用荧光染色与冬青油透明技术显示花粉细胞核

花粉经 Hoechst 33258(H33258)染色、乙醇脱水、冬青油(水杨酸甲酯)透明后,荧光镜检可透视到其中的生殖核(或精核)及营养核。冬青油能保存 H33258荧光、减弱花粉壁自发荧光、增加花粉内含物透明度,因而观察效果比不透明时显著改进。用此法观察人工萌发的花粉管,可显示细胞核由花粉粒向花粉管转移的过程及其在花粉管中的动态变化。

环保透明脱蜡液Van-Clear与传统试剂在组织处理后HE染色及FISH法检测乳腺癌HER2基因中的比较

目的比较环保透明脱蜡液Van-Clear和二甲苯透明脱蜡制作的组织切片苏木精-伊红(HE)染色优良率,对比荧光原位杂交(FISH)法检测2种透明脱蜡液制作的乳腺癌组织切片的人类表皮生长因子受体2(HER2)基因扩增阳性率,探讨Van-Clear替代二甲苯的可行性。方法收集中山市博爱医院2013年2月~2015年12月门诊及住院部送检的乳腺浸润性导管癌标本89例、乳腺增生标本125例、子宫平滑肌瘤标本193例、子宫平滑肌肉瘤标本12例、肺癌穿刺标本16例、绒毛标本139例,同一病变部位切取2个样本,用抽签法随机分为2组,命名为A、B组。A组采用二甲苯透明脱蜡制作切片574张;B采用Van-Clear透明脱蜡制作切片574张。依据切片染色情况判定切片等级,采用SPSS20.0软件比较A、B组切片HE染色优良率;A、B组中乳腺浸润性导管癌标本再各制作切片89张,采用SPSS 20.0软件比较FISH法检测的HER2基因扩增的差异。结果 (1)生物显微镜下,A、B两组切片HE染色结果细胞轮廓清晰、透明度好,细胞核与细胞质蓝红相映、色彩鲜艳,核质对比明显,核膜及核染色质颗粒清晰可见、分辨良好,分裂象染色体呈现黑蓝色,各种成分层次分明。(2)A、B两组切片HE染色优良片分别为570张、572张,中等、差片4张、2张。染色优良率分别为99.30%、99.65%,两组间染色优良率差异无统计学意义(χ2=0.50,P>0.05)。(3)荧光显微镜下,A、B两组切片乳腺浸润性导管癌HER2双探针FISH检测结果组织轮廓和背景均清晰,探针定位准确,可见耀眼的红/绿荧光信号。(4)A、B两组切片检测乳腺浸润性导管癌HER2基因,FISH阳性率分别为24.72%、26.97%,两组间阳性率差异无统计学意义(χ2=0.50,P>0.05),且FISH结果符合率为97.75%。结论环保透明脱蜡液Van-Clear有替代传统试剂二甲苯应用于组织切片HE染色及FISH法检测乳腺癌HER2基因的潜在可能。

改良脑灌注固定方法在组织透明技术中的效果评估

组织透明技术能够在不破坏组织整体结构的前提下观察其内部的三维结构信息,目前常用的方法有多种,但在操作复杂性、荧光兼容性以及组织形变等方面各有优缺点,因此开发新型透明技术势在必行。在长期试验中我们发现组织灌注固定的充分性在组织透明中非常重要,本文以优化组织透明效果为出发点,采用改进的双侧颈总动脉灌注技术灌注固定大鼠和兔脑组织,进行HE染色和免疫荧光试验,然后对剩余部分脑组织切片进行透明处理,检测透光率。结果显示,与传统经心脏灌注技术相比,双侧颈总动脉灌注技术需要的灌注液和固定液可节省50%以上;脑组织切片透光率更高,近红外波长区域检测结果经统计分析,具有显著性差异(P<0.05);同时,与传统灌注技术相比,脑组织HE染色和免疫荧光效果也较好,红细胞数量显著减少(P<0.05),组织灌注固定更充分。

