双向荧光差异凝胶电泳技术在心脏病蛋白质组学研究中的应用

目的:应用双向荧光差异凝胶电泳技术筛选与致心律失常性右心室心肌病引起的与心力衰竭密切相关的蛋白质标志物。方法:从本院的心脏病组织库中挑选6例病理诊断明确和各方面资料比较齐全的致心律失常性右心室心肌病引起心力衰竭的左心室心肌标本(来源于心脏移植的受体),以年龄、性别和种族等因素相匹配的因非心脏病死亡的6例正常心脏的左心室心肌作为本实验的对照,进行比较蛋白质组学研究,筛选在致心律失常性右心室心肌病引起的心力衰竭中差异表达的蛋白质,即蛋白质标志物,并应用免疫组织化学和免疫印迹杂交方法检验差异蛋白质的可靠性。结果:经二次重复实验共筛选出5个差异表达的蛋白质,其中有3个在致心律失常性右心室心肌病引起的心力衰竭中表达升高,而另有2个表达降低。经生物信息学分析,这5个差异蛋白质主要为心肌细胞的骨架蛋白或参与能量代谢和应急保护反应的蛋白质。其中的一个差异表达蛋白质——细胞骨架蛋白 Desmin 经免疫组织化学和免疫印迹杂交方法得到了进一步验证。结论:本研究应用双向荧光差异凝胶电泳技术筛选获得5个与致心律失常性右心室心肌病引起的心力衰竭密切相关的蛋白质标志物,这些标志物可能与心力衰竭发生的分子机制相关,并可能用于疾病的分层、判断预后及指导个性化治疗。

定量蛋白质组学研究的利器——荧光差异凝胶电泳技术

自20世纪90年代后期．随着蛋白质组概念的提出和基因组测序工作的快速进行，尤其是双向电泳技术的改进和生物质谱的大范围应用，蛋白质组学研究进入了一个快速发展的十年。十年间．伴随着对蛋白质组分离技术分辨率和重复性的争论，以双向电泳为主的基于凝胶的分离技术和以反相色谱为主的液相色谱质谱技术都取得了迅猛而深入的发展。

应用双向荧光差异凝胶电泳和质谱技术筛选口腔扁平苔藓唾液差异蛋白

目的:应用双向荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)和质谱技术筛选、鉴定与口腔扁平苔藓(OLP)患者唾液有关的差异蛋白。方法:收集3例OLP患者及3例健康人唾液,提取唾液总蛋白采用2-D DIGE技术分离蛋白质,寻找差异蛋白质点应用液相色谱一质谱联用技术(LC-MS)对差异蛋白质点进行质谱鉴定。结果:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示各样品条带清晰,无明显蛋白质丢失,经2-D DIGE分离蛋白质后,蛋白质点重复性较好。OLP患者组和健康对照组唾液差异蛋白质点数平均为(317±71)个,用质谱技术鉴定了重复性较好的4个差异蛋白质点(分泌型IgAl、锌α-2-糖蛋白、唾液淀粉酶、血清白蛋白)在OLP患者唾液中表达量均上调。结论:分泌型IgAl、锌α-2-糖蛋白、唾液淀粉酶、血清白蛋白在OLP患者唾液中高表达可能参与了OLP的发生、发展。

荧光差异双向凝胶电泳筛选肾透明细胞癌及癌旁组织中的差异表达蛋白

目的寻找肾癌相关肿瘤标记物,用于肾癌临床诊断、药物治疗靶点的选择及预后监测。方法采用荧光差异双向凝胶电泳技术筛选15例肾透明细胞癌及癌旁正常肾组织差异表达蛋白质点。统计学采用t检验进行定量比较,以两组蛋白含量比值在1.5倍及以上,P<0.05,被认为是差异表达蛋白质点。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱或串联质谱技术进行差异表达蛋白质点鉴定。结果共筛选分离出27个差异表达蛋白质点,经质谱技术共成功鉴定了26种蛋白质,11种蛋白质在肾癌组织中上调,15种蛋白质下调。其功能覆盖细胞活动的多个方面,其中线粒体短/支链特异性酰基辅酶A脱氢酶、醛糖1-表异构酶、PRDX4、CAPG、β-防御素107、微纤丝相关糖蛋白4等6种蛋白是我们首次采用蛋白质组学技术成功筛选的肾癌差异表达蛋白质,并发现了1个预测蛋白(UCRIL)。结论荧光差异双向凝胶电泳在肾癌组织中获得较好的筛选效果,新筛选的差异表达蛋白有望成为肾癌分子生物学标记物,为后续研究提供了实验依据。

