应用双向荧光差异凝胶电泳和质谱技术筛选口腔扁平苔藓唾液差异蛋白

目的:应用双向荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)和质谱技术筛选、鉴定与口腔扁平苔藓(OLP)患者唾液有关的差异蛋白。方法:收集3例OLP患者及3例健康人唾液,提取唾液总蛋白采用2-D DIGE技术分离蛋白质,寻找差异蛋白质点应用液相色谱一质谱联用技术(LC-MS)对差异蛋白质点进行质谱鉴定。结果:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示各样品条带清晰,无明显蛋白质丢失,经2-D DIGE分离蛋白质后,蛋白质点重复性较好。OLP患者组和健康对照组唾液差异蛋白质点数平均为(317±71)个,用质谱技术鉴定了重复性较好的4个差异蛋白质点(分泌型IgAl、锌α-2-糖蛋白、唾液淀粉酶、血清白蛋白)在OLP患者唾液中表达量均上调。结论:分泌型IgAl、锌α-2-糖蛋白、唾液淀粉酶、血清白蛋白在OLP患者唾液中高表达可能参与了OLP的发生、发展。

双向荧光差异凝胶电泳技术在心脏病蛋白质组学研究中的应用

目的:应用双向荧光差异凝胶电泳技术筛选与致心律失常性右心室心肌病引起的与心力衰竭密切相关的蛋白质标志物。方法:从本院的心脏病组织库中挑选6例病理诊断明确和各方面资料比较齐全的致心律失常性右心室心肌病引起心力衰竭的左心室心肌标本(来源于心脏移植的受体),以年龄、性别和种族等因素相匹配的因非心脏病死亡的6例正常心脏的左心室心肌作为本实验的对照,进行比较蛋白质组学研究,筛选在致心律失常性右心室心肌病引起的心力衰竭中差异表达的蛋白质,即蛋白质标志物,并应用免疫组织化学和免疫印迹杂交方法检验差异蛋白质的可靠性。结果:经二次重复实验共筛选出5个差异表达的蛋白质,其中有3个在致心律失常性右心室心肌病引起的心力衰竭中表达升高,而另有2个表达降低。经生物信息学分析,这5个差异蛋白质主要为心肌细胞的骨架蛋白或参与能量代谢和应急保护反应的蛋白质。其中的一个差异表达蛋白质——细胞骨架蛋白 Desmin 经免疫组织化学和免疫印迹杂交方法得到了进一步验证。结论:本研究应用双向荧光差异凝胶电泳技术筛选获得5个与致心律失常性右心室心肌病引起的心力衰竭密切相关的蛋白质标志物,这些标志物可能与心力衰竭发生的分子机制相关,并可能用于疾病的分层、判断预后及指导个性化治疗。

结直肠癌组织的二维荧光差异凝胶电泳分析

目的以二维荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)技术分析结直肠癌(CRC)组织及正常结直肠组织的蛋白质表达差异。建立二者间的蛋白质表达差异图谱。方法6对样品分别取自6例CRC手术切除的新鲜的癌和正常肠黏膜组织,进行2-D DIGE,TyphoonTM多功能扫描仪进行图像扫描,并以DeCyderTM2-D差异分析软件分析。结果正常肠黏膜组织和癌组织有统计学差异(P<0.05)的表达蛋白点共有315个,癌组织中表达上调(>1.5倍)的有138个,下调(>1.5倍)的有103个。结论建立了CRC与正常肠黏膜组织的2-D DIGE图谱,发现并经统计学证实癌组织中有表达上调或下调的蛋白存在。