肿瘤细胞性染色体数目异常在肾透明细胞癌中的生物学作用及其与SSIGN评分的关系

目的探讨肿瘤细胞性染色体数目异常在肾透明细胞癌中的生物学作用及其与SSIGN评分的联系。方法收集20例男性肾透明细胞癌患者,根据SSIGN评分分为高SSIGN评分组和低SSIGN评分组,并选择5例非肿瘤肾组织作为阴性对照。采用荧光原位杂交技术分别检测标本X、Y染色体数目的异常率,观察比较高SSIGN评分组与低SSIGN评分组以及正常组之间的性染色体异常率的差异。结果 5例非肿瘤肾组织无异常,与肿瘤组比较,有显著性差异(P<0.05)。高SSIGN评分组比低SSIGN评分组的X染色体获得率没有显著的变化,无统计学意义(P>0.05),而高SSIGN评分组比低SSIGN评分组的Y染色体获得率有明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论肾透明细胞癌肿瘤细胞存在性染色体的异常,而非肿瘤肾组织无异常率的发现,提示性染色体异常与肾透明细胞癌的发生发展有着密切的关系。肾透明细胞癌高SSIGN评分组比低SSIGN评分组的Y染色体获得率有明显增高,Y染色体获得很可能是肾透明细胞癌预后差的特征性改变,可望作为判断肾透明细胞癌恶性程度和预后的指标之一。

应用DNA-DAPI荧光显微术观察高等植物生殖细胞的有丝分裂

生殖细胞是雄配子(精子)的前身。

CD44介导的透明质酸对单核细胞黏附和迁移的作用

目的研究透明质酸(HA)在单核细胞中的分布,HA受体CD44和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)在单核细胞中的表达以及HA及其受体对单核细胞黏附和迁移的影响。方法用Percoll非连续密度梯度离心法分离狗外周血单核细胞,然后用免疫荧光染色法标记单核细胞的HA、CD44和ICAM-1。通过用透明质酸酶(HAase)消化细胞表面的HA、在培养皿底面和细胞培养池膜上涂布HA和在培养液中添加HA,观察细胞表面的HA、底物HA和游离HA对细胞黏附和迁移的影响。以抗体阻断剂抑制CD44或ICAM-1,研究HA受体的介导作用。结果单核细胞表面和细胞内存在HA,并表达CD44和ICAM-1。消化细胞表面HA后,黏附和迁移的单核细胞数减少。在培养皿底面和细胞培养池膜上铺HA,黏附和迁移的细胞数增加。培养液中加入HA,黏附和迁移的细胞数减少。阻断CD44后,HA底物上黏附和迁移的细胞数减少,而阻断ICAM-1后黏附和迁移的单核细胞数无明显变化。结论单核细胞内外分布有HA。单核细胞表面的HA和底物HA促进细胞的黏附和迁移,但游离HA阻碍单核细胞的黏附和迁移。CD44介导HA对单核细胞黏附和迁移的作用。

15q11.2-13.2微重复四倍体综合征1例并文献复习

目的采用分子遗传学技术分析1例常规染色体核型拟诊为21/22三体的发育迟缓伴孤独症患儿,明确遗传学诊断。方法收集患儿及其父母的外周血标本,常规提取基因组DNA,应用高分辨染色体核型分析(400-550带)检测患儿及其父母的染色体数目及结构,微阵列比较基因组杂交技术(array-CGH)筛查患儿的全基因组拷贝数变异,以荧光原位杂交技术(FISH)对异常的基因拷贝进行染色体精确定位和定量。结果女,2岁,发育迟缓伴孤独症样表现。外侧眼角下垂、内眦赘皮。常规染色体核型检查(320带)分别为47,XX,+22和47,XX,+21。高分辨染色体核型分析显示,该患儿携带额外标记染色体(SMC),核型为47,XX,+mar dn,尚不能确定是否为21/22三体携带者,患儿父亲高分辨率核型染色体分析提示为46,XY,母亲为46,XX,提示患儿携带SMC为新生突变。array-CGH检测显示15q11.2-13.2区域微重复(chr15:22684529-30730543,8.0 Mb,hg19)。FISH验证该SMC来源于15号染色体,由15q11.2-13.2区域二倍体及双着丝粒组成。患儿最终诊断为15q11.2-13.2微重复四倍体综合征。复习文献报道的15q11.2-13.2拷贝数增加病例的临床表型,微重复四倍体综合征的主要表型有智力低下/发育迟缓(100%)、肌张力低下(92.9%)、孤独症/孤独症样表现(71.4%)和癫(61.5%)等。结论 15q11.2-13.2微重复四倍体综合征是患儿发生精神发育迟滞伴孤独症的遗传学基础,array-CGH能够快速、准确地检测基因组的微小失衡。

