沙门氏菌荧光实时定量PCR检测试剂的研制及应用

荧光实时定量PCR技术是近年来广泛应用于沙门氏菌快速检测的现代方法之一,本研究建立了检测沙门氏菌快速、敏感、特异以及准确定量的FQ-PCR方法。采用沙门氏菌fimY基因序列,设计特异引物和探针,通过对Taq酶、Mg2+和引物探针浓度等反应体系和条件的优化,然后进行特异性和适用性实验。最优化结果为:Taq酶用量2.5U;Mg2+浓度为3.75×10-3mol/L;引物浓度为0.65×10-6mol/L,探针浓度为0.30×10-6mol/L;循环条件为step1:95℃2min,step2:95℃5s,60℃40s,40cycles。结果表明该FQ-PCR检测试剂具有快速、简单、灵敏度高、特异性强和适用范围广等优点,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等领域。

鸭病毒性肠炎病毒荧光实时定量PCR检测方法的建立和应用

根据已发表的鸭病毒性肠炎病毒(DEV)基因保守序列设计TaqMan探针,建立了检测 DEV的荧光实时定量PCR方法,用该法对DEV在鸭胚成纤维细胞(DEF)中的增殖进行了检测。结果显示,DEV接种DEF 22 h后开始释放,第50 h病毒在细胞和上清中的含量增幅均为1×103 左右,病毒主要存在于细胞中,其含量是上清的1×102-1×103倍。

荧光实时定量PCR方法检测猪链球菌2型

以猪链球菌2型的荚膜多糖抗原编码基因cps2J为靶基因设计引物,利用SYBR GreenⅠ能特异地与双链DNA结合发出荧光的特性,以ABI7000为平台,建立荧光实时定量PCR检测猪链球菌2型的方法。该方法检测猪链球菌2型参考株和猪链球菌2型国内分离株都呈阳性,具有良好的特异性。整个检测过程于2h内完成,检测限度为24CFU,标准曲线的相关系数为0.997。对5份采集于猪链球菌2型病猪的病料进行检测,结果表明肝脏和脾脏最适于检测。

荧光实时定量PCR检测尼罗罗非鱼GH、GHR、IGF-Ⅰ基因方法的建立及初步应用

为了准确分析尼罗罗非鱼生长激素(growth hormone,GH)、生长激素受体(growth hormone receptors,GHRs)和胰岛素样生长因子I(Insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)在早期发育阶段的作用,实验设计了尼罗罗非鱼GH、GHR、IGF-Ⅰ基因的特异性引物,提取垂体或肝脏总RNA并扩增出目的片段,将PCR产物克隆到pGEM-TEasy载体,经质粒PCR扩增、酶切和测序鉴定重组质粒,构建标准曲线等,成功建立了GH、GHR、IGF-Ⅰ基因荧光实时定量PCR检测方法。运用建立的荧光实时定量PCR检测了尼罗罗非鱼GH、GHR和IGF-Ⅰ基因表达的发育性变化。结果表明在早期发育阶段,尼罗罗非鱼GH与IGF-Ⅰ,GHR1与GHR2的mRNA表达存在一定的互补关系;GH的表达与GHR1的表达呈显著正相关,提示GH与IGF-Ⅰ,GHR1与GHR2在尼罗罗非鱼早期发育的不同阶段起主导作用,且GH可能主要通过与GHR1的结合起作用。

SYBR荧光实时定量PCR检测非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平

目的:建立荧光实时定量PCR技术,检测非小细胞肺癌组织与外周血RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平。方法:分别构建RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin质粒标准品,以SYBR荧光实时定量PCR分析,制备标准曲线,对非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin的mRNA进行检测。结果:标准曲线呈良好的线性关系。标准品的熔解曲线均呈单峰,特异性良好,说明基本无非特异性扩增。结论:所建SYBR荧光实时定量PCR方法操作简便,费用低,特异性好,准确度、灵敏度高,为后续研究构建了理想的平台。

应用荧光实时定量PCR方法检测重组慢病毒滴度及其感染效率

慢病毒载体已经广泛应用于动物模型中基因治疗的研究和转基因动物的制备,而准确地测定重组慢病毒的滴度和感染效率是其关键步骤.通过荧光实时定量PCR的方法定量分析重组慢病毒的颗粒数以及病毒的活性滴度,并以GFP报告基因的方法作为对照来验证定量PCR方法的准确性.研究结果显示,应用荧光实时定量PCR法与GFP报告基因法测定得到的病毒活性滴度成正相关,而且前者可以更加准确地测定病毒滴度和病毒感染效率.

