荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用研究

探讨在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,观察分析应用价值。方法 本研究的时长段在2022年6月到2023年6月,统共1000例结核患者接受治疗,所有病患都拓展了抗结核药物的测验,且每一位患者的标本均予以荧光定量PCR探针熔解曲线法检测,药物敏感性测定结果为黄金基准,考察判辨荧光定量PCR探针熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的诊断效能。结果 针对1000例的标本中,经过液体药敏试验检测显示对利福平药物耐药例数250例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者;对异烟肼医药有耐药性的液体药敏试验500例,应用溶解曲线检测耐药性包含了470例;经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数170例,予以熔解曲线法显示耐药140例。经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数300例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者。熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的灵敏度分别为84.00%、84.00%、47.06%、66.67%;特异度分别为96.00%、90.00%、84.34%、94.29%;准确度分别为93.00%、97.00%、91.00%、86.00%。结论 在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,可得到较高的应用价值,灵敏度、特异度、准确度较高,可筛查结核病患者对利福平、异烟肼、乙胺丁醇等药物的耐药性,为临床治疗疾病提供可靠的依据。

液体培养法与荧光探针PCR检测阴道分泌物中解脲脲原体的应用价值

目的评价荧光探针聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法与液体培养基培养法检测阴道分泌物中解脲脲原体(ureaplasma urealyticum,UU)的临床应用价值。方法选取江苏省东台市人民医院检验科2019年1月—2021年12月收治的138例疑似泌尿生殖道感染者,分别采用荧光探针PCR法和液体培养法检测阴道分泌物,以Amsel临床诊断标准为金标准,比较两种方法的解脲脲原体检出率,并比较联合方式和单一方式检测疾病的诊断效能,对比两种方式报告获取时间。结果液体培养基培养法对UU的检出率为76.09%,高于荧光探针PCR法的57.25%,差异有统计学意义(P=0.031);两种方式联合对疾病的诊断灵敏度、特异度和准确率高于单一检测方式,差异有统计学意义(P<0.05)。荧光探针PCR法报告获取时间明显短于液体培养基培养法,差异有统计学意义(P<0.05)。结论建议临床联合使用两种方法同时检测,更有利于解脲脲原体感染的诊断和治疗。

PCR荧光探针法检测4种生殖道病原体的结果分析

目的探讨PCR荧光探针法、培养法、胶体金法和酶联法检测淋病奈瑟菌、解脲脲原体、沙眼衣原体及单纯性疱疹病毒-2型的阳性检出率,评价不同检测方法检测4种生殖道病原体的结果差异和应用价值。方法收集北京佑安医院性病门诊就诊者生殖道分泌物1738例、血液标本227例,采用PCR荧光探针法进行解脲脲原体、淋球菌、沙眼衣原体、单纯性疱疹病毒-2型检测,并同时采用培养法检测解脲脲原体、淋球菌;胶体金法检测沙眼衣原体;ELISA法检测单纯性疱疹病毒-2抗体,对PCR荧光探针法及其他3种方法检测结果进行分析。结果478例PCR荧光探针法和培养法同时检测解脲脲原体中,PCR荧光探针法检测阳性率[38.7%(185/478)]略低于培养法检测阳性率[39.96%(191/478)],差异无统计学意义(P>0.05);654例PCR荧光探针法和胶体金法同时检测沙眼衣原体中,PCR荧光探针法检测阳性率[7.34%(48/654)]高于胶体金法检测阳性率[3.21%(21/654)],差异有统计学意义(P<0.001);379例PCR荧光探针法和培养法同时检测淋球菌中,PCR荧光探针法检测阳性率[9.50%(36/379)]略高于培养法检测阳性率[7.65%(29/379)],差异无统计学意义(P>0.05);227例PCR荧光探针法和ELISA法同时检测单纯性疱疹病毒-2型中,PCR荧光探针法检测阳性率[3.52%(8/227)]低于ELISA法检测阳性率[10.57%(24/227)],差异有统计学意义(P<0.05)。结论PCR荧光探针法可提高衣原体、淋球菌检出率,可用于解脲脲原体特异性检测和单纯性疱疹病毒-2型现症感染检测。

