜂的免疫识别过程。

动物饲料中转基因抗草甘膦大豆GTS40-3-2成分的检测

转基因抗草甘膦除草剂大豆GTS 40-3-2作为目前在最多国家和地区批准种植的转基因大豆,除榨取大豆油外,剩余的豆粕等副产品被用作动物饲料。通过对山西省太谷周边11个动物养殖户的饲料进行转基因标识情况专项调查,采用定性和定量PCR技术对转基因抗草甘膦除草剂大豆GTS 40-3-2含有的Ca MV35S启动子、NOS终止子、Cp4-EPSPS及大豆内标Lectin基因进行检测。结果表明:11份饲料全部含有转基因抗草甘膦除草剂大豆GTS 40-3-2成分,且其含量各不相同,其中蛋鸡饲料GTS 40-3-2转化体的含量最低,但所有饲料均无转基因标识。试验为我国转基因饲料饲用安全性评价体系提供了试验数据支持,同时也对来源于转基因作物的原材料产品的合理应用以及通过转基因饲料喂养动物所产生的农畜产品的安全性评价具有重要的现实和理论意义。

海产花鲈IGFBP-1、2基因的克隆及表达分析

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆得到花鲈的IGFBP-1和IGFBP-2基因cDNA全长序列,IGFBP-1全长1 779bp,编码248个氨基酸,IGFBP-2全长815bp,编码267个氨基酸。花鲈的IGFBP-1和IGFBP-2氨基酸序列同其他硬骨鱼类一样都包括C-端结构域、N-端结构域和多变的中央L-结构域。二者均存在18个保守的半胱氨酸残基以维持氨基酸二级结构的稳定,同时也都拥有N-端结构域的CGCCXXC-box和C-端结构域的CWCV-box,它们都是与IGF配体结合的重要结构。此外,IGFBP-2的C-端结构域还存在一个RGD结构,它能够与整合素相互作用,介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的黏附作用。利用荧光实时定量PCR技术对花鲈的脑、垂体、心脏、鳃、胃、盲肠、肠、头肾、肾脏、肝脏、性腺(雄)、脾脏和肌肉这13个组织的IGFBP-1和IGFBP-2mRNA的相对表达水平进行分析。结果显示,花鲈IGFBP-1mRNA表达量较为广泛,在肝脏中的转录水平最高,在肌肉和脾脏有较多的表达。花鲈IGFBP-2mRNA仅在肝脏中的表达水平最高,在肌肉中表达水平较高,其他组织表达量较低。

丹参2-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因克隆及表达分析

以商洛紫花丹参为材料,对其转录组序列SRA020132进行Blast分析,采用PCR技术克隆得到丹参2-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因Sm2-ODD1,GenBank登录号为JN935923。Sm2-ODD1基因全长1 365bp,包含3个外显子和2个内含子;cDNA全长1 189bp,读码框951bp,编码316个氨基酸残基;预测的编码蛋白具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶中结合2-酮戊二酸和亚铁离子的"H-T-D"、"H-X"和"R-Y-S"保守基序以及"果冻状"空间结构。表达分析显示,Sm2-ODD1在丹参各个器官都表达,但表达水平具有组织特异性,在根中表达量最高,在叶中表达量最低;该基因表达明显受到MeJA、GA3和ABA的诱导,可能参与了丹参萜类代谢下游途径。

凝血酶敏感素-2在胃癌中的表达及其临床意义

目的:探讨胃癌中凝血酶敏感素-2(thrombospondin-2,THBS2)基因表达的临床意义及其与患者临床病理特征的关系,分析THBS2基因表达与胃癌组织中微血管密度(MVD)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达水平的相关性。方法:采用实时荧光定量PCR技术检测82例配对的胃癌组织及癌旁组织THBS2 mRNA的表达,并分析其与临床病理特征的关系;应用免疫组织化学Elivision法检测胃癌组织中MMP-2表达情况,通过CD34免疫组织化学染色评价肿瘤组织MVD;分析THBS2 mRNA的表达与MVD、MMP-2表达的相关性。结果:THBS2 mRNA在胃癌中的表达高于癌旁组织(P=0.002);胃癌组织中THBS2 mRNA的表达水平与肿瘤浸润程度、MVD及MMP-2表达密切相关(P=0.023,r=0.35,P<0.01,P=0.004),但与性别、年龄、肿物大小、组织分型及淋巴结转移无关(P=0.53,P=0.53,P=0.21,P=0.84,P=0.96)。结论:THBS2可能在胃癌发生和发展中起重要的作用;THBS2可能通过调节MMP-2的表达,促进肿瘤生长与转移,但其确切的作用及机制有待进一步的研究。