用荧光探针定量多聚酶链反应技术检测乙肝病毒宫内传播的研究

目的 :探讨孕妇血中乙肝病毒 (HBV)DNA数量与宫内传播的关系。方法 :用荧光探针定量多聚酶链反应 (FQ PCR)方法 ,检测 76例乙肝病毒表面抗原 (HBsAg)阳性孕妇血清中HBVDNA数量 ,2 6例HBVDNA阳性者肌注乙肝免疫球蛋白 ,新生儿出生后 2 4h内取末梢静脉血检测HBVDNA。结果 :孕妇血中HBVDNA阳性者其宫内感染率为 33.3% ,宫内感染与孕妇血中HBVDNA数量有关 ,HBVDNA数量高易导致胎儿宫内感染 ,乙肝免疫球蛋白免疫注射后可降低HBV宫内感染率。结论 :孕妇血中HBVDNA数量高易导致胎儿宫内感染 。

Taq Man探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测低温酸乳中常见的霉菌和酵母

为提高低温酸乳中霉菌和酵母菌检测效率,根据保守基因延伸因子1α(elongation factor 1α,EF-1α)序列分别针对霉菌与酵母菌设计引物与探针,利用实时荧光定量聚合酶链式反应,基于TaqMan探针分别建立霉菌和酵母菌检测方法。以低温酸乳中常见真菌与乳酸菌基因组DNA为扩增模板进行特异性检验,并对方法灵敏度与重复性进行检验,同时构建标准曲线。结果表明:根据EF-1α基因设计的引物与探针特异性良好;所构建的标准曲线相关系数均大于0.99;该方法检测酵母菌的灵敏度为101 CFU/mL,检测霉菌的灵敏度为102 CFU/mL;重复性检验中组内与组间的变异系数均小于2%,表明方法具有良好的可靠性与稳定性,适用于低温酸乳中霉菌与酵母菌的快速检测。

16S rRNA/DNA荧光定量多聚酶链反应检测肺炎婴幼儿肠道菌群变化

目的了解肺炎婴幼儿肠道菌群的变化,探讨16S rRNA/DNA荧光定量多聚酶链反应(PCR)技术在临床细菌定量分析中的可行性和实用性。方法提取23例健康儿童(健康对照组)和23例肺炎患儿(观察组)治疗后粪便标本的细菌DNA,测量和比较二组标本细菌的吸光度(A)260值;采用16SrRNA/DNA荧光定量PCR技术对二组粪便标本中的乳酸杆菌和大肠杆菌进行定量分析和比较。采用SPSS13.0软件进行统计学分析。结果健康对照组和观察组治疗第1、3、7天的粪便标本中细菌的A260值分别为(3381.2±817.2)mg/L、(1643.5±498.4)mg/L、(859.6±165.2)mg/L、(1263.8±337.3)mg/L;健康对照组和观察组治疗第1、3、7天比较,均有显著性差异(Pa<0.01);观察组患儿治疗第1、3、7天和健康对照组的肠道乳酸杆菌数量(拷贝数/g湿便)的对数值分别为(5.19±0.48)、(6.94±0.66)、(6.05±0.57)和(9.13±0.53);大肠杆菌数量的对数值分别是(6.99±1.17)、(7.38±1.08)、(6.76±1.17)、(7.52±0.44),健康对照组和观察组比较,均有显著性差异(Pa<0.01)。结论肺炎患儿随治疗时间长短菌群数量有差异;16S rRNA/DNA荧光定量PCR技术在临床细菌定量分析中是切实可行的。

多重荧光定量聚合酶链反应法检测肉制品中的3种食源性致病菌

目的建立多重荧光定量聚合酶链反应法(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)快速检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌的方法。方法根据沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌的hemolysin基因、大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列分别设计特异性引物及探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌多重qPCR方法。结果该方法只扩增3种靶细菌,对其他供试菌不扩增;沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的检出限分别为10^(1)、10^(2)、10^(2)拷贝数/μL,并且拥有良好的重复性和特异性。人工污染的猪肉样品经SLE培养基富集8 h后,分别可以检测到初始菌液浓度为1.56×10^(2)CFU/25 g的沙门氏菌,2.13×10^(2)CFU/25 g的单增李斯特菌,2.32×10^(2)CFU/25 g的大肠杆菌O157:H7。结论所建立的多重qPCR灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌,在提高食品安全和保护人类健康方面有重要意义。

