利用荧光标记引物和DNA自动测序仪确定DNA的断裂位点

Determining the base sequence of DNA broken site is quite crucial for the study on the cleavage site specificity and mechanism of various natural or synthetic DNA cleavage regents,and on developing novel therapeutic drugs targeting at DNA.The most frequently used method depending on chemical reactions of the Maxam-Gilbert procedure,and the late arising methods used by Rui Ren et al.which were based on Sanger’s DNA sequencing strategy,all had some deficiencies,either the pollution of radioactive materials,or really complicated and difficult to operate.In the present paper,a new method for DNA cleavage site sequence determination was developed.The fluorescence FAM-labeled primer was annealed to the DNA fragments,which has been cleaved by restriction enzymes or other regents,and extended along the template sequence.The products then loaded onto the polyacrylamide electrophoresis gel of ABI 377 DNA Sequencer.Data was collected and analyzed by using ABI PRISM Data Collection Software and ABI PRISM Sequencing Analysis Software.It is proved to be a credible and simple new approach to determine the base sequence of DNA broken sites.

基因芯片分型中荧光标记引物的多重扩增及试验优化

基因芯片技术以其平行高效多位点多态性分型的优势，在基础和临床研究中被广泛应用。然而，随着位点增多，扩增目的片段更繁琐，为了提高效率和降低成本，就需要在同一反应体系内进行多重扩增。而多重扩增的关键问题是，同一体系内引物对的最大化，并有效减少非特异扩增。目前，此环节可通过计算机辅助设计和尝试不同引物对组合解决。由于芯片分型以杂交信号强弱为检测指标，扩增片段要载有荧光剂，因此多重扩增必须考虑到荧光标记物——青色素（Cy3）的大分子位阻效应。但是，Cy3的存在不可避免地降低了PCR的效率，为此本研究对相关试验条件进行优化。

引物原位标记合并荧光原位杂交技术在人类中期染色体分析中的应用

[目的]建立检测人类外周血淋巴细胞中期染色体的引物原位标记合并荧光原位杂交技术,并进行其在产前诊断中的可行性分析。[方法]采用单色引物原位标记合并单色荧光原位杂交技术同时对正常人外周血淋巴细胞18号染色体的着丝粒α-卫星序列和21号染色体长臂的单拷贝序列进行双色标记。[结果]成功地在淋巴细胞培养的中期分裂相上同时获得了18号和21号染色体的标记,其中18号标记为绿色信号,21号标记为橙红色信号,标记率分别达96.2%和93.6%,双标记率达到91.3%。[结论]应用该技术对人类外周血淋巴细胞染色体进行标记结合了引物原位标记和荧光原位杂交技术各自的优点,增加了检测靶点的多样性,为其在产前诊断中的应用奠定了基础。

荧光标记DNA扩增片段长度多态性方法的改进

采用常规PCR试剂和合成的接头和引物 ,其中MseⅠ引物为荧光标记物FAM标记 ,并对扩增片段长度多态性 (AFLP)程序进行了改进 ,优化了PCR反应和电泳条件 ,建立了一个新的、有效的反应体系 ,降低了实验费用 ,经比较实验结果与AFLP荧光标记试剂盒的实验效果一致 .

荧光引物扩增AMG基因鉴定古代人骨遗骸的性别

建立一种用荧光标记引物扩增AMG基因的性染色体同源片段方法,对古代人骨遗骸进行性别鉴定.用其测定5个古代遗骸的性别,其结果与形态学结果一致.

MAOA μ-VNTR多态性荧光标记自动分型方法的建立及应用

目的应用毛细管电泳和荧光标记技术,建立MAOA μ-VNTR多态荧光标记自动分型的方法.方法使用Chelex-100法提取DNA后,采用荧光标记和毛细管电泳检测技术对720份云南汉族无关个体血样进行MAOA μ-VNTR基因分型.结果荧光毛细管电泳分型方法能准确、高效地对MAOA μ-VNTR多态性进行分型检测.结论 MAOA μ-VNTR多态性荧光标记自动分型方法操作简便,在针对MAOA μ-VNTR多态性的相关研究中具有良好的应用前景.

荧光复合扩增4个Y染色体STR的单倍型及其法医学应用

目的建立一套Y染色体STR的双色荧光复合扩增系统,调查4个Y-STR基因座单倍型分布情况及其在混合斑物证检验中的法医学应用前景。方法荧光标记引物复合扩增Y-GATA-A10、DYS531、DYS557和DYS448四个Y染色体特异性STR基因座,并用ABⅠ310遗传分析仪对扩增产物进行检测、分型。结果在成都汉族120名无关男性个体中,四个基因座分别检出5、5、8、7个等位基因,共检出78种单倍型,单倍型基因多样性为0.9881。对3例本教研室不能用常规常染色体STR对男性成份作出同一认定的混合斑检材,该系统成功的作出了与嫌疑人血液Y-STR基因型一致的鉴定结论。结论建立的Y-STR荧光标记复合扩增系统具有很高的识别能力,对建立Y染色体STR数据库,研究群体遗传学和进行法医学混合斑物证鉴定有重要意义。