高-低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞

目的 从大胚龄人胚脑中分离培养并鉴定神经干细胞。方法 采用高 低密度培养、无血清培养和单细胞克隆技术分离培养出神经干细胞 ,并应用免疫荧光染色鉴定。结果 从 13周龄胚脑中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞 ,它们具有连续克隆能力 ,可传代培养 ,表达神经巢蛋白抗原 ,分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少枝胶质细胞的特异性抗原。结论 高

三种组织透明化方法在神经科学应用中的比较

目的选择三种较常见的组织透明化方法,即PACT、MACS和Visikol,比较其在脑组织不同抗原类型和不同标记方案中的兼容性,为检测特定靶蛋白的最适组织透明化方案提供参考。方法分别利用转基因小鼠来源的内源性荧光、小分子荧光标记物标记特定蛋白、免疫荧光化学标记特定靶抗原等方法进行脑组织样本的标记;采用基于水凝胶包埋的PACT方法、基于尿素透明化技术改进的MACS方法和基于溶剂透明技术的Visikol HISTO商品化试剂三种方案对上述标记的脑组织样本分别进行透明化处理;利用共聚焦显微镜,选择适配于以上三种透明化方案样本折射率的物镜进行成像。结果以厚脑片(150μm)为研究对象,三种方法达到组织透明效果所需的时间PACT法最长,Visikol法次之,MACS法最短。对于不同内源性荧光蛋白,PACT和MACS法能较好保存抗原荧光,而Visikol法处理后荧光淬灭严重;对于以血管凝集素为例的小分子荧光标记物,三种方法均可完成标记,但Visikol法效果最好。对于胞核与胞质抗原分别进行免疫荧光化学染色,三种方法均可完成标记;而对于胞膜抗原进行免疫荧光化学染色,PACT和MACS法能较好实现标记。结论由于抗原类型的特点和透明化原理的不同,组织成像效果并不完全相同。选择合适的抗原标记方案结合特定的组织透明化方法对于成功实现一定空间范围内的三维组织成像至关重要。

3种检测方法对结核病诊断效能的比较

目的评价γ-干扰素释放试验(IGRA)、涂片抗酸染色镜检(AFB)和实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF)诊断结核病的应用价值。方法选取2019年6月至2023年6月在陕西省结核病防治研究所就诊的疑似结核病患者397例作为研究对象,所有研究对象均同时行IGRA、AFB、Xpert MTB/RIF检测,收集患者的检测结果和病例资料。排除无法诊断是否为结核病的患者39例,最终纳入358例,并根据临床诊断结果将其分为结核患者141例和非结核患者217例。比较IGRA、AFB、Xpert MTB/RIF在结核病中的阳性检出情况及其对结核病的诊断效能。结果IGRA、AFB、Xpert MTB/RIF检测结核病的灵敏度分别为95.74%、31.21%、56.74%,IGRA的灵敏度高于AFB和Xpert MTB/RIF(χ^(2)=126.66,P<0.01;χ^(2)=59.22,P<0.01),Xpert MTB/RIF的灵敏度高于AFB(χ^(2)=18.65,P<0.01);IGRA、AFB、Xpert MTB/RIF检测结核病的特异度分别为60.37%、99.54%、100.00%,其中AFB和Xpert MTB/RIF的特异度均高于IGRA(χ^(2)=103.86,P<0.01;χ^(2)=107.25,P<0.01),而AFB和Xpert MTB/RIF的特异度比较,差异无统计学意义(χ^(2)=1.00,P=0.32)。IGRA、AFB、Xpert MTB/RIF检测结核病的准确率分别为74.30%、72.63%、82.96%,其中Xpert MTB/RIF的准确率最高,且3种检测方法的准确率比较,差异有统计学意义(χ^(2)=12.30,P<0.01)。IGRA与AFP检测结果的总符合率为31.21%(44/141),阳性符合率为95.45%(42/44),阴性符合率为4.12%(4/97);Xpert MTB/RIF与AFP检测结果的总符合率为74.47(105/141),阳性符合率为100.00%(44/44),阴性符合率为62.89%(61/91)。结论在结核病诊断中,Xpert MTB/RIF和AFB的特异度高于IGRA,而IGRA和Xpert MTB/RIF的灵敏度高于AFB,临床可根据3种方法各自的优势应用于结核病的诊断,以此来提高结核病的临床诊治效率。

