猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的荧光微球免疫学检测方法的建立

为了建立一种高通量、重复性好、特异性高的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的快速检测方法,本研究用纯化后的PRRSV非结构蛋白7(Nsp7)重组蛋白作为偶联抗原建立PRRSV抗体的荧光微球免疫学检测方法。对检测方法进行分析结果表明,批内、批间变异系数分别为3.2%、4.2%,与其他常见猪病阳性血清无交叉反应。当单抗浓度低至1 ng/mL时,该方法仍具有高灵敏度。本研究建立的荧光微球免疫学检测方法能快速检测临床样本PRRSV抗体,为PRRSV检测提供了一种新方法。

莱克多巴胺荧光微球免疫层析检测方法的建立

以荧光微球作为新型标记物,采用EDC法进行偶联,制备莱克多巴胺抗体荧光微球复合物,复合物粒度均一、性质稳定,并以之为探针建立莱克多巴胺荧光微球免疫层析检测方法,检测限为2.5ng/mL,且特异性强、检测范围宽。与胶体金免疫层析方法相比,荧光微球免疫层析方法的灵敏度更高,新型的荧光微球可以提高免疫层析方法的灵敏度。

快速检测牛奶中泰乐菌素残留的荧光微球免疫层析方法的建立

本研究旨在研制一种快速检测牛奶中泰乐菌素残留的荧光微球免疫层析试纸条。将包被抗原(0.80 mg/mL)和羊抗鼠IgG(1.01 mg/mL)喷涂在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质检线。对制备荧光微球抗体免疫复合物(免疫探针)的工艺参数做了一系列的优化,同时比较了不同标记方法对标记效率及稳定性的影响。结果表明,在pH值为6.0的最佳缓冲体系条件下,催化剂碳化二亚胺(EDC)用量为5μg,抗体100倍稀释添加20μL,检测时间低于25 min,检测限为25μg/L。本试验研制的荧光微球免疫层析试纸条具有简便快速、特异性良好、样本无需前处理等特点,可用于基层奶站和现场快速筛选。

荧光微球免疫层析方法定量检测水产品中4种硝基呋喃代谢物

采用荧光微球标记抗体作为信号探针,建立荧光微球免疫层析检测方法(fluorescent microsphere immunochromatographic assays,FMICA),并应用于水产品中4种硝基呋喃类兽药代谢物残留量的快速定量检测。结果表明:呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃西林代谢物FMICA试纸条的检出限分别为0.004(以1-氨基-乙内酰脲衍生物计算)、0.01(以5-吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮衍生物计算)、0.008(以3-氨基-2-恶唑烷酮衍生物计算)、0.009(以氨基脲衍生物计算)μg/L;检测线性范围分别为0.005~5、0.01~10、0.01~10、0.01~10μg/L;最佳检测时间为10 min,方法特异性良好。水产样品经衍生化处理后,经检测硝基呋喃代谢物的加标回收率在75.88%~104.81%之间,变异系数均小于15%。FMICA方法操作简单、快速、成本低,适用于水产品中硝基呋喃类兽药代谢物快速定量检测。

主客体结构微球的流式免疫荧光检测的方法

采用纳米氧化硅客体子球和聚苯乙烯磁性主体母球设计并制备了一种新型的主客体组装结构复合微球,将抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)抗体化学固载于组装微球表面,在流式免疫荧光检测平台中研究其免疫检测性能,并与传统的酶联免疫(ELISA)检测方法进行了比较.结果表明,主客体组装结构微球在流式免疫荧光检测中具有优异的检测性能,在微球用量极低的情况下仍然具有非常好的检测线性和检测重复性,并且空白限较传统的ELISA方法降低了6/7.

