荧光实时逆转录PCR定量研究进展

荧光实时逆转录PCR广泛应用于稳态mRNA水平的定量 ,并且它已经成为基础研究、分子医学和生物技术的一种必不可少的实验工具。用此技术定量具有范围宽、敏感性高、精确度高 ,无PCR后处理步骤 ,避免了交叉污染 ,且产出率高 ,可以进行多重检测等特点。然而要成功地应用该技术并不是一件容易的事。现对方法学建立、扩增效率以及标准化等方面作一综述。

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测结肠癌中Syndecan-1 mRNA和HPA-1 mRNA的表达及临床意义

背景与目的:侵袭转移是导致结肠癌死亡率增加的主要原因,如何阻断肿瘤的侵袭转移成为目前研究的热点。本研究旨在检测Syndecan-1基因和HPA-1基因在结肠癌组织中的表达水平,探讨二者与结肠癌侵袭转移及预后的关系。方法:用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测49例结肠癌、49例配对的癌旁组织(距癌2cm)和49例配对远离结肠癌的手术切缘正常组织(距癌5cm以上)的Syndecan-1和HPA-1基因的表达水平,分析二者与结肠癌临床病理特征的关系。结果:结肠癌中HPA-1mRNA的表达水平(40.56±11.75)显著高于癌旁组织(18.28±11.33)和正常组织(10.80±10.20)(P均<0.001),癌旁组织明显高于正常组织(P<0.05);正常结肠组织中Syndecan-1mRNA表达水平(61.21±12.96)显著高于癌旁组织(14.35±11.06)和结肠癌组织(10.12±8.58)(P均<0.001),癌旁组织明显高于结肠癌组织(P<0.05)。Syndecan-1mRNA的表达减弱和HPA-1的表达增强与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期显著相关(P均<0.05)。Spearman等级相关分析证明了Syndecan-1mRNA和HPA-1的表达呈明显负相关(r=-0.405,P<0.05)。结论:Syndecan-1mRNA在结肠癌组织中呈低表达,HPA-1mRNA在结肠癌组织中呈高表达,且Syndecan-1mRNA的表达减弱与HPA-1的表达增强可促进结肠癌的侵袭转移。联合检测Syndecan-1mRNA及HPA-1mRNA对于指导结肠癌临床治疗及判断预后有重要价值。

实时荧光定量RT-PCR检测结直肠癌中外周血端粒酶逆转录酶mRNA的表达及其临床意义

目的:建立外周血端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达量检测的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)系统,检测结直肠癌患者hTERT mRNA的表达并探讨其对结直肠癌微转移的诊断价值.方法:用实时荧光定量RT-PCR技术检测53例结直肠癌患者和21名健康人的外周血标本hTERT mRNA表达情况,分析其表达与肿瘤临床病理特征的关系并应用接受者操作特征曲线(ROC曲线)分析hTERT mRNA检测对结直肠癌的诊断价值.结果:结直肠癌组外周血hTERT mRNA表达水平显著高于正常对照组(t'=7.953,P<0.05),其表达与肿瘤淋巴结转移、血行转移和TNM分期相关(t'/t=2.334,2.149,2.460,均P<0.05).hTERT mRNA诊断结直肠癌的ROC曲线下面积0.91,诊断界值为Ct≤32.结论:应用实时荧光定量RT-PCR技术克服了传统PCR只能定性检测而不能定量检测的缺点;外周血hTERT mRNA可作为诊断结直肠癌微转移的标记物.