结直肠癌组织的二维荧光差异凝胶电泳分析

目的以二维荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)技术分析结直肠癌(CRC)组织及正常结直肠组织的蛋白质表达差异。建立二者间的蛋白质表达差异图谱。方法6对样品分别取自6例CRC手术切除的新鲜的癌和正常肠黏膜组织,进行2-D DIGE,TyphoonTM多功能扫描仪进行图像扫描,并以DeCyderTM2-D差异分析软件分析。结果正常肠黏膜组织和癌组织有统计学差异(P<0.05)的表达蛋白点共有315个,癌组织中表达上调(>1.5倍)的有138个,下调(>1.5倍)的有103个。结论建立了CRC与正常肠黏膜组织的2-D DIGE图谱,发现并经统计学证实癌组织中有表达上调或下调的蛋白存在。

运用双向荧光差异凝胶电泳分析人类年龄相关性核性白内障和正常晶状体核的蛋白质组学差异

目的鉴定年龄相关性核性白内障(age-related nuclear cataract,ARNC)和正常晶状体核蛋白质组学差异。方法用强解聚试剂分别溶解7只不同程度ARNC晶状体核和7只正常晶状体核,提取总蛋白,Bradford法测定蛋白浓度。通过双向荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence differencein-gel electrophoresis,2-D DIGE)、Decyder6.5软件分析电泳图谱,寻找差异蛋白质点。差异蛋白质点随后用激光辅助解吸/电离飞行时间(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight,MALDI-TOF)质谱仪鉴定。结果 2-DDIGE结果显示,和正常晶状体核样品相比,39个点的蛋白含量在ARNC样品中显著减少(P<0.05)。MALDI-TOF质谱成功鉴定其中36个蛋白质点,它们分属于9个不同的蛋白质,其中6个蛋白(αA-、βA3-、βA4-、βB1-、γD-晶状体蛋白和一个来自CRYGS家族的未知蛋白DKFZp434A0627)的含量随着ARNC程度的增加而逐渐减少;其他3种蛋白(αB-晶状体蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和视黄醛脱氢酶1)未呈现这种递减趋势。结论 3-磷酸甘油醛脱氢酶、视黄醛脱氢酶1以及某些晶状体蛋白的减少可能参与ARNC的形成。

运用双向荧光差异凝胶电泳分析VLDL致THP-1来源泡沫细胞的形成

目的运用双向荧光差异凝胶电泳结合质谱技术寻找极低密度脂蛋白(VLDL)致诱导分化的THP-1细胞形成泡沫细胞中的关键蛋白质,以期揭示其致泡沫细胞的机制。方法 THP-1细胞经佛波醇脂(PMA)诱导分化为巨噬细胞,以磷酸盐缓冲液(PBS)孵育为空白对照组、VLDL孵育为实验组。提取细胞总蛋白后分别用荧光染料CY3和CY5标记,以所有样本等量混合作为"内标",用CY2标记,然后将实验组、空白对照组及内标混合后进行二维电泳,扫描图像后经分析的差异蛋白做基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-CPR)分析3种蛋白质(脂肪分化相关蛋白、烯醇化酶1、磷酸甘油酸变位酶1)mRNA的变化。结果实验组与空白对照组比较,表达量上调蛋白点在1.2倍以上有34个,表达量下调1.2倍以上有48个。通过软件筛选其中14个有差异的蛋白点做MALDI-TOF-MS,其中脂肪分化相关蛋白、热休克蛋白27、人电子转移味蛋白三维结构-链A、s100钙结合蛋白、人过氧化物酶-3-异构体c、辅酶-细胞色素C还原酶核心蛋白I、过氧化物酶烯酰辅酶A水合酶样蛋白、富马酸合酶-异构体d表达增高,烯醇化酶1、磷酸甘油酸变位酶1、环孢素A结合双肽甘氨酸-脯氨酸复合物、DMGDH蛋白、核内不均一核糖核蛋白L-异构体a、果糖胺3激酶-异构体b表达降低。脂肪分化相关蛋白mRNA表达明显上调,烯醇化酶1、磷酸甘油酸变位酶1 mRNA表达明显下调,与蛋白水平变化一致。结论荧光差异凝胶电泳能在整体上揭示VLDL在致泡沫细胞形成过程中蛋白质水平的变化,经鉴定的蛋白质可能在VLDL致泡沫细胞的形成中发挥重要的作用,为阐明VLDL作用巨噬细胞形成泡沫细胞的机制奠定了基础。