运用双向荧光差异凝胶电泳分析人类年龄相关性核性白内障和正常晶状体核的蛋白质组学差异

目的鉴定年龄相关性核性白内障(age-related nuclear cataract,ARNC)和正常晶状体核蛋白质组学差异。方法用强解聚试剂分别溶解7只不同程度ARNC晶状体核和7只正常晶状体核,提取总蛋白,Bradford法测定蛋白浓度。通过双向荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence differencein-gel electrophoresis,2-D DIGE)、Decyder6.5软件分析电泳图谱,寻找差异蛋白质点。差异蛋白质点随后用激光辅助解吸/电离飞行时间(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight,MALDI-TOF)质谱仪鉴定。结果 2-DDIGE结果显示,和正常晶状体核样品相比,39个点的蛋白含量在ARNC样品中显著减少(P<0.05)。MALDI-TOF质谱成功鉴定其中36个蛋白质点,它们分属于9个不同的蛋白质,其中6个蛋白(αA-、βA3-、βA4-、βB1-、γD-晶状体蛋白和一个来自CRYGS家族的未知蛋白DKFZp434A0627)的含量随着ARNC程度的增加而逐渐减少;其他3种蛋白(αB-晶状体蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和视黄醛脱氢酶1)未呈现这种递减趋势。结论 3-磷酸甘油醛脱氢酶、视黄醛脱氢酶1以及某些晶状体蛋白的减少可能参与ARNC的形成。

运用双向荧光差异凝胶电泳分析VLDL致THP-1来源泡沫细胞的形成

目的运用双向荧光差异凝胶电泳结合质谱技术寻找极低密度脂蛋白(VLDL)致诱导分化的THP-1细胞形成泡沫细胞中的关键蛋白质,以期揭示其致泡沫细胞的机制。方法 THP-1细胞经佛波醇脂(PMA)诱导分化为巨噬细胞,以磷酸盐缓冲液(PBS)孵育为空白对照组、VLDL孵育为实验组。提取细胞总蛋白后分别用荧光染料CY3和CY5标记,以所有样本等量混合作为"内标",用CY2标记,然后将实验组、空白对照组及内标混合后进行二维电泳,扫描图像后经分析的差异蛋白做基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-CPR)分析3种蛋白质(脂肪分化相关蛋白、烯醇化酶1、磷酸甘油酸变位酶1)mRNA的变化。结果实验组与空白对照组比较,表达量上调蛋白点在1.2倍以上有34个,表达量下调1.2倍以上有48个。通过软件筛选其中14个有差异的蛋白点做MALDI-TOF-MS,其中脂肪分化相关蛋白、热休克蛋白27、人电子转移味蛋白三维结构-链A、s100钙结合蛋白、人过氧化物酶-3-异构体c、辅酶-细胞色素C还原酶核心蛋白I、过氧化物酶烯酰辅酶A水合酶样蛋白、富马酸合酶-异构体d表达增高,烯醇化酶1、磷酸甘油酸变位酶1、环孢素A结合双肽甘氨酸-脯氨酸复合物、DMGDH蛋白、核内不均一核糖核蛋白L-异构体a、果糖胺3激酶-异构体b表达降低。脂肪分化相关蛋白mRNA表达明显上调,烯醇化酶1、磷酸甘油酸变位酶1 mRNA表达明显下调,与蛋白水平变化一致。结论荧光差异凝胶电泳能在整体上揭示VLDL在致泡沫细胞形成过程中蛋白质水平的变化,经鉴定的蛋白质可能在VLDL致泡沫细胞的形成中发挥重要的作用,为阐明VLDL作用巨噬细胞形成泡沫细胞的机制奠定了基础。

人胆汁蛋白质组双向荧光差异凝胶电泳图谱的建立与差异分析

目的建立人胆汁蛋A质组双向荧光差异凝胶电泳分析流程用于胆汁比较蛋A质组学研究。方法实验组与对照组样本各6例，分别取自于胆管癌及胆总管结石病例。样本经纯化处理及定量后，分别标记不同的荧光染料后进行双向电泳与差异分析。结果两组样本均获得高分辨力的双向电泳图谱；各标记蛋白质点的荧光强度与蛋A表达量呈线性关系；实验组与对照组间共筛选出55个差异表达蛋白，其表达量两组间相差1．5倍以上，t检验有统计学意义（P〈0．05）。结论建立了基于双向荧光差异凝胶电泳基础上的胆汁比较蛋白质组学的分析流程。