建立实时荧光定量逆转录PCR方法检测非小细胞肺癌棘皮动物微管相关蛋白4-间变淋巴瘤激酶融合基因

目的建立一种实时荧光定量逆转录PCR方法,对非小细胞肺癌间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因进行快速、敏感和特异检测。方法首先,应用Primer Premier 5.0软件,针对棘皮动物微管相关蛋白4(EML4)-ALK常见融合变异V1、V2、V3a和V3b设计引物和Taqman水解探针。然后,以包含EML4-ALK融合变异V1、V2、V3a和V3b的假病毒颗粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性和特异性。最后,用所建立的方法检测50例非小细胞肺癌临床标本,其中包含3例ALK-荧光原位杂交(FISH)(+)样本。结果在无背景RNA干扰情况下,建立的实时荧光定量逆转录PCR方法检测灵敏度高达10拷贝/!l。在500拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达1%,在5000拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达0.5%。对于检测特异性,以正常人白细胞及血浆RNA为研究对象,均未见非特异性扩增。对50例非小细胞肺癌临床标本进行检测,47例阴性标本检测均为阴性,3例ALK-FISH(+)标本2例检测阳性,1例未检出,未检出原因与标本RNA提取失败有关。结论本研究建立的实时荧光定量逆转录PCR方法是一种快速、简便以及具有高灵敏度和特异性的EML4-ALK融合基因检测方法,值得在临床进一步验证和推广。

逆转录实时荧光定量PCR检测p73 mRNA在结肠癌的表达

目的:建立一种实时定量PCR方法检测p73mRNA的表达水平,探讨其与结肠癌发生、发展的可能关系。方法:采用SYBRGreenⅠ逆转录实时荧光定量PCR检测39例结肠癌组织和其癌旁组织中p73mRNA的表达。结果:p73基因在结肠癌肿瘤组织的表达水平高于其在癌旁组织的表达(P<0.01);表达水平与肿瘤的恶性程度、分化及淋巴结转移显著相关(P<0.05)。结论:p73的高表达可能与结肠癌的发生、发展及预后有联系。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法 ,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份,好=8.1,P<0.005。结论 通过该实验,验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3mRNA表达水平

目的采用SYBR Green I实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,建立检测前列腺癌抗原3(DD3)mRNA的标准,定量检测人体不同组织中该基因的表达水平。方法从LNCaP细胞中采用RT- PCR法扩增特异性DD3基因片段,将其与pMD18-T载体连接,转化宿主菌JM109,对质粒标准进行聚合酶链反应(PCR)检测及测序。纯化后检测质粒拷贝浓度,制备梯度浓度标准品。应用LightCycler荧光定量PCR仪对标准品进行检测。取正常人乳腺组织、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢、正常前列腺组织、前列腺增生及前列腺癌组织,定量检测DD3 mRNA表达。结果建立稳定的检测DD3 mRNA的标准,正常人乳腺、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢中无DD3 mRNA表达,在正常前列腺及前列腺增生组织中低表达,两者间差异无显著性 (P>0．05);在前列腺癌中高表达(P<0．05)。结论应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR技术检测 DD3 mRNA表达水平简便、可行、经济。DD3基因的表达具有良好的前列腺癌特异性。

实时RT-PCR检测人端粒酶逆转录酶mRNA用于乳腺癌鉴别诊断及与c-Myc基因的相关性

目的探讨定量检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA在乳腺癌鉴别诊断中的价值,并观察原癌基因c-Myc与hTERT mRNA表达的关系。方法收集癌旁正常乳腺组织、乳腺普通型导管增生、不典型导管增生、导管原位癌、浸润性导管癌病例,采用实时荧光定量RT-PCR技术(Real-ti me RT-PCR)定量检测hTERT和c-Myc基因的转录水平。结果以NhTERT=10为临界值,所有正常组织和良性病变NhTERT值均小于临界值,而hTERT基因转录升高的导管原位癌及浸润性导管癌其NhTERT值均大于此临界值。显示hTERT和c-Myc基因转录水平呈正相关(γ=0.7395,P<0.01)。结论实时荧光定量PCR技术检测hTERT基因表达具有高敏感性和特异性,能为常规病理学诊断提供客观的参考指标,从而提高乳腺不典型导管增生与导管原位癌鉴别诊断的准确性。原癌基因c-Myc转录水平上调可能与乳腺癌hTERT基因转录激活有关。