实时荧光PCR探针法和DNA测序法应用于CYP2C9和VKORC1基因检测的对比研究

目的:比较实时荧光PCR探针法和DNA测序法检测细胞色素氧化酶P450(CYP2C9)和维生素K环氧化物还原酶复合体1(VKORC1)基因多态性的一致性,建立适用于临床推广的华法林基因多态性检测的方法。方法:本研究随机收集清远市人民医院20例就诊患者的全血标本,应用实时荧光PCR探针法和DNA测序法检测其CYP2C9和VKORC1基因的多态性,结果运用Excel软件统计并进行比较分析。结果:两种方法对CYP2C9和VKORC1基因多态性的检测结果一致,且实时荧光PCR探针法比DNA测序法更简易、经济、快捷。结论:与DNA测序法相比,应用实时荧光PCR探针法检测CYP2C9和VKORC1基因的突变具有较高的临床应用价值,比较适用于临床检测。

PCR荧光探针法在Y染色体微缺失检测中的应用

目的比较无精子症因子(azoospermia factor,AZF)PCR荧光探针法与多重聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳检测法的结果吻合度。方法收集2016年6月至2017年6月来我院就诊的208例男性不育患者外周血。根据WHO 2010年第5版精液分析操作指南将208例患者分为正常精子症组、无精子症组和少精子症组。用PCR荧光探针法对208例男性不育患者检测Y染色体无精子症因子,然后采用多重聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳检测208例不育患者Y染色体无精子症因子。结果在208例不育男性患者中,正常精子症组有100例,无精子症组47例,少精子症组61例。PCR荧光探针法检测Y染色体无精子症因子,少精子症组1例AZFc区(SY254/SY255)缺失,无精子症组1例AZFabc区缺失,正常精子症组未发现基因缺失类型。多重聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳检测法结果与PCR荧光探针法检测结果一致。结论 2种方法检测的患者无精子症因子基因的结果吻合度一致。与多重聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳检测法相比,PCR荧光探针法一次上样可以做48个样本,节省了时间与成本,结果自动保存,可以作为Y染色体微缺失检测的推荐方法。

免疫胶体金法及荧光探针PCR法在结核分枝杆菌快速菌型鉴定中的应用

目的 探究免疫胶体金法及荧光探针PCR法在结核分枝杆菌（MTB）快速菌型鉴定中的应用价值.方法 选择2015年2月~2016年8月在我院接受诊治肺结核患者的痰样本,经MGIT960 TM液体快速培养获取的分枝杆菌阳性菌240株,采用荧光探针PCR法和免疫胶体金法鉴定MTB.结果 荧光探针PCR检测：特异度为97.14%（34/35）,灵敏度为100.00%（205/205）,假阴性为0.00%（0/205）,假阳性为2.86%（1/35）;免疫胶体金法MPB64抗原检测：特异度为100.00%（35/35）,灵敏度为97.56%（200/205）,假阴性为2.44%（5/205）,假阳性为0.00%（0/35）.结论 在液体培养时采用荧光探针PCR法和免疫胶体金法检测MPB64抗原均能快速可靠的鉴定MTB,具有较高的应用价值.但免疫胶体金法检测MPB64抗原的实验室条件要求低,操作简便,更易在临床TB实验室中应用.

PCR荧光探针法诊断急性白血病化疗后结核1例并文献复习

急性白血病化疗后发热并肺部阴影多见,若行经验性抗菌治疗效果不好,需行进一步鉴别诊断,明确病原体,做到目标治疗。我科收治1例白血病病人化疗后反复发热,经PCR荧光探针法确诊为肺部结核,经抗结核治疗获得较好疗效。本文报告其临床资料,并结合相关文献介绍白血病合并肺部结核的特点以及PCR荧光探针法诊断的优势。

PCR荧光探针法联合DNA微阵列芯片法检测在肺结核诊断和治疗中的应用

目的探讨PCR荧光探针法联合DNA微阵列芯片法检测在肺结核诊断和治疗中的应用效果。方法选取2020年1月至10月上饶市第二人民医院收治的128例肺结核患者为观察组,另外选取同期40例非肺结核患者为对照组,留取两组对象晨痰,采用痰涂片抗酸染色、血清结核抗体及PCR荧光探针法进行结核分枝杆菌检测,再采用DNA微阵列芯片法将PCR荧光探针法检出结核分枝杆菌的痰液进行结核耐药性检测,比较三种方法的诊断效能,统计DNA微阵列芯片法检测利福平和异烟肼耐药性结果。结果PCR荧光探针法诊断肺结核的灵敏度、特异度、阳性预测值、准确度高于痰涂片抗酸染色、血清结核抗体检测,差异有统计学意义(P<0.05);应用DNA微阵列芯片法检出利福平敏感45例,耐药11例;异烟肼敏感44例,耐药12例;双重耐药5例。结论PCR荧光探针法联合DNA微阵列芯片法既能提高结核分枝杆菌的阳性率,也能快速检测结核分枝杆菌的耐药性,检测速度快,48 h即可获得诊断及耐药结果,可以协助早期诊断,制定有效的治疗方案,对改善肺结核患者预后具有重要意义。