荧光定量多聚酶链反应检测HBV-DNA

目的 探讨荧光定量多聚酶链反应 (FluorescencequantitativePCR ,FQ PCR)检测HBV DNA的可行性及优缺点。方法 采用FQ PCR、斑点杂交分别检测由ELISA定性的 2 0 3份血清样品 (大三阳、小三阳、乙肝疫苗免疫者、健康人 )。结果 FQ PCR和斑点杂交阳性检出率分别是 96 4 9%、2 8 2 4 % (大三阳 ) ,85 96 %、5 88% (小三阳 ) ,P <0 0 5 ;斑点杂交阴性血清FQ PCR定量高达4 7× 10 5COPY/ml。结论 FQ PCR检测HBV DNA灵敏、可靠 。

荧光定量聚合酶链反应检测脑脊液中结核分枝杆菌DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎的应用价值分析

目的 探究荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测脑脊液中结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)的应用价值。方法 选择2019年7月—2021年6月于安陆市普爱医院就诊的存在脑膜刺激征的80例患者作为研究对象,所有患者均经MTB培养后明确诊断,将确诊为TBM的37例患者分入脑膜炎组,疑似TBM的18例患者分入疑似组,非TBM的25例患者分入非TBM组,对3组患者行腰椎穿刺,留取5 m L脑脊液及时送检,分别行MTB培养法、抗酸染色涂片法、荧光定量PCR检测。对比3种检测方法在MTB中的阳性检出率,对比脑膜炎组与疑似组患者MTB的DNA检测数值。结果 脑膜炎组应用荧光定量PCR检测MTB的阳性检出率高于疑似组,差异有统计学意义(P<0.05);脑膜炎组与疑似组采用MTB培养法、抗酸染色涂片法的MTB阳性检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。脑膜炎组患者MTB的DNA检测数值为(4.71±0.97),疑似组患者MTB的DNA检测数值为(4.35±0.83),2组患者MTB的DNA检测值比较,差异无统计学意义(t=1.351,P=0.183)。结论 应用荧光定量PCR检测脑脊液中MTB的DNA,有助于判断TBM患者病情严重程度,在鉴别诊断TBM中具有较高的临床应用价值,为临床诊疗提供新思路及方向,值得临床推广应用。

荧光探针定量聚合酶链反应检测684例女童泌尿生殖道淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体感染情况

目的了解女童泌尿生殖道淋病双球菌、沙眼衣原体、解脲支原体感染情况。方法对684例有泌尿生殖道感染症状的女童取阴道分泌物,采用荧光探针定量聚合酶链反应(PCR-荧光探针法)进行淋病双球菌、沙眼衣原体、解脲支原体检测。结果 684例患儿19例淋病双球菌阳性,12例沙眼衣原体阳性,31例解脲支原体阳性。结论对于有反复泌尿生殖道感染的女童,临床上应考虑相关病原体感染的可能,建议进行此3种病原体的检查,以指导临床治疗。

实时荧光定量聚合酶链反应突触后密度蛋白93基因TaqMan探针的制备

目的:制备实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)突触后密度蛋白93(PSD93)基因TaqM an探针以进一步研究PSD93表达情况。方法:采用RT-PCR法,从生后1天的SD大鼠大脑组织mRNA中扩增PSD93基因部分CDS区片段,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定及序列测定,采用TaqM an探针,以重组质粒为模板绘制标准曲线。结果:RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度113bp相符,DNA序列测序的结果与GenBank提供的已知序列(RNU50717)比较,所克隆的PSD93基因片段与其中的113bp完全相同,与PSD93基因100%同源。以重组质粒为模板绘制标准曲线,相关系数r大于0.99,反应效率为0.95,各点变异系数小于20%。结论:采用RT-PCR和T载体技术成功获得FQ-PCR PSD93基因TaqM an探针。

TaqMan-MGB探针荧光定量聚合酶链式反应法检测酸奶制品中动物双歧杆菌BB-12

目的建立一种TaqMan-小沟结合物(minor groove binder,MGB)探针荧光定量聚合酶链式反应法检测酸奶制品中动物双歧杆菌BB-12的分析方法。方法设计动物双歧杆菌BB-12的16SrRNA序列的MGB探针,利用荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术,构建目标序列的过表达载体,提取质粒进行标准曲线的绘制,最后进行市售酸奶样品检测,定量酸奶中BB-12菌株的数量。结果所有载体标准品均产生显著的荧光增幅,循环阈值(cycle threshold, Ct)介于16~20之间;而以其他酸奶制品添加菌及大肠杆菌样品DNA为模板则无荧光扩增信号。在检测灵敏度方面,BB-12载体可被稳定检出的质量浓度低至0.0000584 ng/μL, Ct值平均数为28.73,即检测灵敏度低至为0.05 pg。绘制的标准曲线线性良好,扩增效率E为0.39,判定系数R^(2)=0.9999。市售酸奶样品检测特异性好、灵敏度高、定量结果准确。结论本研究建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测法可实现在酸奶中对BB-12菌种的检测及定量。

