牛冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立特异灵敏的牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)荧光定量PCR检测方法,并对牛源性样本进行筛查。方法根据Genbank中登录的BCV的N基因序列设计Taq Man引物探针,建立基于Taq Man探针法的BCV PCR检测方法,对收集到的牛源样本进行BCV筛查,并对部分阳性样本的PCR产物进行测序鉴定。结果建立了能够特异检测BCV的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,其标准曲线相关系数Slope为-3.417,相关系数r2为0.999,,扩增效率Eff为96.195%。该方法检测BCV的敏感度为40 copies。使用该方法检测64份牛肛拭子样本检出率为1.5%,检测33份牛源生物制品检出率为6%,部分阳性样本的PCR产物经测序比对为BCV核酸序列,说明BCV在国内牛群中流行,牛源相关生物制品中有感染BCV的潜在风险。结论经测序验证,建立的方法能够灵敏的检测样本中的BCV核酸,应加强牛源相关生物制品中BCV的监测,避免人感染BCV的潜在风险。

鼠痘病毒FQ-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立鼠痘病毒(ECTV)的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,并对实验室保存的裸鼹鼠组织样本、小鼠组织样本以及黄鼠组织样本进行检测。方法根据Gen Bank中鼠痘病毒的crm D基因序列设计引物探针,建立ECTV的FQ-PCR检测方法,对保存的样本进行筛查,并对部分阳性样本进行测序鉴定。结果建立的ECTV FQ-PCR检测方法灵敏度高、特异性强,最低能检测到ECTV核酸浓度为10 copies/μL的样本,方法的标准曲线相关参数符合标准。使用该方法检测实验室63份裸鼹鼠脾组织样本和22份小鼠脾组织样本,结果全为阴性,检测4只黄鼠组织样本,结果阳性率为50%。阳性样本进行PCR检测后测序比对为ECTV核酸序列。结论经验证,建立的ECTV FQ-PCR检测方法能够灵敏特异的对样本中的ECTV进行筛查,实验室小鼠的日常监测不应忽视ECTV污染的潜在风险。

关于中成药水蜜丸制剂掺伪米粉监管方法的研究

目的:为了解决中成药水蜜丸掺伪米粉无检测方法的问题,引入普通PCR方法和荧光探针PCR方法并制定相应新标准,以完善中成药掺伪检测的监管体系。方法:以通宣理肺丸为例,着重介绍引入PCR方法在完善中成药米粉掺伪检测体系中发挥的新作用。方法通过优化样品前处理和DNA提取过程,采用生物信息学分析和试验验证对检索得到的引物和探针特异性进行评估,并对2种方法的特异性、检出限、精密度和重复性进行考察和比较,对市售样品进行筛查。结果:试验通过评估DNA分子提取质量,选定了天根DNA提取试剂盒;建立了普通PCR方法和荧光探针PCR方法,并获得了适合于本研究的特异性引物和探针;2种PCR方法的检出限均为1 g·Kg^(-1);普通PCR方法精密度和重复性良好,荧光探针PCR方法的精密度RSD为1.56%(Ct值=29.74),重复性RSD为1.98%(Ct值=29.88)。试验对3个厂家9批次样品进行筛选,结果表明6批次A厂家的样品掺入了米粉。PCR产物经过克隆测序后,与NCBI数据库比对,确认为水稻(Oryza sativa L.)。根据不同PCR检测方法的特点,通过参考其他行业标准,首次制定了中成药掺伪米粉的PCR检验检测标准。结论:建立了水蜜丸中普通PCR和荧光探针PCR掺伪检测方法并制定相应检测标准,通过新方法和新标准的建立,弥补了掺伪检测在监管中的漏洞,完善了中成药监管的标准化体系。

九味羌活丸和香砂养胃丸制剂米粉掺伪检测方法的建立和质量标准的制定

目的:建立荧光探针PCR检测方法并拟定质量标准,旨在实现快速、准确地检出九味羌活丸(水丸)和香砂养胃丸(水丸)中的掺伪米粉。方法:通过优化样品提取方法,有效提取九味羌活丸和香砂养胃丸复方的基因组;通过文献检索和生物信息学分析,筛选得到适用于本试验的米粉特异性引物和TaqMan探针,并优化PCR检测方法。实验对方法的特异性、检出限、精密度和重复性进行考察,对市售样品进行筛查,并拟定了中成药荧光探针PCR检测方法的检测标准。结果:本实验优化了样品的前处理方法,通过文献检索和生物信息学分析检索到3组特异性引物和探针,并筛选得到了适合本研究的引物和探针。荧光探针PCR方法的检出限为每克样品可检出0.001 g米粉。九味羌活丸精密度的C_(t)值为30.34,相对标准偏差(RSD)为1.23%;重复性的C_(t)值为29.88,RSD为1.98%。香砂养胃丸精密度的C_(t)值为35.43,RSD为2.63%;重复性的C_(t)值为35.09,RSD为2.11%。对市售的7个厂家13批次样品进行分析,检出来自A厂家的5批次九味羌活丸和2批次香砂养胃丸掺入了米粉。利用克隆测序的方法,对PCR产物进行再确认,经NCBI数据库比对,结果均为水稻(Oryza sativa L.)。本研究拟定了九味羌活丸(水丸)和香砂养胃丸(水丸)荧光探针PCR检测方法标准。结论:建立了米粉的荧光探针PCR检测方法,并拟定质量标准,可快速准确地鉴别出米粉掺伪的九味羌活丸和香砂养胃丸样品,为中成药荧光探针PCR方法的标准制订提供参考。