结直肠癌患者外周血人端粒酶逆转录酶mRNA和MUC1 mRNA的检测及其临床意义

背景:传统影像学检查和血清肿瘤标记物检测对结直肠癌微转移的诊断价值有限。目的:检测结直肠癌患者外周血人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA和MUC1 mRNA表达,探讨两者对结直肠癌微转移的诊断价值。方法:收集53例结直肠癌患者和21名健康人的外周血标本,以实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTERT mRNA和MUC1 mRNA表达,分析两者表达与肿瘤临床病理特征的关系。应用接受者操作特征曲线(ROC曲线)分析hTERT mRNA、MUC1 mRNA和两者联合检测对结直肠癌的诊断价值。结果:结直肠癌组外周血hTERT mRNA和MUC1 mRNA表达率和表达水平显著高于正常对照组(P<0.05),两者表达与肿瘤淋巴结转移、血行转移和TNM分期相关(P<0.05)。hTERT mRNA、MUC1 mRNA和两者联合检测诊断结直肠癌的ROC曲线下面积分别为0.806、0.778和0.861,诊断界值为Ct<32。结论:外周血hTERT mRNA和MUC1 mRNA可作为诊断结直肠癌微转移的标记物,以实时荧光定量RT-PCR联合检测两项指标优于单项检测。

猪流行性腹泻病毒微芯片荧光定量RT-qPCR检测方法的建立

为了建立简便快速的猪流行性腹泻病毒(PEDV)荧光定量RT-qPCR检测方法,根据GenBank数据库公布的猪流行性腹泻病毒囊膜蛋白E基因,设计特异性引物和探针结合微芯片技术,建立微芯片荧光定量RT-qPCR检测方法。该方法除对PEDV检测为阳性外,对与其同源性较近的致病病毒的检测均为阴性;最低检测限为1 copies/μL,常规荧光RT-qPCR检测限为10 copies/μL。批内、批间重复性试验表明,Ct值变异系数均在2%以内,可对PEDV临床样本进行检测。建立的检测方法特异性好、敏感性高、检测时间短且重复性好,适用于临床检测。

实时荧光RT-PCR在人感染H7N9禽流感病毒检测中的应用

目的评估实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测H7N9禽流感病毒的应用效果,为人感染H7N9禽流感监测和防控提供可靠的实验室检测数据。方法采集各级医疗单位人感染H7N9禽流感监测及可疑病例标本137例,同时使用4种实时荧光RT-PCR试剂分别检测上呼吸道标本和下呼吸道标本中H7N9禽流感病毒核酸。结果 H7N9禽流感病毒核酸阳性率为3.65%(5/137);H7N9禽流感病毒核酸阳性标本中上呼吸道标本检出率为60%(3/5),下呼吸道标本检出率为100%(3/3)。4种试剂符合率为100%。结论实时荧光RT-PCR能有效检出H7N9禽流感病毒核酸,检测下呼吸道标本有助于提高阳性检出率。

兔出血症病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种敏感、特异、简便的兔出血症病毒(RHDV)检测方法,根据GenBank中公布的RHDV全基因组序列保守区域设计了2对引物,筛选了其中1对建立并优化了PCR条件,扩增产物为331bp,并基于此建立了SYBR GreenⅠ荧光染料real-time RT-PCR检测方法。通过敏感性、特异性、标准曲线建立等表明,该方法可检出101以上拷贝数的模板,只在RHDV有特异性扩增,标准曲线线性相关性好。实际应用结果显示,该方法对疑似RHDV病料检测的阳性率为74.8%,而普通RT-PCR方法检测的阳性率为65.5%。该方法的建立为开展该病的诊断、疫苗制备质控等提供了有效的技术保障。

实时荧光RT-PCR快速检测肠道病毒RNA及其临床意义

目的应用实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法快速检测肠道病毒RNA,为手足口病的早期诊断提供临床依据。方法采用实时荧光RT-PCR法检测手足口病患儿粪便、脑脊液中肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A组16(CA16)和肠道病毒71型(EV71)RNA。结果 234份粪便标本中肠道病毒通用型阳性214例,检出率为91.45%;CA16阳性56例,阳性率为23.50%;EV71阳性87例,阳性率37.17%,其中有4例同时检出CA16和EV71。2份脑脊液标本中3种肠道病毒核酸结果均为阴性。结论实时荧光RT-PCR能对肠道病毒RNA进行快速检测,为手足口病的早期诊断提供诊断依据,并对手足口病患儿的病情分析、治疗及预后观察起到指导作用。