铜绿假单胞菌荧光实时定量PCR标准品的构建

构建了荧光实时定量PCR标准品以检测水中的铜绿假单胞菌。利用所报道的铜绿假单胞菌gyrA基因为目的基因设计引物,通过培养细胞,煮沸法裂解细胞后做PCR,电泳,胶回收,然后与pMD19-TVector连接并转化到感受态大肠杆菌中;氨苄青霉素筛选出白色菌落,菌落PCR及测序鉴定其特异性,根据OD值确定浓度,制备梯度浓度参考标准品,制作标准曲线,检测水样品中铜绿假单胞菌的菌量。

荧光实时定量PCR检测单核李斯特菌方法学建立及应用

目的建立检测单核细胞增多性李斯特菌的荧光定量PCR方法,并利用此方法检测人工污染的牛奶中单增李斯特菌菌量。方法选择单增李斯特菌特异性的基因ListeriolysinO基因为靶目标设计引物,采用煮沸法抽提纯单增李斯特菌株(1/2a)DNA,建立SYBRGREEN实时定量PCR检测体系。结果定量PCR对李斯特菌可产生特异扩增信号,对其他菌(大肠杆菌)无响应。标准曲线的相关系数为0.9521。最小检菌量约为100个菌落形成单位/反应体系。在人为污染牛奶检测中,与传统细菌计数方法结果相比,相关系数为0.839。结论实时定量PCR是一种快速、灵敏的定量检测单增李斯特菌的方法,可用于牛奶样品的检测。

荧光实时定量PCR技术及其在水产养殖研究中的应用

荧光实时定量PCR技术是近年来快速发展起来的一门新技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)和PCR技术的有机结合。与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高、能较准确定量等特点。本文综述了荧光实时定量PCR技术的基本原理及几种广泛应用的荧光化学方法,并概述了荧光实时定量PCR技术在水产养殖研究领域的应用现状,并对荧光实时定量PCR技术的应用前景进行了展望。

甲基化DNA免疫沉淀-荧光实时定量PCR检测人精浆游离DNA睾丸和附睾特异性甲基化启动子

目的:建立检测精浆游离DNA(cfsDNA)启动子甲基化水平的甲基化DNA免疫沉淀-荧光实时定量PCR(MeDIP-qPCR)方法。方法:提取精液参数正常(6例)和输精管结扎(6例)男性的cfsDNA,将两组不同个体的cfsDNA分别进行混合,超声处理后形成DNA片段,通过MeDIP分离甲基化DNA片段,然后用qPCR方法检测启动子甲基化水平。结果:精液参数正常组的PRAME、PEG10、MORC1、GML、HOXA5、DNMT3L、SNURF、MSH4、DAZ1和CLPB启动子甲基化水平分别为14.93%、2.64%、0.69%、2.66%、17.50%、21.10%、5.98%、2.28%、13.50%和3.86%,明显低于输精管结扎组的121.25%、73.62%、16.25%、42.90%、76.74%、112.40%、59.79%、25.85%、91.90%和64.53%。其中,PRAME、MORC1、GML、HOXA5、DNMT3L、SNURF、MSH4和DAZ1等8个启动子MeDIP-qPCR的检测结果与启动子甲基化芯片结果一致。结论:通过MeDIP-qPCR方法可以定量检测到cfsDNA中的特异性启动子甲基化,为确定cfsDNA中睾丸和附睾特异性甲基化启动子提供了有效途径。

荧光实时定量PCR检测紫花苜蓿DREB基因的方法

建立一种简便、快速、有效的检测紫花苜蓿DREB基因表达水平的荧光实时定量PCR方法.优化检测DREB基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测体系.运用建立的优化体系检测了低温处理后紫花苜蓿DREB基因表达情况.