荧光差异凝胶电泳筛选胆管癌胆汁差异表达蛋白的研究

目的探讨双向荧光差异凝胶电泳筛选胆管癌胆汁差异表达蛋白的可行性。方法实验组与对照组胆汁各6例，分别取自胆管癌及胆总管结石病例。实验与对照组每例各取100ug蛋白质，分别标记400pmol的Cy3与Cy5，另每例各取50ug混合后制备成内标样品并标记2．4nmol的Cy2。标记后的实验组、对照组及内参组样品各取100ug等量混合后在同一凝胶内进行双向荧光差异凝胶电泳，通过质谱分析，筛选并鉴定有统计学意义的差异表达蛋白，探讨其生物学意义。结果实验组与对照组共筛选出55个差异表达蛋白，其表达量两组间相差1．5倍以上，t检验有统计学意义（P〈0．05）。对其中15个差异表达蛋白进行质谱鉴定，共鉴定出8种差异表达蛋白。结论双向荧光差异凝胶电泳胆汁中筛选胆管癌胆汁差异表达蛋白是可行的，可用于胆管癌早期诊断标志物的筛选。

荧光差异双向凝胶电泳筛选肾透明细胞癌及癌旁组织中的差异表达蛋白

目的寻找肾癌相关肿瘤标记物,用于肾癌临床诊断、药物治疗靶点的选择及预后监测。方法采用荧光差异双向凝胶电泳技术筛选15例肾透明细胞癌及癌旁正常肾组织差异表达蛋白质点。统计学采用t检验进行定量比较,以两组蛋白含量比值在1.5倍及以上,P<0.05,被认为是差异表达蛋白质点。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱或串联质谱技术进行差异表达蛋白质点鉴定。结果共筛选分离出27个差异表达蛋白质点,经质谱技术共成功鉴定了26种蛋白质,11种蛋白质在肾癌组织中上调,15种蛋白质下调。其功能覆盖细胞活动的多个方面,其中线粒体短/支链特异性酰基辅酶A脱氢酶、醛糖1-表异构酶、PRDX4、CAPG、β-防御素107、微纤丝相关糖蛋白4等6种蛋白是我们首次采用蛋白质组学技术成功筛选的肾癌差异表达蛋白质,并发现了1个预测蛋白(UCRIL)。结论荧光差异双向凝胶电泳在肾癌组织中获得较好的筛选效果,新筛选的差异表达蛋白有望成为肾癌分子生物学标记物,为后续研究提供了实验依据。

差异荧光凝胶电泳法分析不同转移潜能人肝癌细胞系的蛋白质组

本研究应用差异凝胶电泳(Difference gel electrophoresis,DIGE)和质谱鉴定技术,系统分析了4种具有不同转移潜能的人肝癌细胞系的蛋白质表达差异。胶上鉴定了约1700个蛋白质斑点,经过比对后发现167个蛋白质点存在差异,经过质谱分析成功鉴定了146个蛋白质点,对应96个与肝癌转移相关的非冗余差异蛋白。对差异蛋白进行生物信息学分析,结果表明细胞组装和运动相关的蛋白在转移过程中被富集。差异蛋白前列腺脱氢酶(Hydroxyprostaglandin dehydrogenase,HPGD)首次被证明与肝癌转移正相关,具有抗凋亡和促侵袭的能力。

功能蛋白质组学研究利器——荧光差异凝胶电泳和多维液相色谱应用概述

大量生物体全基因组序列的获得，特别是人类基因组序列草图的完成，为人类了解细胞中蛋白质表达图谱、基因与蛋白质的功能关系奠定了基础，也为研究人类基因括性与疾病的相关性提供了有力根据。但是，由于基因表达往往是通过基因的转录，表达产生一个蛋白质前体，再进行加二，修饰，才成为一个具有生物活性的蛋白质，所以同一个基因在不同条件、