检测戊型肝炎病毒核酸的实时荧光聚合酶链反应法的建立

目的建立一种能快速、敏感地检测戊型肝炎病毒(HEV)核酸的实时荧光聚合酶链反应法(Real-timeRT-PCR)。方法基于HEVORF3保守区序列,设计引物和探针,从22对引物和4条探针中进行筛选,并对选出的引物和探针的浓度、反应体系、反应条件、核酸抽提方法等进行优化。采用常规套式RT-PCR和本研究建立的实时荧光RT-PCR检测不同样品,比较两种方法的特异性和敏感性。结果优化出1对引物和探针的组合。优化的30μl反应体系中,上、下游引物浓度均为0.10mmol/L,探针浓度为0.20mmol/L,Taq酶的浓度为3U,AMV逆转录酶浓度为2U。优化的反应条件为:50℃30min;95℃3min;95℃10s,50℃30s,72℃60s,5个循环;95℃10s,57℃40s,40个循环。初步检测结果显示,该方法与常规套式RT-PCR特异性符合率为100%,两种方法检测HEV1型样品的敏感性均为104,检测人和猪的HEV4型样品时,实时荧光RT-PCR敏感性均为104,明显高于常规套式RT-PCR的103和102。结论所建立的检测HEV核酸的实时荧光聚合酶链反应法具有简便、快速、敏感性较高以及不易被污染等优点,具有一定的临床应用潜力。

实时荧光定量PCR测定食管癌VEGF-C和VEGFR-3基因表达

目的建立测定血管内皮生长因子-C（VEGF-C）mRNA和血管内皮生长因子受体-3（VEGFR-3）mRNA的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-RT-PCR）,探讨其在食管癌组织及其癌旁组织中的表达水平。方法分别以自行构建和克隆的pMD18-VEGF-C和pMD18-VEGFR-3质粒作为定量模板,用循环阈值（Ct）定量起始的模板,在荧光TaqMan方法的基础上建立了测定VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的实时FQ-RT-PCR,并分别测定了40例食管癌组织及其癌旁组织中VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的表达水平。结果VEGF-CmRNA和VEGFR-3 mRNA测定的线性范围均为10^3-10^8拷贝/μg总RNA;VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA高、低值的批内、批间变异系数（CV）在7.07%-12.49%之间。VEGF-C mRNA主要表达在癌组织中,而VEGFR-3mRNA在癌组织与癌旁组织中表达无差异;VEGF-C mRNA与VEGFR-3 mRNA在癌组织与癌旁组织中表达存在相关性;24例淋巴结转移食管癌患者癌组织及其癌旁组织VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA水平与16例无淋巴结转移食管癌患者癌组织及其癌旁组织存在显著差异,提示有淋巴结转移的食管癌组织及其癌旁组织VEGF-C和VEGFR-3基因表达水平上调。VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的表达水平与食管癌临床病理分期有密切关系。结论我们建立的测定VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的实时FQ-RT-PCR灵敏、稳定、重现性好,可供VEGF-C、VEGFR-3基因表达的临床检测和研究。VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA基因表达水平可作为食管癌淋巴结转移的预测指标,亦可作为分子水平上判定食管癌临床分期的辅助指标之一。

非小细胞肺癌患者骨髓CK19和LUNX mRNA的实时荧光定量检测和意义

目的:检测非小细胞肺癌患者CK19mRNA和LUNXmRNA的表达情况,探讨其作为微转移检测分子标志物的可行性。方法:选择初治的非小细胞肺癌(NSCLC)患者62例,以肺部良性疾病10例作为对照组,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)和普通RT-PCR技术,检测肺癌、良性病变肺组织和骨髓的CK19mRNA和LUNXmRNA的表达。结果:肺癌和良性病变肺组织RT-PCR检测结果显示CK19mRNA和LUNXmRNA表达阳性率为100%;62例NSCLC患者骨髓标本FQ-RT-PCR检测结果显示,NSCLC患者中骨髓CK19mRNA表达阳性率45.2%(28/62),明显高于肺良性病变组10%(1/10)(P=0.037),NSCLC组骨髓LUNXmRNA表达阳性率38.7%(24/62)明显高于肺良性病变组0%(0/10)(P=0.017);骨髓CK19mRNA表达阳性率随病理分期升高,接近统计学意义(P=0.06),而与病理类型、肿瘤分化程度无关;骨髓LUNXmRNA表达阳性率随分期升高且有统计学意义(P=0.02),而与病理类型、肿瘤分化程度无关;骨髓CK19mRNA和LUNXmRNA表达明显相关(P<0.001)。结论:CK19mRNA和LUNXmRNA可作为检测非小细胞肺癌患者微转移特异、敏感的分子标志物,可能有助于早期诊断肺癌转移,从而指导临床分期和治疗。

