结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测对菌阴空洞肺结核的诊断效能分析

目的探讨结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(Xpert)检测对菌阴空洞肺结核的诊断效能。方法选取河北省胸科医院2021年4月至2022年10月期间行手术治疗的124例肺部空洞疾病患者相关病历资料,其中菌阴空洞肺结核86例(观察组),非结核肺部空洞疾病38例(对照组)。收集患者手术标本Xpert检测和外周血结核感染T细胞斑点(T-SPOT)试验结果,分析二者对菌阴空洞肺结核的诊断效能。结果Xpert检测和T-SPOT试验诊断菌阴空洞肺结核的敏感度为68.6%、75.6%,特异度为97.4%、68.4%。Xpert检测的敏感度低于T-SPOT试验(χ^(2)=5.832,P<0.001),特异度高于T-SPOT试验(χ^(2)=21.469,P<0.001)。2种方法在观察组中的阳性检出率均高于对照组[Xpert检测:68.6%(59/86)比2.6%(1/38);T-SPOT试验:75.6%(65/86)比31.6%(12/38)](均P<0.001)。受试者工作特征曲线分析结果显示,Xpert检测诊断菌阴空洞肺结核的曲线下面积为0.830,T-SPOT试验的曲线下面积为0.729,Xpert检测的准确度高于T-SPOT试验(P<0.001)。结论Xpert检测对菌阴空洞肺结核有比较可靠的诊断效能。

荧光定量PCR技术在产前诊断中的应用效果

目的探讨荧光定量PCR(QF-PCR)技术联合染色体核型分析在产前诊断中的应用效果。方法选取2022年9月至2023年5月于惠州市第二妇幼保健院产前诊断中心行羊水穿刺检查的388例孕中期孕妇为研究对象,所有入选者均进行染色体核型分析、QF-PCR技术检查。以染色体核型分析为标准,分析QF-PCR技术在产前诊断中的应用价值。结果388例受检羊水中,QF-PCR检测出其中1例母血污染。388例受检者中QF-PCR共检出17例染色体非整倍体异常,包括21三体异常10例,18三体异常2例,13三体异常1例,性染色体异常4例。与染色体核型分析结果相符,染色体核型分析结构异常13例,QF-PCR技术均未检出。结论QF-PCR技术能鉴别母血污染以及检查快速,可弥补染色体核型分析时间长的不足;而染色体核型分析可补充QF-PCR技术对其他染色体异常检测的不足,两种方法联合使用可起互补作用,利于减少出生缺陷。

5种猪源消化道传播病原体荧光定量PCR检测方法的建立

猪源人兽共患病不仅威胁公共卫生安全,还威胁生猪养殖业的健康发展;其中消化道传播是其主要的传播途径。为及时鉴定出经消化道传播的病原体,本试验建立了猪源大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌和志贺菌的四重荧光定量PCR和戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法,并优化反应体系和条件,实现5种病原体的同时检测;并利用荧光定量PCR与普通PCR对117份猪临床样品(病变组织、粪便和肌肉等)进行对比检测。结果显示,建立的荧光定量PCR能够在1.5 h内完成对大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌、志贺菌和戊型肝炎病毒5种病原体的特异性检测,与其他常见细菌和病毒无交叉反应,检测极限值可达5个拷贝,标准曲线相关系数均不低于0.997,线性范围涵盖1×10^(1)~1×10^(9),批内和批间变异系数(CV)均低于3.16%。建立的荧光定量PCR与普通PCR方法检测结果的符合率达到95.73%~100%,具有较好的一致性。117份临床样品中大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌、志贺菌和戊型肝炎病毒各自的阳性率分别为31.62%、17.95%、6.84%、5.13%和11.11%。结果表明,本试验所建立的荧光定量PCR方法灵敏、特异、稳定,能够同时、快速区分检测上述5种猪源消化道传播病原体,可为猪肉制品从产地到餐桌全环节样品的监测提供有力的技术支持。

牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

基于高压汞灯荧光显微观测的剩余油定量分析方法

为明确不同驱油阶段微观剩余油的分布状态,指导老油田在注水开发后期的剩余油挖潜,选取典型区块不同渗透率级别的岩心进行了驱油试验,采用液氮冷冻技术制作岩心薄片并利用高压汞灯荧光显微镜,分析了饱和油阶段、水驱至模型初见水阶段和水驱结束后阶段的微观剩余油赋存状态。经过图像处理,细分了剩余油赋存状态,并计算了不同状态剩余油的赋存比例。研究表明,中渗透率岩心水驱主要动用了自由态剩余油,水驱后残存的自由态剩余油较多,可作为继续挖潜对象;低渗透率岩心水驱过程中自由态微观剩余油含量进一步减少,水驱后束缚态的膜状剩余油及半束缚态的喉道状剩余油可作为接替开发对象。高压汞灯荧光显微观测法为剩余油分析提供了一种新的量化方法,可以为老油田的剩余油挖潜提供借鉴。

水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

实时荧光定量PCR法对ICU患者痰液标本中鲍曼不动杆菌耐药基因的检测及其评价

目的研究实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法在重症监护室(ICU)患者痰液标本中检测鲍曼不动杆菌耐药基因的效果。方法选择2021年3月至2022年12月南阳市中心医院纳入的68例ICU患者进入试验,分别收集其痰液标本,通过实时荧光定量PCR法测定标本内鲍曼不动杆菌耐药基因情况,统计鲍曼不动杆菌及耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的检出率,并观察耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的药敏试验结果,最后分析OXA-51基因检查结果和耐药基因OXA-23检查结果。结果68例ICU患者的痰液标本中,通过传统培养方式检出鲍曼不动杆菌33株,阳性检出率48.53%;耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌共检出23株,阳性检出率33.82%;基因检测OXA-51阳性显示鲍曼不动杆菌有37株,阳性检出率54.41%;OXA-23阳性显示耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌有25株,阳性检出率36.76%。针对碳青霉烯类药物产生耐药的鲍曼不动杆菌所占比例占75.76%。耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌对于大部分药物耐药,耐药性较低的药物分别有头孢哌酮舒巴坦、米诺环素、替加环素、黏菌素等。传统培养和耐药基因的阳性检出率相比,差异并无统计意义(P>0.05);经Kappa检验显示为0.879,证实两种方式的检查结果的一致性较好。传统培养和耐药基因的阳性检出率相比,差异并无统计意义(P>0.05);经Kappa检验显示为0.712,证实两种方式的检查结果的一致性一般。结论实时荧光定量PCR法的效果明显,可成为鲍曼不动杆菌耐药基因检测的主要方式。

低温弱光胁迫下茄子幼苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价

为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差异情况,并运用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种计算方法评价茄子20个候选内参基因在低温、弱光、低温弱光叶片样品中的表达稳定性。结果表明:茄子20个候选内参基因荧光定量引物扩增效率(E)数值在96.8%~117.6%,相关系数(R^(2))介于0.9688~0.9999,扩增效率良好,扩增反应具有高度的专一性,引物能特异性扩增,特异性好,均为单峰,样品间扩增曲线重复性强,可用于qRT-PCR扩增。茄子20个候选内参基因C_(T)值表达丰度分析,发现茄子20个候选内参基因平均CT值在19.76~31.20。3种计算方法的综合评价分析结果显示,TBP基因在所有样本中为最稳定的内参基因。研究可为茄子低温、弱光和低温弱光胁迫下基因特异性表达研究提供了合适的内参基因。

绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据。

鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。

猪流行性腹泻病毒微芯片荧光定量RT-qPCR检测方法的建立

为了建立简便快速的猪流行性腹泻病毒(PEDV)荧光定量RT-qPCR检测方法,根据GenBank数据库公布的猪流行性腹泻病毒囊膜蛋白E基因,设计特异性引物和探针结合微芯片技术,建立微芯片荧光定量RT-qPCR检测方法。该方法除对PEDV检测为阳性外,对与其同源性较近的致病病毒的检测均为阴性;最低检测限为1 copies/μL,常规荧光RT-qPCR检测限为10 copies/μL。批内、批间重复性试验表明,Ct值变异系数均在2%以内,可对PEDV临床样本进行检测。建立的检测方法特异性好、敏感性高、检测时间短且重复性好,适用于临床检测。

在生物科学综合实验引入实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术是核酸定量分析的重要方法,是分子生物学领域的前沿技术,广泛应用于基础生物学研究、肿瘤诊断、病毒检测和食品检测等领域。在“生物科学综合实验”课程中引入此项技术,丰富了课程内容,也提高了课程的挑战度。经过教学实践,取得了良好的效果。学生不仅掌握了扎实的实践技能和前沿的科研方法,还提高了数据分析与处理的能力。