双向凝胶电泳与质谱技术分析Dukes B期大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组学

目的研究Dukes B期大肠癌肿瘤与癌旁组织差异蛋白质组学。方法①应用双向凝胶电泳(2-DE)和质谱技术对大肠癌肿瘤与癌旁组织分离分析。②在鉴定出具有差异蛋白质中,选出2个蛋白质烯醇化酶(Enolase)、血红蛋白(Hemoglob in)行蛋白印记实验,验证2-DE结果。结果通过2-DE和质谱技术对大肠癌肿瘤与癌旁组织进行分离分析,21个蛋白质点在组织中的表达量差异显著。通过免疫蛋白印记实验进一步证明2-DE结果的准确性。结论 Dukes B期大肠癌肿瘤与癌旁组织蛋白质具有差异性,其中14个蛋白质点在肿瘤组织上调,7个下调。

差异荧光凝胶电泳法分析不同转移潜能人肝癌细胞系的蛋白质组

本研究应用差异凝胶电泳(Difference gel electrophoresis,DIGE)和质谱鉴定技术,系统分析了4种具有不同转移潜能的人肝癌细胞系的蛋白质表达差异。胶上鉴定了约1700个蛋白质斑点,经过比对后发现167个蛋白质点存在差异,经过质谱分析成功鉴定了146个蛋白质点,对应96个与肝癌转移相关的非冗余差异蛋白。对差异蛋白进行生物信息学分析,结果表明细胞组装和运动相关的蛋白在转移过程中被富集。差异蛋白前列腺脱氢酶(Hydroxyprostaglandin dehydrogenase,HPGD)首次被证明与肝癌转移正相关,具有抗凋亡和促侵袭的能力。

差异凝胶电泳技术的发展及其在生物学领域的应用

差异凝胶电泳技术是建立在双向电泳技术基础之上、采用3种荧光染料同时对蛋白样品进行标记、进而进行蛋白质表达量差异统计学分析的技术,具有更高的敏感度以及精确的定量能力。综述了差异凝胶电泳技术的基本原理、优缺点,概括了该技术在国内外生物学领域的应用现状,并对该技术的未来发展前景进行了展望。

单细胞凝胶电泳技术检测DNA损伤的方法及进展

单细胞凝胶电泳技术是一种常见的检测DNA损伤的技术,它具有灵敏度高、经济、简便、快速等优点。近30年来,这种技术被广泛地应用于遗传毒理、环境监测、医学诊断、营养研究上。单细胞凝胶电泳技术不单单能检测DNA断裂损伤,在加入断裂剂或者特异性内切酶后,可以检测到DNA交联和紫外线诱导的嘧啶二聚体,氧化碱基和烷基化损伤。近些年单细胞凝胶电泳与荧光原位杂交技术相结合后更是拓宽了它的应用范围,对常规和非常规的单细胞凝胶电泳技术及其操作方法进行了归纳总结,并讨论了它的发展前景。