全自动核酸提取及荧光定量多聚酶链式反应分析系统对HBV-DNA试剂盒检测性能的验证及评价

目的:评估全自动核酸提取仪及荧光定量多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分析系统Anadas9850检测乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)的性能。方法:根据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institution,CLSI)批准指南,对全自动核酸提取及荧光PCR分析系统Anadas9850检测HBV-DNA试剂盒进行性能评估实验,包括精密度、正确度、线性实验、最低检测限、抗干扰能力。结果:在精密度方面,批内精密度高值、低值CV分别是1.71%和2.64%,批间精密度高值、低值CV分别是2.40%和2.61%;在正确度方面,标本检测结果对数值与给定的质控品靶值的对数值差值在±0.4个log值;线性检测范围,在50~5.0×10^(8) U/mL的梯度范围具有良好的线性,线性回归方程为Y=0.9385X+0.2552,R^(2)=0.9986;在最低检出限方面,实验结果的检出率为100%,符合检出要求;在抗干扰能力方面,溶血、高血脂、高胆红素对检测结果无影响。结论:全自动核酸提取及荧光PCR分析系统Anadas9850检测HBV-DNA的各项性能参数均符合临床检测的要求,可以在临床检测中使用。

荧光定量聚合酶链反应检测人类乳头瘤病毒在尖锐湿疣中的应用

目的:对尖锐湿疣(CA)患者进行人类乳头瘤病毒(HPV)DNA定量测定及HPV分型。方法:用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)对146例CA患者疣体组织进行HPV6.11型和HPV16.18型的分型检测及HPVDNA定量测定。结果:146例CA患者标本中检出HPV6.11和HPV16.18型感染阳性143例(97.95%)。其中单独HPV6.11型阳性104例,占71.24%;单独HPV16.18型阳性16例,占10.96%;HPV6.11和HPV16.18型同时阳性23例,占15.75%;HPV6.11和HPV16.18型同时阴性3例,占2.05%。定量测定结果显示:HPV6.11型患者病毒载量最高1.0×108拷贝/mL,最低2.8×103拷贝/mL,HPV16.18型患者病毒载量最高1.0×108拷贝/mL,最低2.57×104拷贝/mL。结论:CA患者应用FQ-PCR检测HPV阳性率高,并可快速区分高危型及低危型HPV感染,对尖锐湿疣复发及癌变作出可能性预测。

实时荧光定量聚合酶链反应在丙型肝炎诊断中的临床应用价值

目的探讨丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)和丙型肝炎病毒核酸(HCV RNA)荧光定量检测在丙型肝炎诊断中的临床应用价值。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测358例血清中HCV RNA载量及抗-HCV。结果 358例慢性丙型肝炎患者抗-HCV和HCV RNA检出率分别为78.8%和54.2%,经χ2检验差异有统计学意义(P<0.05),HCV RNA的平均载量为4.85×105 copies/mL。结论FQ-PCR检测血清中HCV RNA的载量,是判定HCV感染的直接证据,它反映HCV的活动性和复制程度,有利于抗病毒治疗的疗效观察。抗-HCV和HCV RNA联合检测对丙型肝炎病毒的早期诊断有重要临床应用价值。

荧光定量聚合酶链反应在一期梅毒诊断中的临床意义探讨

为评价荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在一期梅毒诊断中的临床应用价值,以暗视野(D-F)、血清学(RPR/TPHA)检查方法作对照,用FQ-PCR方法检测68例疑诊为一期梅毒病人的生殖器溃疡处分泌物。在68例疑诊为一期梅毒病人中,D-F阳性率27.94%(19/68),RPR阳性率48.53%(33/68),TPHA阳性率61.76%(42/68),FQ-PCR阳性率44.12%(30/68),FQ-PCR与D-F、TPHA比较有显著性差异(P<0.05),与RPR比较无显著性差异(P>0.1)。本研究表明FQ-PCR检测生殖器溃疡TP在一期梅毒诊断中有一定的价值。

荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌的价值

目的分析使用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测结核分支杆菌的应用价值。方法收集首都医科大学附属北京同仁医院临床各科室各类结核病或疑似结核病患者检测标本178例,使用FQ-PCR法进行结核分枝杆菌脱氧核糖核酸检测,标本同时进行抗酸染色显微镜下观察。结果 FQ-PCR法和抗酸染色涂片法对不同来源标本检测结核分枝杆菌的结果存在较好的一致性(Kappa=0.615,P<0.01)。使用FQ-PCR法检测结核分枝杆菌的阳性检出率为12.9%,抗酸染色涂片法的阳性检出率为6.2%,二者比较差别有统计学意义(χ2=4.682,P<0.05)。结论 FQ-PCR法检测标本中的结核分枝杆菌的灵敏度高于传统的抗酸染色涂片法,可作为结核病病原学诊断的优先方法。