体外模拟脑缺血再灌注OGD/R模型的差异凝胶电泳分析

目的:通过体外模拟缺血-再灌注损伤(I/R)诱导细胞凋亡的氧糖剥离再灌注(OGD/R)模型的建立,应用蛋白质组学技术观察凋亡细胞蛋白质组的差异表达,进一步揭示神经元凋亡的发生机制。方法:选用人神经母细胞瘤系SH-SY5Y细胞分为对照组和实验组,实验组给予OGD10h/R24h处理建立OGD/R诱导SH-SY5Y细胞凋亡模型,提取对照组和实验组细胞总蛋白,利用荧光染色双向差异凝胶电泳技术(2D-DIGE)检测细胞蛋白质组的差异表达变化。结果:DeCyder软件分析2D-DIGE凝胶图像显示平均分离了(1 800±156)个蛋白质点;与对照组比较,实验组共有30个蛋白点的表达水平有显著变化(蛋白表达量上调或下调30%以上),其中22个升高,8个降低,与同时间对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:应用双向差异凝胶电泳的蛋白质组学技术在OGD/R模型中发现有差异蛋白的表达。

荧光双向电泳检测雌雄小鼠肝组织蛋白组学的差异

目的检测雌雄小鼠肝组织蛋白质组表达差异,探讨肝病发生的性别差异机制。方法采用双向荧光差异凝胶电泳(two dimension difference gel electrophoresis,2D-DIGE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术检测C57BL/6J雌雄小鼠肝组织的蛋白质组差异表达谱,分离并鉴定差异表达蛋白,应用Western blot进行验证,并对差异表达蛋白进行生物信息学分析,包括蛋白功能注释、分类分析、京都基因与基因组百科全书通路分析。结果经双向荧光差异凝胶电泳-图像分析得到1767个蛋白点,其中差异倍数≥1.5(P<0.05)的蛋白点325个。从中选择78个差异蛋白点进行MALDI-TOF-MS鉴定,得到48种差异性表达的蛋白质。其中,与雌鼠相比,雄鼠肝组织中高表达的蛋白有14种,低表达的蛋白有34种。选取6个差异蛋白点进行Western blot验证,证明了2D-DIGE结果的可靠性。GO分析结果显示,涉及雌雄鼠肝组织中的差异蛋白在细胞组分、分子功能、生物学过程中的分布广泛。KEGG通路分析发现差异蛋白涉及6条信号通路。结论 C57BL/6J雌雄小鼠肝组织的差异性蛋白表达的检测结果为研究性别差异性肝病发生的分子机制提供了基础生物学信息和有益的线索。

探究双向差异凝胶电泳技术(2D-DIGE)及其在环境科学研究中的应用

双向差异性凝胶电泳技术是在传承了传统双向电泳技术的先进基础上引入了荧光标记技术,使多种蛋白样品能够在同一个凝胶体系中实现蛋白质组分的分离而不会影响各自蛋白点的检测、识别以及定量,提升了蛋白质组差异表达研究的重复率和灵敏度,本文基于这一技术特点,介绍了2D-DIGE样品制备、荧光标记和电泳、凝胶成像和图像分析以及质谱分析等技术流程,并探讨其在宏蛋白质组学研究、微生物全细胞传感器设计等环境科学领域的应用。由于蛋白质组学技术可以在某种程度上解决宏基因组学、元转录组学等微生物功能性研究中的局限性,因此,该技术目前已经在微生物群落的生态功能研究、极端环保微生物研究、环境污染检查与评估以及微生物修复等领域具有较广泛的应用前景。