应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测TGF-β1诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞中PAI-1mRNA表达

目的应用SYBR荧光实时定量RT—PCR法检测转化生长因子-β1（transforming growth factor betal，TGF-β1）诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblasts，KFS）中纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor1，PAI-1）mRNA的表达。方法体外分离培养KFs，应用不同浓度（1．25～20pmol·L-1）TGF-β1刺激KFs3h或TGF-β1（10pmol·L-1）刺激KFs不同时间（0．5～6h），采用SYBRGreenI荧光实时定量RT—PCR法检测，以B—actin基因作为内参，计算各组PAI-1mRNA的相对表达量。结果与空白对照组相比，TGF-β1能明显诱导KFs中PAI-1mRNA的表达，10、20pmol·L-1浓度组表达比值分别增至4．19及4．44倍（P〈0．01）；TGF-β1（10pmol·L。）的1、2h时问组表达比值分别增至2．29及2．41倍（P〈0．05），3、6h时间组分别增至4．19及5．83倍（P〈0．01）。提示，TGF-β1诱导KFs中PAI=1mRNA表达的最适浓度为10pmol·L-1、最适时间为3h。结论利用SYBR荧光实时定量RT—PCR法检测TGF-β1诱导KFs中PAI-1mRNA的表达，为进一步研究瘢痕疙瘩中TGF-β1信号通路的靶基因调控机制，以及开发治疗瘢痕疙瘩的新药提供了基础。

荧光实时定量PCR检测线粒体DNA氧化损伤方法初探

目的体外构建DNA氧化损伤模型,荧光实时定量PCR检测线粒体DNA氧化损伤。方法体外应用亚甲蓝联合可见光(MBL)方法建立DNA氧化损伤模型,通过8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)特异性切割氧化损伤位点8-羟基鸟嘌呤(8-oxoG),运用荧光实时定量PCR法检测不同比例混匀的OGG1酶切与未酶切的DNA氧化损伤模板。结果成功构建体外氧化损伤DNA模型,OGG1酶能特异切割氧化损伤位点;OGG1酶切DNA在定量PCR体系模板中所占比例,与线粒体DNA编码基因COⅡ扩增Ct值呈正相关。结论自制OGG1酶具有良好的生物活性,可以联合荧光实时定量PCR检测DNA氧化损伤。

荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌外膜蛋白oprI基因的标准品的构建

目的构建荧光实时定量PCR(FQ-PCR)标准品测定铜绿假单胞菌oprI基因,以此测定铜绿假单胞菌菌量。方法以铜绿假单胞菌的oprI基因为目的基因设计探针引物,提取细菌基因组DNA,与pMD 18-T Vector连接并转化到大肠杆菌中。用氨卞青霉素筛选出白色菌落,提取含目的基因质粒,并用HindⅢ限制酶进行线性化处理,通过直接PCR、OD值测定及DNA片段测序鉴定其特异性。根据OD值确定浓度,制备FQ-PCR梯度浓度参考标准品,做出标准曲线,检测各样品菌菌量。结果铜绿假单胞菌oprI基因的目的片段成功制备,获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性,并获得很好的标准曲线(相关系数0.994),成功检测了铜绿假单胞菌标准菌株、培养株的菌量,而大肠杆菌及阴性对照无扩增。结论成功构建FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprI基因的定量参考标准,荧光实时定量法可以快速检测铜绿假单胞菌。

SYBR荧光实时定量PCR检测NSCLC中ERCC1基因表达

目的:建立检测核苷酸切除修复基因ERCC1 mRNA的SYBR GreenI实时定量PCR的方法,了解肺癌组织及其癌缘肺组织中ERCC1的表达水平,研究肺癌组织中ERCC1的表达水平与各种临床病理特征之间的关系。方法:应用SYBR荧光实时定量PCR(Real-time PCR)技术检测30例肺癌组织和离肿瘤边缘5cm处正常癌旁组织中的ERCC1 mRNA表达水平,同时分析ERCC1表达水平在不同肺癌临床分期和病理类型各组间的关系。结果:肺癌中ERCC1 mRNA的表达(5.16±2.51)低于正常癌旁组织(11.17±4.79)(P<0.05)。但在不同肺癌临床分期、组织类型各组之间差异均无统计学意义。结论:所建立的SYBR GreenI实时定量PCR方法可以成功地检测ERCC1基因的表达量。