量子点荧光微球免疫层析试纸条定量检测恶性疟原虫

以羧基化Cd Te/Zn Se量子点荧光微球为荧光标记物,采用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）法偶联抗恶性疟原虫富组氨酸蛋白（Pf）单克隆抗体制备荧光探针;以羊抗恶性疟原虫组氨酸多克隆抗体和驴抗鼠二抗分别喷涂硝酸纤维膜,形成试纸条检测线和质控线,建立了免疫层析试纸条定量检测血清中恶性疟原虫的方法。所使用的羧基化量子点荧光微球的荧光强度为单个量子点的2800倍。实验结果表明,该荧光试纸条定量检测血清中恶性疟原虫线性范围为5.8-8010 Parasite/μL,最低灵敏度达到5.8 Parasite/μL,单个样品检测时间只需15 min。加标回收实验显示,试纸条批内回收率为93.0%-111.8%,批间回收率为98.3%-115.1%,且批内、批间的相对标准偏差均小于5%。

荧光微球免疫层析法定量检测牛乳中酪蛋白

目的研究用荧光微球免疫层析法定量检测牛乳中的酪蛋白。方法本文以酪蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔制备抗酪蛋白的多克隆抗体,将纯化后的多克隆抗体通过EDC介导法与荧光微球进行偶联,将滤纸、样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸组装成试纸条,用此荧光微球免疫层析法定量检测牛乳中的酪蛋白。结果试纸条在25 min内就能判定结果,最低检测限为100 ng/mL,该方法与BSA、OVA均无交叉反应,具有很好的特异性。检测酪蛋白浓度为100.0、500.0、1000.0 ng/mL的样品,试纸条的批内回收率分别为(89.03±5.2)%、(93.47±6.9)%和(91.2±7.8)%,批间回收率分别为(87.69±6.2)%、(92.73±8.3)%、(89.82±8.5)%。结论初步建立了一种快速、方便、高灵敏度的荧光微球免疫层析方法用以检测牛乳制品中的过敏原——酪蛋白。

聚集诱导发光微球免疫层析试纸条定量检测水产品中孔雀石绿

目的建立一种用于定量检测水产品中孔雀石绿的高灵敏免疫层析检测新方法。方法以聚集诱导发光荧光微球为标记探针,制备荧光免疫层析试纸条,通过T/C比值法构建定量检测孔雀石绿的定量标准曲线,并实现水产品中孔雀石绿的高灵敏、定量检测。结果本方法定量检测水产品中孔雀石绿具有较高的检测灵敏度,其50%抑制率达到0.17μg/kg,最低检出限为0.05μg/kg。样本加标0.25、0.50、1.00μg/kg的平均回收率介于116.01%~122.76%,变异系数介于8.66%~11.71%(n=10),表明所建立的荧光免疫层析方法定量检测水产品中孔雀石绿具有较好的准确性、精密度。通过检测30份孔雀石绿阴性以及12份阳性的水产样本,结果表明所建立的荧光免疫层析方法无假阳性,且检测孔雀石绿含量与液相色谱-串联质谱法具有良好的一致性(线性相关系数为0.9695)。结论本研究以聚集诱导发光荧光微球为新型标记探针,建立了一种高灵敏检测水产品中孔雀石绿的定量方法,为水产品中孔雀石绿的筛查检测提供了技术支撑。

应用荧光微球技术进行免疫检测研究

以聚苯乙烯羧基荧光微球为固相载体,将人免疫球蛋白G(IgG)和猪血红蛋白(Hb)分别与微球偶联,应用Luminex-100TM荧光微球检测系统检测抗体IgG和抗原Hb与荧光微球的偶联效率。结果表明,采用100μg.mL-1抗体或抗原浓度可以获得较高的偶联效率,且检测快速灵敏。应用荧光微球进行抗原抗体免疫检测可行。

微波微量免疫荧光检测斑点热立克次体方法的建立

目的 建立微波免疫荧光检测斑点热立克次体的方法。方法 通过微波促免疫荧光染色最佳时间、最佳火力的选择及微波免疫荧光方法与常规免疫荧光方法敏感性的比较。结果表明 :微波法反应速度快 ,只需 15min就可以观察结果 ,大大缩短了检测时间 ,提高了工作效率 ,并且两种方法在特异性上没有显著性差别。结论 我们认为微波免疫荧光方法是一种简便的、实用的快速检测立克次体的方法。

荧光微球免疫层析法快速检测基围虾中环丙沙星

本研究将环丙沙星单抗与带羧基的荧光微球偶联标记,将环丙沙星抗原和羊抗鸡IgY分别包被于硝酸纤维膜上作为检测线(T)和控制线(C),然后根据其荧光信号比值(T/C)和样本中环丙沙星药物浓度之间的对应关系建立了一种简单快速、高灵敏检测基围虾样本中环丙沙星药物残留的荧光微球定量免疫层析检测方法,检测过程可在15 min内完成。结果表明,在最优条件下,基围虾样本中的环丙沙星检测范围为0~10 ng·mL^(-1),检测限为0.208 ng·mL^(-1),回收率为90.59%~111.70%,变异系数为4.20%~10.76%。特异性实验表明环丙沙星抗体与其他喹诺酮类药物交叉反应率较低。本方法灵敏度高、准确度高、性能稳定、特异性好,可较好地满足现场快速定量检测基围虾样本中环丙沙星药物残留的需要。