运用实时荧光定量RT-PCR和ELISA方法定量检测SHIV的对比分析

目的 建立一种实时、灵敏、特异的针对人／猴免疫缺陷病毒（SHIV）的RNA载量检测方法，通过与酶联免疫吸附试验（ELISA）进行比较，成为监测SHIV病毒体外复制过程的常用方法。方法 体外转录制备RNA标准品，利用TaqMan EZ逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）试剂盒的反应体系和针对SHIVgag保守区91个碱基的Taq—Man探针与引物，建立一步法实时荧光定量RT—PCR。三种SHIV感染性分子克隆体外转染293T细胞，在不同的时间点采样，通过实时荧光定量RT—PCR和ELISA两种方法监测SHIV病毒复制过程。结果两种方法监测的病毒复制过程基本一致，转染后2～48小时病毒复制出现明显的对数生长期，之后进入平台期，p24浓度大约100pg／ml，而RNA载量大约在100拷贝／ml。两者具有很好的相关性（r^2=0．834；P〈0．001）。实时荧光定量RT＋PCR灵敏度更高，检测范围更广，费用更低。结论 所建立的一步法检测SHIV病毒载量的实时荧光定量RT—PCR方法，可以作为监测SHIV体外扩增的常用方法。

实时荧光定量检测胃癌患者MUC1基因表达及临床意义

目的:检测胃癌患者肿瘤组织及外周血MUC1mRNA的表达水平,探讨MUC1mRNA表达的临床意义。方法:利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测胃癌组织、正常组织及外周血中MUC1mRNA水平,分析其表达与肿瘤临床病理因素的关系。结果:胃癌患者肿瘤组织及外周血MUC1mRNA表达水平高于正常对照组(P<0.05),肿瘤组织MUC1mRNA的检出率与肿瘤的分化程度、淋巴结转移、血行转移及临床分期有关(P<0.05),外周血MUC1mRNA的检出率与肿瘤的淋巴结转移、血行转移及临床分期有相关(P<0.05)。结论:检测胃癌组织及外周血MUC1mRNA的表达有助于早期发现胃癌及其微转移。

实时荧光定量RT-PCR法检测安徽宿州市手足口病病原体结果分析

目的 了解宿州市手足口病肠道病毒谱及感染情况,为制订手足口病预防控制策略提供依据。方法 采用实时荧光定量RT-PCR法对2012~2014年宿州市各县区哨点医院手足口病临床诊断病例进行病原学检测并分析。结果 在962份样品中,肠道病毒核酸检测阳性384例,阳性率为39.92%;其中EV71、Cox A16分别为154例（占40.10%）、144例（占37.50%）,其他型肠道病毒共86例（占22.40%）。384例阳性病例中,男247例,女137例,阳性检出率在性别间差异无统计学意义（χ2=0.83,P〉0.05）;1岁组和2岁组手足口病毒核酸检测阳性占全部阳性者的73.18%。在3~4月和6~7月的发病高峰期间,病毒主要以Cox A16型和EV71型毒株为主,10~12月以EV71型病毒株为主。在人口密集的萧县和埇桥区,其手足口核酸阳性检出率最高,分别为50.21%和42.18%。结论 宿州市手足口病病原体主要是EV71和Cox A16,主要发生在3岁以下儿童,发病时间以每年3~4月和6~7月为主,应加强在流行季节的防控工作及3岁以下手足口病患儿的病情监测与治疗。