探究双向差异凝胶电泳技术(2D-DIGE)及其在环境科学研究中的应用

双向差异性凝胶电泳技术是在传承了传统双向电泳技术的先进基础上引入了荧光标记技术,使多种蛋白样品能够在同一个凝胶体系中实现蛋白质组分的分离而不会影响各自蛋白点的检测、识别以及定量,提升了蛋白质组差异表达研究的重复率和灵敏度,本文基于这一技术特点,介绍了2D-DIGE样品制备、荧光标记和电泳、凝胶成像和图像分析以及质谱分析等技术流程,并探讨其在宏蛋白质组学研究、微生物全细胞传感器设计等环境科学领域的应用。由于蛋白质组学技术可以在某种程度上解决宏基因组学、元转录组学等微生物功能性研究中的局限性,因此,该技术目前已经在微生物群落的生态功能研究、极端环保微生物研究、环境污染检查与评估以及微生物修复等领域具有较广泛的应用前景。

应用荧光标记信使核糖核酸差异显示技术分离子宫肌瘤相关基因片段

目的:应用荧光标记的信使核糖核酸(messengerribonucleicacid,mRNA)差异显示技术分离子宫肌瘤及正常子宫肌组织相关的差异基因片段。方法:用4种锚定引物和3种随机引物,共12种组合,结合GenomyxLRTMDNA差异显示系统及GenomyxSCTM荧光图像扫描系统,以及配套的FluoroDDandHI-EROGLYPHmRNAProfile试剂盒,采用荧光标记的mRNA差异显示技术进行子宫肌瘤及正常子宫肌组织相关差异基因片段的分离。结果:从子宫肌瘤及正常子宫肌组织间分离出相关的差异基因片段27条,差异片段中主要表现为条带密度的强弱差别。结论:子宫肌瘤的产生可能与某些基因表达的差异有关,而差异基因的序列及功能有待进一步研究。

体外模拟脑缺血再灌注OGD/R模型的差异凝胶电泳分析

目的:通过体外模拟缺血-再灌注损伤(I/R)诱导细胞凋亡的氧糖剥离再灌注(OGD/R)模型的建立,应用蛋白质组学技术观察凋亡细胞蛋白质组的差异表达,进一步揭示神经元凋亡的发生机制。方法:选用人神经母细胞瘤系SH-SY5Y细胞分为对照组和实验组,实验组给予OGD10h/R24h处理建立OGD/R诱导SH-SY5Y细胞凋亡模型,提取对照组和实验组细胞总蛋白,利用荧光染色双向差异凝胶电泳技术(2D-DIGE)检测细胞蛋白质组的差异表达变化。结果:DeCyder软件分析2D-DIGE凝胶图像显示平均分离了(1 800±156)个蛋白质点;与对照组比较,实验组共有30个蛋白点的表达水平有显著变化(蛋白表达量上调或下调30%以上),其中22个升高,8个降低,与同时间对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:应用双向差异凝胶电泳的蛋白质组学技术在OGD/R模型中发现有差异蛋白的表达。

荧光标记mRNA差异显示技术在分离食管癌相关基因片段中的应用

目的 :以荧光标记的mRNA差异显示技术分离食管癌及其正常食管粘膜组织相关的差异基因片段。方法 :结合GenomyxLRTM DNA测序 /差异显示系统及GenomyxSCTM 荧光图象扫描系统 ,以及配套的FluoroDD和HI EROGLYPHmRNAProfileKit,采用荧光标记的mRNA差异显示技术进行检测。结果 :从人食管癌及正常食管粘膜组织间 ,同时直接分离出了相关的癌基因或抑癌基因片段 74条。结论 :该技术方便、快捷 。

应用双向荧光差异凝胶技术解析干酪乳杆菌Lactobacillus casei Zhang驯化菌株耐酸胁迫机制

以干酪乳杆菌Lactobacillus casei Zhang为出发菌株,通过适应性进化获得了干酪乳杆菌酸胁迫抗性驯化菌株。对细胞内微环境的检测发现,驯化菌株在酸胁迫过程中能够维持较高的磷酸烯醇式丙酮酸-糖转移酶系统活力,并具有较高的H^+-ATPase活性以及胞内ATP浓度。蛋白质组学分析结果表明,酸胁迫引发了细胞蛋白表达的变化,与原始菌株相比,驯化菌株保持了更高的代谢活性;同时,驯化菌株通过大量诱导应激蛋白如分子伴侣GroEL、GrpE,冷/热应激蛋白CspC、DnaK等维持了细胞的生理活性,有效提高了细胞对酸胁迫的抵御能力。本研究为进一步揭示酸胁迫下乳酸菌细胞的生理应答机制,探寻促进乳酸菌酸胁迫性能提升的最优策略,进而改善其在生产中的应用性能提供了可借鉴的思路。