荧光纳米微球免疫层析技术检测新型冠状病毒研究

采用碳二亚胺(EDC)法将抗新冠病毒核衣壳蛋白(N蛋白)单克隆抗体与稀土铕荧光纳米微球共价偶联,合成荧光标记免疫探针,并用透射电子显微镜进行表征。开发了一种检测新型冠状病毒的荧光免疫检测试纸条,通过荧光检测仪测定检测线上的荧光强度,建立了定量检测新冠病毒的荧光免疫检测技术。本研究研制的新冠病毒荧光免疫层析试纸条,与荧光检测仪配套使用,对新冠病毒N蛋白的最低检出限达到0.01 ng/mL;对新冠病毒检测特异性强,与肺炎支原体、禽流感病毒等其它呼吸道肺炎病原物无交叉反应;对新冠灭活病毒的检测,用本研究开发的荧光免疫试纸条技术与荧光定量PCR进行比对验证,灵敏度为荧光定量PCR的1/100;与胶体金抗原检测试纸条相比较,比胶体金试纸条灵敏10倍以上。本研究开发的新冠病毒荧光检测试纸条,操作简便、快速、灵敏、成本低、体积小,适于现场快速检测。

猴D型逆转录病毒p27基因的原核表达及流式免疫荧光微球检测技术的建立

目的构建猴D型逆转录病毒的p27蛋白,并建立流式免疫荧光微球检测技术用于猴D型逆转录病毒的检测。方法通过PCR扩增p27基因片段,与p GEX-4T-1表达载体进行连接,转化至BL21(DE3)进行表达。通过SDS-PAGE分析蛋白表达的形式及最佳诱导时间。采取GST树脂纯化目标蛋白,包被磁珠,建立流式免疫荧光微球检测技术,用于临床样本的检测。结果重组蛋白以可溶的上清液进行表达,诱导的最佳时间为4 h。包被磁珠后,成功建立流式免疫荧光微球检测技术,对阳性血清稀释81倍仍可检测为阳性,对猴类其他病原的阳性血清无交叉反应,特异性强,与ELISA法同时对24份临床样本进行检测,其中3份样品的流式免疫荧光微球检测结果为阳性,ELISA检测结果为2份阳性,1份阴性,两种方法的检测结果符合率为96%。结论成功表达猴D型逆转录病毒p27蛋白,并运用该蛋白建立了灵敏度高,特异性强,样本需求少的流式免疫荧光微球检测技术,为后续推广应用多重流式免疫荧光微球检测技术奠定了基础。

荧光免疫层析技术原理及其在病原微生物检测中的研究进展

荧光免疫层析技术是近年来开发的一种新型免疫检测技术,以荧光微球为标记物,既保留了传统胶体金试纸条检测速度快、价格便宜、操作简单、携带方便等优点,又通过荧光技术提高了检测的灵敏度。荧光免疫层析技术对实验设备、资源的要求低,特别适合在条件有限的实验室及野外开展动物疾病快速诊断。本文详细介绍了荧光免疫层析技术的原理及其在病毒、细菌、寄生虫等病原检测方面的应用研究,以期为病原微生物现场快速诊断技术的开发提供参考。

量子点荧光微球免疫层析试纸条定量检测玉米中赭曲霉毒素A

采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)法将抗赭曲霉毒素A(OTA)腹水与量子点荧光微球偶联制备荧光探针,以牛血清白蛋白-OTA偶联物及驴抗鼠二抗喷涂硝酸纤维膜形成试纸条检测线(T线)和质控线(C线),建立了基于T/C荧光强度(FI_T/FI_C)比值法免疫层析试纸条高灵敏度、快速定量检测玉米中OTA的新方法。量子点荧光微球试纸条定量检测OTA线性范围为0.05~1.0ng/mL(Y=0.259lnX+0.897,R^2=0.995),半数抑制浓度(IC_(50))为(0.215±0.023)ng/mL(n=5),玉米提取液中OTA的检出限为0.05 ng/mL,单个样品检测时间10min。加标回收实验表明,3个OTA加标浓度的平均回收率为107.2%-125.5%,相对标准偏差均小于10%。40个实际玉米样品检测结果表明,量子点荧光微球试纸条与酶联免疫吸附分析方法检测OTA的结果具有良好的相关性(R^2=0.975)。