荧光定量PCR法与培养法检测解脲支原体结果比对分析

目的通过比较荧光定量PCR法(qPCR)和培养法在解脲支原体(UU)检测中的符合率,为临床解脲支原体检测方法的选择提供参考依据。方法收集近期就诊于该院112例患者的生殖道分泌物标本,分别采用qPCR法与培养法检测UU。结果在112例标本中,UU培养法阳性53例,阳性率为47.32%,qPCR法阳性61例,阳性率54.46%(χ2=1.143,P=0.285>0.05)。61例qPCR法阳性的UU浓度范围1.60×10^(3)-1.04×10^(7)copy/mL,其中10^(3)copy/mL 12例(19.7%),10^(4)copy/mL 15例(24.6%),10^(5)copy/mL 22例(36.1%),10^(6)copy/mL 9例(14.7%),10^(7)copy/mL 3例(4.9%)。培养法阴性而qPCR法阳性病例9例,qPCR法测定浓度范围10^(3)~10^(5)copy/mL。结论qPCR法检测UU的阳性率略高于培养法,两种方法不符合结果的UU测定浓度分布在10^(3)-10^(5)copy/mL之间。

荧光定量PCR仪校准技术指标及结果分析

根据不同荧光定量PCR仪器品牌的市场占有率挑选了不同型号、不同工作频率和使用年限的仪器进行校准和质量风险分析,重点针对温度示值误差、温度均匀度、样本重复性和样本线性四个技术指标作了检测和比较,探讨了这四个技术指标出现偏差可能造成的检测结果失准的风险,并对仪器生产厂商和仪器使用者提出了建议。通过分析评估得出了该类仪器应该重点关注的技术参数指标和技术难点,为仪器使用者了解该产品的质量状况及相关政策措施的制定提供了参考依据。

基于牛结节性皮肤病病毒ORF61基因荧光定量检测方法的建立

基于国内流行的牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)的基因组序列,建立了靶向ORF61基因的MGB探针荧光定量PCR检测方法。本研究基于LSDV基因序列设计出带有MGB探针的特异性荧光定量PCR引物,并进行特异性和灵敏性筛选验证。最终,筛选得到靶向于LSDV ORF61基因的一对qPCR引物;利用pCAGGS-ORF61真核表达质粒,获得标准曲线y=-3.287 5x+47.87,线性相关系数R^(2)=0.998 6,扩增效率达101%;荧光定量PCR特异性、重复性和灵敏性试验结果表明,该引物的特异性高、重复性良好和灵敏度高等优点;该引物的最低检测限为6.71拷贝·μL^(-1),各批次内与批次间重复性结果的变异系数均小于2%。以上结果表明,作者建立特异性LSDV的荧光定量PCR检测方法,为LSD预防和控制提供有效的检测手段。

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

牛支原体和丝状支原体丝状亚种双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病均为重要的牛传染病,两者均可致牛出现呼吸系统症状,临床上难以区分。为建立鉴别诊断牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病的双重Taq Man荧光定量PCR检测方法,本研究根据这两种病的病原丝状支原体丝状亚种和牛支原体的基因组保守区域(丝状支原体丝状亚种nt826-nt1742,牛支原体nt189-nt618)分别设计引物与探针,通过优化反应体系与反应条件,建立同时检测这两种病原的Taq Man荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法仅对丝状支原体丝状亚种模拟样品和牛支原体检测结果为阳性,而巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、关节炎支原体Leachii株检测结果均为阴性,特异性较强。分别以1.0×10~7拷贝/μL~1.0×10~1拷贝/μL的p EASY-Mmm和p EASY-Mb质粒标准品为模板,进行敏感性试验,结果显示,该方法对丝状支原体丝状亚种和牛支原体重组质粒标准品的检测限均为1.0×10~1拷贝/μL,敏感性较高。对不同浓度质粒标准品混合物的重复性试验结果显示,组内与组间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法对112份临床样品(104份鼻拭子、8份肺组织样品)检测,结果显示,丝状支原体丝状亚种检测结果和已发表PCR方法检测结果一致,均为阴性,而本实验建立的方法检测出4份牛支原体阳性样品,且经测序证实检出样品为真实阳性样品,而已发表的多重PCR方法检测该病原结果均为阴性。本研究建立了能够同时检测丝状支原体丝状亚种和牛支原体的双重Taq Man荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性好,可用于各种临床样品的检测,为这两种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。