应用双向荧光差异凝胶技术解析干酪乳杆菌Lactobacillus casei Zhang驯化菌株耐酸胁迫机制

以干酪乳杆菌Lactobacillus casei Zhang为出发菌株,通过适应性进化获得了干酪乳杆菌酸胁迫抗性驯化菌株。对细胞内微环境的检测发现,驯化菌株在酸胁迫过程中能够维持较高的磷酸烯醇式丙酮酸-糖转移酶系统活力,并具有较高的H^+-ATPase活性以及胞内ATP浓度。蛋白质组学分析结果表明,酸胁迫引发了细胞蛋白表达的变化,与原始菌株相比,驯化菌株保持了更高的代谢活性;同时,驯化菌株通过大量诱导应激蛋白如分子伴侣GroEL、GrpE,冷/热应激蛋白CspC、DnaK等维持了细胞的生理活性,有效提高了细胞对酸胁迫的抵御能力。本研究为进一步揭示酸胁迫下乳酸菌细胞的生理应答机制,探寻促进乳酸菌酸胁迫性能提升的最优策略,进而改善其在生产中的应用性能提供了可借鉴的思路。

化湿行瘀清热方剂对口腔扁平苔藓患者唾液中差异蛋白的影响

目的:筛选鉴定口腔扁平苔藓(OLP)治疗前后唾液中的差异蛋白,探讨化湿行瘀清热方剂对口腔扁平苔藓患者唾液中差异蛋白的影响。方法:收集OLP患者化湿行瘀清热方剂治疗前后的唾液,提取唾液总蛋白,应用双向荧光差异凝胶电泳和液相色谱-质谱联用技术筛选鉴定差异蛋白,蛋白质印迹法检测差异蛋白的表达情况。结果:筛选鉴定出OLP患者化湿行瘀清热方剂治疗前后6种差异蛋白:分泌型IgA、血清白蛋白、IgM、唾液淀粉酶、碳酸酐酶6、锌α2糖蛋白。OLP患者治疗后较治疗前唾液中IgA表达量升高,血清白蛋白、IgM、碳酸酐酶6和锌α2糖蛋白治疗后较治疗前表达量下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 :OLP患者化湿行瘀清热方剂治疗前后唾液中存在差异蛋白,并可能在OLP的发生发展中起着重要作用。

口腔扁平苔藓患者血清差异蛋白表达检测及意义

目的探讨口腔扁平苔藓(OLP)患者血清差异蛋白表达及意义。方法选择6例OLP患者(观察组)和6例健康志愿者(对照组),抽取空腹静脉血后采用苯酚抽提法提取血清蛋白,Bradford法测定蛋白含量,双向荧光差异凝胶电泳法分离检测差异蛋白点,液相色谱-质谱联用技术鉴定差异蛋白。选择其中研究较少的蛋白,采用Western blotting法检测两组蛋白相对表达量。结果两组血清差异蛋白点(583±183)个,其中重复性好的蛋白差异点20个,质谱分析蛋白序列鉴定出12种蛋白质。12种蛋白质中,7种(补体C3、激肽原、α-2-巨球蛋白、人抗凝血酶Ⅲ、分泌型Ig A、补体C9、β-1-金属结合球蛋白)在观察组血清中表达降低,5种(结合珠蛋白、铜蓝蛋白、载脂蛋白AⅠ、维生素D、人类因子B)表达升高。观察组血清补体C3和人抗凝血酶Ⅲ蛋白相对表达量均低于对照组,载脂蛋白AⅠ高于对照组(P均<0.01)。结论 OLP患者血清中存在12种差异蛋白质,血清补体C3和人抗凝血酶Ⅲ蛋白表达均降低,载脂蛋白AⅠ表达升高,其发病可能与免疫功能降低及感染有关。