荧光实时定量PCR检测前列腺癌抗原3评分方法的建立

目的前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3,PCA3)基因表达具有前列腺癌特异性,文中建立荧光实时定量PCR(FQ-RT-PCR)检测PCA3评分的方法。方法分别以LNCap和PC-3细胞株为阳性和阴性对照,用TaqMan探针建立检测PCA3和前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)mRNA的荧光实时定量PCR方法,评价特异性、重复性和计算扩增效率,建立PCA3评分计算公式。结果检测PCA3和PSA mRNA的批内变异系数分别为1.19%、1.09%、0.84%和0.06%、0.71%、0.79%,批间变异系数分别为1.03%和0.56%;扩增效率分别为0.98和1.00;以2-ΔCt表示PCA3评分。结论荧光实时定量PCR检测PCA3评分方法的特异性好,重复性高。

一种牛肉检测的荧光实时定量方法研究

[目的]开发一种用于牛源性成分检测的荧光实时定量检测方法。[方法]通过序列比对后,以牛源性线粒体DNA中cytb基因为模板,设计特异性的引物和探针,并以不同来源的DNA为模板,分析引物和探针的特异性。对牛源性DNA进行梯度稀释后,分析不同浓度下扩增曲线,分析检测方法的灵敏度。以牛源性DNA稀释液为模板,进行10个平行扩增试验,分析检测方法的精密度。[结果]该研究所用的引物和探针对牛源性DNA具有明显的扩增曲线,而对非牛源性(鸡、鸭、猪、人)DNA模板不进行扩增。灵敏度分析结果显示,该检测方法对浓度仅为24.4 pg/μL牛源性DNA模板仍进行阳性扩增。精密度分析显示,10个平行试验扩增曲线相似,Ct值的标准差(SD)仅为0.41,精密度(CV)也仅为1.6%。[结论]该研究开发的牛肉成分检测的荧光实时定量方法特异性高,仅对牛源性DNA发生扩增。同时该方法灵敏度也很好,检出限为24.4 pg/μL,精密度也很高,重复性良好,适用于市场上肉制品中牛源性成分的检测。

荧光实时定量PCR检测老年人外周血淋巴细胞β_1和β_2肾上腺素能受体基因mRNA表达

目的建立荧光实时定量PCR法检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体（AR）基因mRNA表达。方法随机选择ASAⅠ-Ⅱ级老年患者30例，分离外周静脉血淋巴细胞，采用荧光实时定量PCR法检测β1和β2-AR基因mRNA表达，并与半定量PCR检测结果进行比较。结果30例患者外周血淋巴细胞荧光实时定量PCR均检出β1和β2-ARmRNA表达，不同性别组同-基因表达量无显著差异（P〉0.05）；荧光实时定量PCR检测β2-AR mRNA表达量显著高于β1—AR mRNA（P〈0．001），而半定量PCR随着循环次数增加，β1和β2-ARmRNA表达差异减小。结论所建立的荧光实时定量PCR成功检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2-AR基因mRNA表达，有较高的灵敏性及特异性；半定量PCR扩增平台期影响试验结果判断。

应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测BMSCs诱导大鼠肝星状细胞中DR5 mRNA表达

目的应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞(BMSCs)对大鼠肝星状细胞(HSCs)的死亡受体5(DR5)mRNA表达的影响,探讨BMSCs诱导HSCs凋亡及其机制。方法采用贴壁筛选法培养、纯化SD大鼠BMSCs,传至第4代使用;大鼠原代HSCs细胞及肝纤维原细胞系冻融后传代使用。应用6孔塑料培养板,建立上下双层细胞共培养体系,常规培养。实验分为3组:(1)实验组:BMSCs与HSCs共培养;(2)空白对照组:HSCs单独培养;(3)阴性对照组:大鼠肝纤维原细胞与HSCs共培养。以上培养体系动态观察24、48、72h,应用流式细胞仪检测HSCs细胞凋亡率,采用SYBR Green I荧光实时定量RT-PCR法检测,以β-actin基因作为内参,计算各组DR5mRNA的相对表达量。结果在共培养组中,BMSCs促进了HSCs凋亡,与其他两组比较差异有显著统计学意义(P<0.01),空白对照组与阴性对照组比较无统计学意义(P>0.05)。实验组BMSCs能明显上调HSCs中DR5mRNA的表达,与空白对照组和阴性对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.01);空白对照组与阴性对照组DR5mRNA的表达比较无统计学意义(P>0.05)。结论利用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测BMSCs诱导大鼠肝星状细胞中DR5mRNA表达,为进一步研究BMSCs通过死亡受体途径调控HSCs凋亡以及为BMSCs用于治疗肝纤维化的机制研究提供了理论基础。