大口黑鲈弹状病毒Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立快速、敏感的大口黑鲈弹状病毒(MSRV)流行株Taq Man荧光定量PCR (qPCR)方法,本研究采用NCBI分析MSRV流行株N基因的保守序列,设计特异性引物和Taq Man探针,以构建的并经PCR和测序鉴定正确的重组质粒标准品p MD18-MSRV-N为模板,通过优化各反应条件初步建立MSRV的Taq Man q PCR检测方法。结果显示,建立的Taq Man q PCR方法标准曲线的R2为0.9906,质粒标准品在6.79×10^(8)拷贝/μL~6.79×10^(2)拷贝/μL范围内与Ct值均存在较好的线性关系。采用该方法检测MSRV及相关病毒,评估该方法的特异性,结果显示,该方法可以特异性检测MSRV,而草鱼出血病病毒、神经坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、大口黑鲈双RNA病毒、鳜蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、石斑鱼虹彩病毒、大口黑鲈蛙虹彩病毒等8种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;采用建立的方法检测不同浓度的质粒标准品(6.79×10^(8)拷贝/μL~6.79×10^(1)拷贝/μL),评估该方法的敏感性,结果显示,该方法的检测限为6.79×10^(2)拷贝/μL,比文献中的常规PCR方法敏感1 000倍;以不同批次或同一批次提取的不同浓度的质粒标准品作为模板,分别利用该方法检测,评估该方法的重复性,结果显示,该方法批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。采用该方法和文献中的常规PCR同时检测71份临床发病的大口黑鲈、鳜鱼、鲮鱼组织样品,结果显示阳性率为16.9%(12/71),阴性率为83.1%(59/71),且阳性样品均是从发病大口黑鲈的组织样品中检测到,而发病的鳜鱼、鲮鱼组织样品中均未检测到该病毒;常规PCR方法的阳性率为9.9%(7/71),阴性率为90.1%(64/71),二者的总符合率为93.0%。本研究建立的MSRV Taq Man q PCR方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性均较好,可用于大口黑鲈临床样品的检测,为MSRV的快速检测提供了可行的技术手段。

数字PCR和荧光定量PCR检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数方法的建立及其应用

传统的检测转基因植物中外源基因拷贝数的方法是Southern杂交,该方法成本高、周期长,难以满足高通量检测外源基因拷贝数的育种需求,因此,本研究旨在建立快速且高通量检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法。本研究从番木瓜基因组中筛选出2个单拷贝基因Cpa03g018830和Cpa03g018770,以已知外源基因为单拷贝整合的转基因番木瓜为参照,利用数字PCR鉴定其拷贝数,进一步以其为内参基因,以番木瓜转基因育种常用的筛选标记基因NPTⅡ为外源目的基因,建立利用数字PCR和荧光定量PCR技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法。结果表明:Cpa03g018830和Cpa03g018770均为单拷贝基因;建立的数字PCR方法对转基因番木瓜中的外源基因拷贝数的检测准确可靠,而荧光定量PCR对转基因番木瓜中外源基因单低拷贝整合的检测准确度较高,对外源基因多拷贝整合的检测准确度则较低,因此,荧光定量PCR适合用来在大量转基因植株中初筛出单低拷贝整合的植株。本研究鉴定的单拷贝基因Cpa03g018830和Cpa03g018770可作为转基因番木瓜中外源基因拷贝数检测的内参基因,且建立的利用数字PCR和荧光定量PCR技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法,操作简单,速度快,适合批量检测,可为番木瓜转基因抗病育种中单低拷贝株系的选育提供新的方法。

牛结节性皮肤病病毒荧光定量PCR方法的建立与应用

为了建立牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的快速诊断方法,本试验依据LSDV GCPR基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速诊断LSDV的荧光定量PCR方法。结果表明,建立的LSDV荧光定量PCR方法在3.67×10^(1)~3.67×10^(7) copies/μL拷贝标准品间具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9905;该方法具有良好的敏感性,其检测病毒系列含量下限为3.67×10 copies/μL;该方法特异性良好,与山羊痘病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒等病毒不存在交叉反应;该方法重复性较好,批内和批间的变异系数均介于0.133%~1.81%。该方法,临床样品的检测符合率达90%。本试验所建立的LSDV荧光定量PCR方法为临床诊断牛结节性皮肤病提供了一种快速、灵敏的检测方法,为LSDV流行病学调查和监测提供了技术支持。