大鼠肝脏再生过程中细胞标志物演变与骨髓细胞增生

目的:为研究大鼠在部分肝切除术后肝再生过程中是否存在骨髓细胞的增生与动员以支持肝脏再生过程,以及肝卵圆细胞(hepatic oval cells,HOC)在体内细胞标志物的演变过程. 方法:SD(Sprague-Dawley)大鼠81只,随机分为3组: 2/3部分肝切除组(partial hepatectomy,PHx)、2/3部分肝切除加2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene, 2AAF)预处理组(PHx+2AAF)及假手术组,每组分为9小组(n=3),分别于术后1,2,4,6,8,12,16, 20,24 d采集大鼠骨髓细胞及再生肝组织;采用percoll密度梯度液分离骨髓细胞中的单个核细胞,并用流式细胞分析技术检测单个核细胞中CD34+,CD45+细胞比例; 采用冰冻组织切片技术进行再生肝组织切片,并用免疫荧光组织化学染色检测再生组织中与CD34共表达的部分造血干细胞、肝卵圆细胞及肝细胞的细胞标志物Thy1.1,CD45,CK19,vimentin,AFP,Alb. 结果:在PHx模型中,流式细胞检测结果显示大鼠骨髓单个核细胞中CD34+及CD45+细胞在术后2,4, 6 d与对照组相比增高(分别为2.774±0.166 vs 1.903±0.044,P=0.016<0.05;3.164±0.056 vs 1.862±0.057, P=0.002<0.01;2.708±0.160 vs 1.897±0.149,P= 0.032<0.05),免疫荧光组织化学染色结果示在肝组织中第4 d发现少量CD34,CD45共表达细胞,但未检出其他共表达的细胞标志物.在PHx+2AAF模型中, 流式细胞仪检测结果示CD34+及CD45+细胞于术后2, 4 d与对照组相比增高(分别为2.472±0.141 vs 1.903±0.044,P=0.020<0.05;2.985±0.120 vs 1.862±0.057, P=o.008<0.01),荧光免疫组织化学染色显示其再生肝组织中与CD34共表达的抗原Thy1.1,CK19,Alb, AFP,vimentin等存在动态演变:在标志物出现过程中,Thy1.1最早出现,随后可检出AFP,vimentin, CK19,而Alb最后检出;在标志物的消失过程,则Thy1.1, Alb,CK19最早消失,随后AFP,vimentin未检出. 结论:大鼠在急性肝损时的肝再生过程中存在骨髓CD34+与CD45+的细胞增生现象,再生肝组织中与CD34共表达抗原的动态演变可能反映肝卵圆细胞在体内的产生与分化的演变过程.