硼酸化量子点荧光微球免疫层析试纸条定量检测甲胎蛋白

提高表面抗体活性是免疫检测探针制备的关键。硼酸可与IgG的糖基化Fc片段快速发生位点特异性结合,充分暴露抗原结合区Fab片段以提高抗体活性,避免常用的酰胺键共价偶联方法引起的抗体取向不当及自交联。本研究在合成硼酸修饰的聚马来酸酐-alt-1-十八碳烯(PBA-PMAO)的基础上,采用超声乳化法制备表面硼酸改性的量子点荧光微球(PBA-QBs)。该微球既可与抗体简便、快速地定向偶联,又因量子点含量高而具有很强的荧光信号。将其与甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体室温共孵育5 min制备高抗体活性的荧光免疫层析检测探针并用于定量检测AFP,线性范围为0.98~31.25 ng mL^(-1),最低检测限为0.45 ng mL^(-1),检测耗时20 min。血清样品中AFP的加标回收率为91.0%~107.1%,批内、批间变异系数介于3.65%~10.42%。

时间分辨荧光微球免疫层析法定量检测克伦特罗

建立了一种定量检测克伦特罗的时间分辨荧光微球免疫层析法。对抗体标记量、微孔中克伦特罗抗体-时间分辨荧光微球探针的体积以及检测线上抗原浓度进行了优化。通过时间分辨荧光微球试纸条检测仪读取试纸条上检测线和质控线的信号强度,以克伦特罗标准品的浓度为横坐标,以检测线和质控线信号强度的比值为纵坐标建立标准曲线。结果表明:该方法定量检测范围为0.01~0.81μg/L,检测限为0.004μg/L,半抑制率为0.06μg/L。本检测方法具有简便、灵敏度高、快速和可定量等特点,适合于大批量样品的现场筛查。

基于量子点微球荧光免疫层析法定量检测克百威的研究

建立了一种定量检测克百威的量子点微球荧光免疫层析法,优化了抗体标记量、探针体积以及抗原喷膜浓度。通过荧光试纸条检测仪读取试纸条上检测线和质控线的信号强度,以克百威标准品的浓度为横坐标,以检测线和质控线信号强度的比值为纵坐标建立标准曲线。结果表明,方法的定量检测范围为0.05~2.00 ng/mL,检测限为0.025 ng/mL,半抑制率为0.506 ng/mL。本方法具有简单、灵敏度高、快速和可定量等特点,适用于大批量样品中克百威的筛查。

磁微球为载体的H5N1 AIV免疫PCR检测方法分析

目的分析磁微球为载体的H5N1 AIV免疫PCR检测方法。方法模板选择pUC19,需要使用5’端标记的生物素作为引物,实现PCR扩增,进而制备有生物素的DNA分子。固相吸附载体选择磁微球,连接生物素标记的AIV H5N1血凝素蛋白和含有生物素的报告DNA分子,当两者结合之后,会将低含量病毒信号间接放大,建立起更加科学和可靠的检测H5N1 AIV免疫PCR方法。方法确定之后评价和分析PCR方法的灵敏性和特异性、最适报告DNA浓度等。结果采用免疫PCR检测方法可以成功检测到H5NI AIV病毒,确定报告DNA的最适浓度;此种方法也具有比较好的特异性和灵敏性。结论在建立免疫PCR检测方法的过程中以磁微球作为吸附载体,可以在检测H5N1 AIV时具有更高的灵敏性和特异性,是一种比较好的方法。

棘球蚴病的诊断检测方法

棘球蚴病(包虫病)是一种由棘球绦虫幼虫引起的慢性寄生虫病。该病的分布广泛,对牧区的经济造成了严重的损失。通过对棘球蚴病的虫体形态、生活史、流行病学、临床症状、病理变化,总结检测方法进行综述,以期为棘球蚴病的防治提供参考依据。