牛冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立特异灵敏的牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)荧光定量PCR检测方法,并对牛源性样本进行筛查。方法根据Genbank中登录的BCV的N基因序列设计Taq Man引物探针,建立基于Taq Man探针法的BCV PCR检测方法,对收集到的牛源样本进行BCV筛查,并对部分阳性样本的PCR产物进行测序鉴定。结果建立了能够特异检测BCV的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,其标准曲线相关系数Slope为-3.417,相关系数r2为0.999,,扩增效率Eff为96.195%。该方法检测BCV的敏感度为40 copies。使用该方法检测64份牛肛拭子样本检出率为1.5%,检测33份牛源生物制品检出率为6%,部分阳性样本的PCR产物经测序比对为BCV核酸序列,说明BCV在国内牛群中流行,牛源相关生物制品中有感染BCV的潜在风险。结论经测序验证,建立的方法能够灵敏的检测样本中的BCV核酸,应加强牛源相关生物制品中BCV的监测,避免人感染BCV的潜在风险。

乙型肝炎病毒核酸定量检测的临床应用(荧光定量PCR法)

采用相应措施对乙型肝炎患者进行临床检查,观察并分析乙型肝炎血清学相应检查指标与乙型肝炎患者病毒核酸浓度之间的存在联系。方法:从2019年1月-2019年12月这一时段中,于我院接收的乙型肝炎病人合理选择200例作为本次实验研究组,选择同期健康人群20例组成本次研究对照组,220例研究对象均实行荧光定量PCR法进行血清HBV-DNA PCR定量检测,对比两组乙肝病毒核酸检测结果,并分析荧光定量PCR法的检验效果。结果:研究结果显示:HBeAg、 HBsAg、抗-HBc均显示为阳性的病患,其HBV-DNA水平与其他患者相比更高,数据差距明显具有统计学意义(P<0.05)。结论:采用荧光定量PCR法对于检测乙型肝炎患病情况具有良好的检测效果,能够为乙型肝炎病毒感染者的早期诊断以及后续临床治疗方案的选择和实行提供可靠的参考依据,可将其广泛普及和运用于临床检验。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒与猪圆环病毒2型双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)TaqMan双重荧光定量PCR检测方法,研究根据Gen Bank中已登录的PRRSV-M基因序列和PCV2cap基因序列,设计了2对特异性引物和2条Taq Man探针。结果显示以含有PRRSV-M基因和PCV2-cap基因的重组质粒为模板绘制的标准曲线,其相关系数(R^(2))均大于0.99,线性关系较好。该方法仅对PRRSV和PCV2检测为阳性,而对PRV、CSFV、PEDV、TGEV检测结果均为阴性,表明其特异性较好。检测下限约为10拷贝/μL,重复性试验结果显示该方法的组内和组间变异系数均小于1.5%,利用国标荧光定量PCR方法与本实验建立的方法分别对42份临床样品进行检测,二者对PRRSV和PCV2检测的符合率分别可达96.4%和100%。研究表明所建立的荧光定量PCR方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于PRRSV和PCV2的双重定量检测。

鼠痘病毒FQ-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立鼠痘病毒(ECTV)的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,并对实验室保存的裸鼹鼠组织样本、小鼠组织样本以及黄鼠组织样本进行检测。方法根据Gen Bank中鼠痘病毒的crm D基因序列设计引物探针,建立ECTV的FQ-PCR检测方法,对保存的样本进行筛查,并对部分阳性样本进行测序鉴定。结果建立的ECTV FQ-PCR检测方法灵敏度高、特异性强,最低能检测到ECTV核酸浓度为10 copies/μL的样本,方法的标准曲线相关参数符合标准。使用该方法检测实验室63份裸鼹鼠脾组织样本和22份小鼠脾组织样本,结果全为阴性,检测4只黄鼠组织样本,结果阳性率为50%。阳性样本进行PCR检测后测序比对为ECTV核酸序列。结论经验证,建立的ECTV FQ-PCR检测方法能够灵敏特异的对样本中的ECTV进行筛查,实验室小鼠的日常监测不应忽视ECTV污染的潜在风险。