切割海马伞大鼠海马自然凝胶电泳差异蛋白条带诱导神经干细胞迁移的作用

目的 :观察切割海马伞海马和正常海马组织自然凝胶电泳的差异性蛋白条带与大鼠神经干细胞共培养后细胞迁移的情况。方法 :用无血清培养技术从SD大鼠胚脑中分离、克隆和扩增神经干细胞备用。切割SD大鼠单侧海马伞 ,分别于术后不同时期取切割侧海马和正常侧海马进行 10 %的自然凝胶电泳。根据染色的蛋白条带位置将未染色的含差异蛋白条带的自然凝胶切成胶条块 ,分别放置于 2 4孔培养板各孔中并接种神经干细胞球与其共培养 ,观察神经干细胞的迁移情况。结果 :切割组蛋白胶块附近的神经干细胞球中的细胞特异性地向胶条方向迁移生长 ,这种现象切割组较正常组明显 ,在切割组中尤以 14天组最为显著。结论 :切割海马伞侧海马和正常海马组织自然凝胶电泳差异性蛋白条带能诱导神经干细胞向其定向迁移生长 。

利用荧光mRNA差异显示技术克隆短芒大麦盐胁迫相关基因的ESTs

目的 :获取短芒大麦盐胁迫相关基因的 ESTs。 方法 :应用荧光 m RNA差异显示技术进行筛选 ,并利用反向 North-ern杂交方法对差异片段进行快速鉴定以排除假阳性。结果 :共获得 32个与盐胁迫相关的 c DNA序列 ,并获得 Gen Bank注册号。BL AST同源性分析结果表明 ,1 3个与已知基因序列有同源性 ,1 9个为未知 ESTs。其类型分别为 :诱导表达型 ,2 2个 ;增强表达型 ,7个 ;抑制表达型 ,3个。 结论 :通过荧光 m RNA差异显示技术获得了短芒大麦盐胁迫相关基因的 ESTs。

小麦叶绿素缺失突变体Mt6172及其野生型叶片蛋白质组学双向差异凝胶电泳分析

以空间环境诱变获得的小麦叶绿素缺失突变体Mt6172的白化苗及其野生型邯6172的叶片为材料,进行双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)蛋白质组学分析。在1645个蛋白点中,发现100个差异1.5倍以上的蛋白点,对在分析胶中得到的85个点进行质谱鉴定,最终鉴定出29种差异蛋白的62个差异点,其中50个表达下调,12个表达上调,可分为10个功能群。表达下调的蛋白主要定位于叶绿体中,包括光系统I、光系统II、NAD(P)H脱氢酶复合体和ATP合酶的部分亚基,以及参与卡尔文-本森循环、糖代谢和应激反应的蛋白。非叶绿体蛋白中的大部分表达上调,主要参与抗氧化反应、转录激活和蛋白质折叠等途径。初步推断,光合作用主要蛋白复合体的缺失、叶绿体抗氧化能力的下降和叶绿体RNA转录后编辑途径受阻等可能是Mt6172白化致死的重要原因。

基于二维凝胶电泳的蛋白质定量分析技术

基于2DE的蛋白质定量分析技术通过对不同样品蛋白质表达差异的比较,定量地解析了蛋白质的动态变化,为了解和阐明细胞蛋白质功能及活动机制等提供了重要信息。本文简单介绍了传统2DE的“一个样品一块胶”模式的定量分析技术,指出其因为耗时、繁琐及重复性较差等,在常规2DE定量分析应用中受到了制约;阐述了近年来发展的“多样品共分离”模式的定量技术,包括荧光胶内差示电泳(DIGE)、“不同胶曝光”以及稳定同位素标记技术,这类技术因有效克服了传统技术的局限性,由此提高了定量分析的能力;分别对每种蛋白质定量技术及其优缺点作了比较和评述,并对2DE定量分析技术的未来发展方向做出了展望。