荧光定量聚合酶链反应在小儿人巨细胞病毒感染检测中应用

目的探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）在小儿人巨细胞病毒（HCMV）感染检测中的临床应用价值。方法选择2012年1月至2013年10月在武汉市妇女儿童医疗保健中心就诊的疑似HCMV感染患儿血清或尿液标本,其中血清标本454例,尿液标本1 001例,患儿男女比为1 005∶394,年龄1天~3岁。用FQ-PCR检测疑似HCMV感染患儿血清和尿液中的HCMV-DNA,比较两种标本的阳性率。结果 1 001例尿液标本的HCMV-DNA阳性率为46.35%（464/1 001）,显著高于血清标本的阳性率5.95%（27/454）;56例血清和尿液标本HCMV-DNA进行配对检测,其中血清检测阴性的52例中有23例尿液检测为阳性,而血清检测阳性的4例尿液检测均为阳性。结论应用FQ-PCR检测患儿HCMV-DNA,采用尿液标本可提高阳性检出率。

荧光定量聚合酶链反应检测乙肝病毒及其临床意义

目的 :研究HBVDNA含量与乙型肝炎血清学免疫标志物表达关系及HBVDNA含量与肝细胞损害关系。方法 :以完全闭管式的PCR和荧光探针技术相结合的实时检测定量PCR方法 ,对 110例病毒性肝炎患者血清HBVDNA进行检测。结果 :HBeAg阳性 /抗HBe阴性患者HBVDNA拷贝数与HBeAg阴性 /抗HBe阳性患者或HBeAg阴性 /抗HBe阴性患者的拷贝数比较差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,而后二者比较差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;HBVDNA拷贝数与肝实质损害指标血清谷丙转氨酶 /谷草转氨酶 (ALT/AST)、总胆红素 (TBIL)、白蛋白 (ALB)、凝血酶原活动度 (PTA)不具相关性。结论 :抗e抗原抗体非病毒复制终止的标志、病毒性肝炎的肝实质损害程度与血清HBVDNA的含量无相关性。

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测结肠癌中Syndecan-1 mRNA和HPA-1 mRNA的表达及临床意义

背景与目的:侵袭转移是导致结肠癌死亡率增加的主要原因,如何阻断肿瘤的侵袭转移成为目前研究的热点。本研究旨在检测Syndecan-1基因和HPA-1基因在结肠癌组织中的表达水平,探讨二者与结肠癌侵袭转移及预后的关系。方法:用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测49例结肠癌、49例配对的癌旁组织(距癌2cm)和49例配对远离结肠癌的手术切缘正常组织(距癌5cm以上)的Syndecan-1和HPA-1基因的表达水平,分析二者与结肠癌临床病理特征的关系。结果:结肠癌中HPA-1mRNA的表达水平(40.56±11.75)显著高于癌旁组织(18.28±11.33)和正常组织(10.80±10.20)(P均<0.001),癌旁组织明显高于正常组织(P<0.05);正常结肠组织中Syndecan-1mRNA表达水平(61.21±12.96)显著高于癌旁组织(14.35±11.06)和结肠癌组织(10.12±8.58)(P均<0.001),癌旁组织明显高于结肠癌组织(P<0.05)。Syndecan-1mRNA的表达减弱和HPA-1的表达增强与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期显著相关(P均<0.05)。Spearman等级相关分析证明了Syndecan-1mRNA和HPA-1的表达呈明显负相关(r=-0.405,P<0.05)。结论:Syndecan-1mRNA在结肠癌组织中呈低表达,HPA-1mRNA在结肠癌组织中呈高表达,且Syndecan-1mRNA的表达减弱与HPA-1的表达增强可促进结肠癌的侵袭转移。联合检测Syndecan-1mRNA及HPA-1mRNA对于指导结肠癌临床治疗及判断预后有重要价值。

实时荧光定量聚合酶链反应检测支气管肺泡灌洗液中结核分枝杆菌-DNA对肺结核的诊断价值

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应法(FQ-PCR)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中结核分枝杆菌-DNA(TB-DNA)对肺结核的诊断价值。方法肺结核52例(菌阳20例,菌阴32例),肺炎35例,采用FQ-PCR法检测其支气管肺泡灌洗液中TB-DNA水平。结果52例肺结核组的阳性率为65.4%(菌阳19例,菌阴15例),35例非肺结核组的阳性率为5.7%,经统计学比较,FQ-PCR法检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和培养法(P均<0.05),FQ-PCR法特异性高。结论FQ-PCR法检测BALF中TB-DNA为痰涂片阴性及无痰患者提供良好的诊断依据。