宫颈上皮内瘤变与正常宫颈组织差异表达蛋白分析

目的探讨蛋白质组学方法筛查正常宫颈与宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)组织中的差异表达蛋白质标志物,为研究CIN发生的分子机制及临床诊治工作提供依据。方法收集2008年8月至2009年9月间首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科收治的正常子宫颈组织因子宫肌瘤手术行全子宫切除术患者9例为对照组、CIN组织23例(其中CINⅠ7例、CINⅡ8例、CINⅢ8例)。应用二维荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis,2-DDIGE)及DeCyder软件寻找差异表达蛋白质点,基质辅助激光解析飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF MS)分析差异蛋白质点,数据库搜索鉴定差异表达最明显的S100蛋白家族A9(S100 calcium-binding protein A9,S100A9),真核延长因子1α1(eukaryoticelongation factor 1-alpha-1,eEF1A1)及丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)3种蛋白质;应用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)(其中正常宫颈组织10例、CINⅠ10例、CINⅡ10例、CINⅢ10例)及蛋白印记法(Western blotting)(其中正常宫颈组织12例,CINⅠ～Ⅱ12例,CINⅢ12例)进一步验证上述3种蛋白在CIN组织和正常宫颈组织的表达差异。结果获得CIN组织与正常宫颈组织2-D DIGE图,成功鉴定25个蛋白;免疫组化及蛋白印迹验证结果提示:S100A9蛋白表达于细胞质中,在CIN中表达水平高于正常组,差异有统计学意义(P=0.010);eEF1A1蛋白表达于细胞质中、PKM2蛋白表达于细胞核中,2者在CIN中表达水平均低于正常组,差异有统计学意义(P分别为0.352,0.000)。结论在正常宫颈组织与CIN组织之间存在差异蛋白质表达,S100A9蛋白可能成为辅助诊断CIN的相关标志物,PKM2蛋白可能成为抑制CIN发生的蛋白质,并可根据2种差异蛋白表达预测CIN的发生发展。

植物差异蛋白组学研究中几项主要技术的探讨

蛋白质是细胞内的关键物质,是生命活动的体现者.对蛋白质的研究,将有助于阐明生命现象的某些重要机制.目前植物高通量差异蛋白组学技术的发展日新月异,但主要包括双向电泳(2-DE)、双向荧光差异凝胶电泳(DIGE)、同位素亲和标签(ICAT)、同重同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)4种技术方法.因此,就以上4种技术方法进行探讨,以期更好他利用蛋白组学相关技术.

应用2D-DIGE技术分析柑橘衰退病毒诱导的甜橙差异表达蛋白

【目的】为了研究柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)诱导甜橙差异表达蛋白的分离和鉴定,【方法】以接种了CTV的甜橙植株为实验组,健康植株为对照组,利用双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术分析CTV诱导的甜橙差异表达蛋白。【结果】以t检验P<0.05和相对表达量≥1.5的水平作为判别标准,获得了91个CTV诱导的差异表达蛋白点,在实验组中含量高于对照组的蛋白56个,含量低于对照组的蛋白35个。通过MALDI-TOF质谱分析成功鉴定从中选择的37个蛋白点,其中19个蛋白功能明确,16个为预测或假定具有某种蛋白功能,包括与抗氧化相关的硫氧还蛋白、铁氧还蛋白、超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化酶,与代谢相关的磷酸甘油酸酯水解酶、木葡聚糖内糖基转移酶、变味蛋白,分子伴侣热激蛋白,折叠酶肽酰脯氨酰顺反式异构酶,以及与光合代谢相关的蛋白等。【结论】CTV的侵染影响到甜橙各种复杂的生物学过程。

水稻草矮病毒侵染的水稻根系差异蛋白鉴定

为鉴定与水稻草矮病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)侵染引起的水稻根系发育不良的相关蛋白,解析根系发育不良症状的形成机理以及水稻草矮病毒与水稻互作的分子机制,采用双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)结合基质辅助激光解析串联飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)对RGSV侵染水稻后根系的差异表达蛋白进行分离和鉴定,并对鉴定的差异表达蛋白进行GO聚类分析和KEGG生物通路注释。结果表明,差异倍数大于2的蛋白质点有56个,其中,表达丰度升高的点有34个,表达丰度下降的点有22个;质谱成功鉴定出27个蛋白质点,分属于25种蛋白质。GO聚类分析表明差异表达蛋白涉及14个生物学过程,在生物功能上分属10类。细胞组件分析显示差异表达蛋白定位于不同的细胞部位。KEGG通路分析显示差异蛋白参与了12个生物通路。