实时荧光聚合酶链反应技术用于Bart水肿胎儿产前诊断

α-地中海贫血（α-地贫）是一种常染色体隐性遗传性贫血病，在我国主要由α-珠蛋白基因3种严重缺失造成，即--^SEA、-α^3.7、-α^4.2。患者基因型不同，临床症状轻重不一。其中症状最重的为Bart水肿胎儿综合征，通常为死胎。其次为血红蛋白H病（HbH），患儿能成活，但贫血、甚至肝脾肿大。上述缺陷基因的携带者用一般实验室检查方法不能发现；运用基因诊断技术能够检出。

国产荧光原位杂交探针检测自然流产绒毛染色体的临床应用研究

目的:应用国产荧光原位杂交(FISH)探针,对自然流产绒毛组织进行遗传学分析。方法:收集自然妊娠后自然流产绒毛80例,经体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗后自然流产绒毛20例,行荧光免疫杂交(fluorescence in situ hy-bridization,FISH)技术分析流产绒毛13、16、18、21、22、X和Y这5对常染色体和1对性染色体的非整倍体状况,并与细胞培养核型分析技术相对比。结果:FISH技术共检测出30例染色体异常,细胞培养核型分析共检测出38例染色体异常;自然流产组与IVF-ET流产组的染色体异常率分别为38.75%(31/80)、35.00%(7/20),差异无统计学意义(P>0.05);在80例自然妊娠后自然流产病例中,既往0、1、2、3次及以上自然流产史的染色体异常率分别为28.30%(15/53)、30.00%(3/10)、30.00%(3/10)、33.33%(1/3),各组间比较无统计学差异;80例自然妊娠自然流产病例中,年龄在35岁及以下和大于35岁者染色体异常率分别为38.23%(26/68)、41.67%(5/12),IVF-ET组分别为21.43%(3/14)、66.67%(4/6),差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:自然妊娠后自然流产与IVF-ET术后自然流产的发生均与染色体异常密切相关,其染色体异常率无明显差异。

给医院采购血细胞分析仪的建议

按计数和分类技术的不同把血细胞分析仪分为二种,物理方法类和化学方法类,通过对典型仪器的比较分析,给医院采购提供一些建议,希望能帮助不同性质的医院或科室根据计数分类的不同要求,选择适合自己的血细胞分析仪。

产前诊断一例Miller-Dieker综合征胎儿

目的产前诊断1例超声异常的Miller-Dieker（Miller—Dieker syndrome，MDS）胎儿，分析并探讨其基因型与表型的对应关系。方法联合应用染色体核型分析、细菌人工染色体标记一磁珠鉴别／分离技术（BACs—on-Beads，BoBs）、荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）和单核苷酸多态性微阵列技术对1例超声异常的胎儿进行产前诊断。结果产前BoBs检测提示胎儿携带17p13区的MDS微缺失，中期分裂细胞FISH确认其为17p13区的微缺失，高分辨的单核苷酸多态微阵列检测确定该胎儿染色体在17p13区存在约5．2Mb的缺失：arr[hg19]17p13．3p13．2（525—5204373）×1。胎儿脐血细胞染色体核型分析、孕妇及其配偶的外周血高分辨染色体核型分析和BoBs检测均未见异常。结论联合应用产前分子遗传学技术对1例新发的MDS综合征胎儿进行了产前诊断，临床上应重视微缺失微重复的病例，避免漏诊。

22q11微缺失综合征的产前诊断

目的建立22q11微缺失综合征的产前诊断方法。方法应用细菌人工染色体标记一磁珠鉴别／分离技术（BACs-on-Beads^TM，BoBs）和荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH），对1例羊水染色体培养失败的胎儿及1例疑似22q11微缺失综合征的双胎行产前分子诊断。结果产前BoBs试剂盒方法检测到1例胎儿及1例双胎均为22q11的微缺失，同时3例胎儿中期分裂细胞的FISH验证结果均显示为22q11微缺失，即在DiGeorge／VCFSN25位点上仅有一个红色荧光信号，对照22号末端22q13．3ARSA位点上有两个绿色荧光信号。结论产前Bobs方法联合FISH技术可以成为22q11微缺失的一种产前分子诊断手段。