PCR-HBV定量与TR-FIA法检测乙肝五项的临床价值

目的:通过PCR-HBV定量检测HBV-DNA与时间分辨法(TR-FIA)检测乙肝五项结果间相关性分析,探讨两种方法的临床应用价值。方法:采用时间分辨法与PCR荧光探针法联合对我院门诊及住院185例乙肝患者及健康体检者75例进行检测。结果:"大三阳"组HBV-DNA定量检测阳性率为95%,平均拷贝数为5.63×106;"小三阳"组HBV-DNA定量检测阳性率为63%,平均拷贝数为4.37×104;HB-cAb(+)组HBV-DNA定量检测阳性率为50%,平均拷贝数为6.89×102;HBsAb(+)与正常对照组HBV-DNA定量检测阳性率为0,平均拷贝数为<5.0×102。结论:①"大三阳"患者的HBV-DNA阳性检出率较高。②乙肝五项和HBV-DNA定量两种方法联合应用,能更好的满足临床需求。

不同检测方法检测4种生殖道病原体的结果差异和应用价值

目的:比较PCR荧光探针法、乳胶法、培养法及ELISA法对生殖道分泌物中淋病奈瑟菌(Neisseria Gonorrhoeae,NG)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,Uu)、沙眼衣原体(Chlamydia Trachomatis,CT)及单纯性疱疹病毒2型(Herpes Simplex Virus type 2,HSV-2)的检出率,分析其结果差异和应用价值。方法:选取2021年1月至2022年5月我院性病门诊就诊的100例患者作为研究对象。采用PCR荧光探针法对NG、Uu、CT、HSV-2进行检测,同时采用培养法检测Uu、NG;胶体金法检测CT;ELISA法检测HSV-2,并将PCR荧光探针法与其他3种方法检测结果进行比较分析。结果:在NG、Uu、CT的检测结果中,PCR荧光探针法NG、Uu阳性率与培养法无明显差异(P>0.05),PCR荧光探针法CT结果阳性率明显高于胶体金法(P<0.05)。在检测HSV-2的结果中,PCR荧光探针法阳性率明显低于ELISA(P<0.05)。结论:与胶体金法、ELISA法相比,PCR荧光探针法可显著提高CT、HSV-2检出率,且与培养法NG、Uu的检出率相近,有助于临床实施早期诊断并及时治疗。

3种检测肺炎支原体感染方法的比较分析

目的:比较3种检测方法对肺炎支原体(MP)感染的临床诊断效果及应用价值。方法:对疑为呼吸系统MP感染的494例住院患儿留取痰液,用PCR荧光探针法进行MP DNA检测,用被动凝集法和间接免疫荧光法进行血清抗MP抗体检测。结果:PCR荧光探针法阳性299例(60.53%),被动凝集法阳性290例(58.70%),间接免疫荧光法阳性242例(48.99%),PCR荧光探针法与被动凝集法的阳性率无差别(χ2=0.341,P>0.012 5),间接免疫荧光法与PCR荧光探针法(χ2=13.274,P<0.012 5)、被动凝集法(χ2=9.383,P<0.012 5)阳性率相比,差异均有统计学意义。被动凝集法阳性结果中滴度为40的患儿共77例,其中70例的另2种方法结果均为阳性。结论:间接免疫荧光法的检测阳性率低于PCR荧光探针法与被动凝集法。对于儿童,被动凝集法静脉血标本的采集较PCR荧光探针法的痰标本采集更为简便,可将被动凝集法作为MP感染的门诊筛查项目;被动凝集法应将滴度≥40的结果判定为阳性。

RNA恒温扩增法在肺炎支原体检测中的应用

目的探讨RNA恒温扩增法检测肺炎支原体的可行性及其应用价值。方法采集2016年5~7月在我院住院治疗的200例患急性呼吸道感染儿童咽拭子,分别用RNA恒温扩增法和PCR荧光探针法进行肺炎支原体检测,分别计算两种检测方法的检出率,根据公式计算灵敏度和特异性,并进行统计学分析。结果 RNA恒温扩增法检出肺炎支原体17例,检出率为8.5%,PCR荧光探针法检出肺炎支原体18例,检出率为9.0%,两种方法的检出率比较差异无统计学意义(P>0.05);RNA恒温扩增法与PCR荧光探针法相比灵敏度为88.9%、特异度为99.5%。结论 RNA恒温扩增法与PCR荧光探针法检出率相当,具有较高的灵敏度和特异度,可以作为一种新的方法用于肺炎支原体临床检测。

PCR-荧光探针法对手足口病不同样品病原学检出率比较

目的了解不同样品对手足口病检出率的差异,为临床手足口病标本的采集提供科学依据。方法利用PCR-荧光探针法对不同病人不同样品和同一病人不同样品进行检测,并对结果进行统计学分析。结果以大便、肛门拭子和疱疹液的检出率高,而咽拭子、脑脊液、血清的检出率低。结论应采集大便、肛门拭子和疱疹液,以提高手足口病的检出率。

快速结核分枝杆菌菌型鉴定方法的应用评估

目的评估MGIT 960液体培养分枝杆菌阳性时,免疫胶体金法MPB64抗原检测及荧光探针PCR法在结核分枝杆菌快速菌型鉴定中的应用价值。方法临床MGIT960TM液体培养得到203例分枝杆菌阳性菌株,平行采用上述两种方法进行结核分枝杆菌菌型鉴定。结果免疫胶体金MPB64抗原检测法灵敏度为97.7%(169/173×100%),特异度为100%(30/30×100%);荧光探针PCR法灵敏度为100%(173/173×100%),特异度为96.7%(29/30×100%)。结论免疫胶体金法检测MPB64抗原及荧光探针PCR法作为液体培养时结核杆菌菌型鉴定的方法均是快速可靠的。免疫胶体金法检测MPB64抗原由于操作简便,实验要求条件低,更易为临床TB实验室接受。

PCR荧光探针法在检测分泌物沙眼衣原体、淋球菌及解脲支原体中的应用

目的评价PCR荧光探针法用于检测分泌物沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)、淋球菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum,UU)的适用性。方法热裂解法提取CT、NG、UU分泌物样本中病原微生物DNA,以其作为模板,采用PCR荧光探针法检测样本中CT、NG、UU的阳性率。同时采用乳胶法检测相应样本中CT的阳性率,培养法检测相应样本中NG及UU的阳性率,并将检测结果分别与PCR荧光探针法进行比较。结果 1 209份CT标本中,PCR荧光探针法阳性检出率(9.76%)显著高于乳胶法(2.64%),1 491份NG标本中,PCR荧光探针法阳性检出率(6.64%)显著高于培养法(4.16%),差异均有统计学意义(P<0.05);1 260份UU标本中,PCR荧光探针法阳性检出率(37.6%)略高于培养法法(36.8%),但差异无统计学意义(P>0.05)。结论与培养法和乳胶法比较,荧光探针PCR法对CT和NG的阳性检出率更高,而对UU的阳性检出率与培养法相近,适用于分泌物中CT、NG及UU的检测。

2种结核分枝杆菌耐药基因突变检测方法诊断利福平耐药结核病的评估研究

目的评价荧光定量PCR探针熔解曲线法(简称Melt PCR法)和Gene Xpert MTB/RIF技术(简称Xpert法),用于临床涂阳标本诊断利福平耐药结核病(Rifampicin resistant tuberculosis,RR-TB)的检测效能及应用价值。方法随机收集2016年2月至2018年6月在河北省胸科医院就诊肺结核患者结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)涂阳标本278例,应用传统的结核菌比例法药敏试验(对照检测方法)、Melt PCR法和Xpert法同时进行RR-TB情况的检测,分析Melt PCR法和Xpert法检测RR-TB的效能。结果3种方法同时对278例MTB阳性标本的利福平耐药进行检测,耐药检出结果差异无统计学意义(P>0.05)。与传统药敏试验结果相比,Melt PCR法和Xpert法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度和约登指数分别为97.96%、98.25%、92.31%、99.56%、98.20%、96.21%和95.92%、97.38%、88.68%、99.11%、97.12%、93.30%,Kappa值分别为0.940和0.904(P<0.05),均为高度一致。3种方法在痰液中的利福平耐药均显著高于支气管肺泡灌洗液,且差异具有统计学意义(P<0.05)。不同带菌量样本的利福平耐药检出结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论Melt PCR法和Xpert法用于临床涂阳标本中检测RR-TB具有相似的高灵敏度和特异度等检测性能,可结合实际需求在耐多药结核病防治中推广和应用。