荧光标记复合扩增短串联重复序列基因分析骨髓移植物的植入

目的 为了准确地识别骨髓移植物的植入状态 ,探讨PCR扩增短串联重复序列 (shorttandemrepeat,PCR STR)在亲缘或无关供者骨髓移植的预后及白血病复发中的预警作用。方法 建立荧光标记PCR STR等位基因分析技术 ,采用单克隆磁珠提取DNA ,四色荧光标记 ,于移植前、移植后 7天～ 6个月不等时间 ,采集供、受者血液 (2例回顾性研究患者刮取口腔粘膜脱落细胞作为术前样本 )DNA作PCR STR分析。结果 ① 12例患者骨髓移植后 10例为完全供者型 ,其中同胞捐髓 8例 ,HLA全相合 7例 ,半相合 1例 ;无关供者捐髓 1例 ,HLA全相合 ,母亲供髓 1例 ,HLA Ⅰ全相合 ,HLA Ⅱ半相合。 10例受者术后出现Ⅰ度移植物抗宿主病 (GVHD) ,STR均完全和持续表达供者基因型 ,追踪观察 3～ 2 5个月 ,预后良好。② 12例中 1例由嵌合型转变为完全供者型 ,系同胞捐髓 ,HLA Ⅰ半相合 ,HLA Ⅱ全相合 ;术后第 30天PCR STR表达供、受者双方基因型 ,第 6 0天完全转变为供者基因型 ,而自身的基因在外周血中消失 ,预后良好。③ 12例中 1例为持续未植入 ,HLA半相合同胞捐髓 ,术后虽然有血液学和临床情况的改善 ,但移植后 7,14,2 1天STR分析始终仅显示受者基因型 ,移植后 4个月死亡。结论 基于分子水平的多位点PCR

人工饲养蓝狐微卫星DNA的多态性

选取16个微卫星位点对5个蓝狐群体进行遗传多态性研究,利用PopGen32和MEGA4对5个群体的等位基因数、有效等位基因数、等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度和多态信息含量等遗传参数进行了分析。结果表明:5个群体137个个体共计检出162个等位基因,每个位点等位基因数为4～13。位点多态信息含量为0.17～0.84,5个群体中3个群体为高度多态性,其余2个群体为中度多态。位点的观测杂合度为0.18～0.89,位点的期望杂合度为0.18～0.86,茂兴湖群体的杂合程度均高于其他4个种群。选取的16个微卫星位点均表现出较高的多态性,在蓝狐多样性分析中具有一定的有效性,可用于蓝狐遗传多样性的分析。

DNA简单重复序列基因分型的新方案

随着大规模测序技术的不断发展,测序成本降低,各种生物的基因组序列已逐步完善,重测序工作成为基因多态性研究中非常重要的方法。它可以比较全面地描述基因的复杂性和多样性,广泛应用于多种疾病的检测和鉴定等。但是,当重测序过程中遇到简单重复序列时,往往会出现峰谱图的滑移现象,使测序结果不准确。本研究利用荧光标记引物定向扩增包含重复序列的片段,结合ABI 377 DNA自动测序仪进行检测重复单位,结果表明,该方法可以准确无误的检测出重复序列的重复次数,是对重测序工作中的重复序列分型技术的一项重要补充。

利用重组自交系群体构建番茄AFLP遗传连锁图谱

以普通栽培番茄(Solanum lycopersicum)99165-30为母本,野生多毛番茄(Solanum habrochaites)LA1777为父本进行杂交,通过单粒传得到了含有80个F5︰6家系的重组自交系分离群体,利用荧光AFLP分子标记技术构建番茄分子遗传连锁图谱。AFLP标记采用MseⅠ和EcoRⅠ两种内切酶及荧光标记(IRD-700或IRD-800)的E+3和非荧光标记的M+3引物组合进行选择性扩增,扩增结果经95℃预变性后在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳2.5h,运用LICOR公司的NEN Global Edition IR2 DNA Analyzer(Model 5200 LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)荧光扫描检测DNA多态性。对RILs群体中产生分离的274个AFLP标记运用JoinMap3.0软件分析,得到一张番茄分子遗传连锁图谱,图谱总长度为662cM,共包括18个主要连锁群,125个多态性分子标记。每条连锁群上的标记数在3～22个之间,连锁群的长度在14.0～58.0cM的范围内,平均图距在2.27～13.3cM。总平均距离5.3cM,本研究中构建的番茄永久遗传图谱,为番茄分子辅助育种及重要农艺性状的定位奠定了基础。

基于遗传片段分析系统的转录起始位点分析技术:从预测到结果评估

【目的】以遗传片段分析仪内标法替代传统放射性标记引物延伸技术进行样本转录起始位点(TSS)分析,并弥补引物延伸技术应用于未知样本缺乏前期预测和后期评估环节,形成一套基于遗传片段分析仪内标法分析未知样品TSS的完整技术方案。【方法】以粘球菌Myxococcus DK1622来源的双拷贝Gro ELs基因为素材;首先从预测出发,利用数据库进行启动子和转录起始位点预测;其次,根据预测结果设计合成荧光标记引物进行靶标m RNA的反转录;再次,应用遗传片段分析技术内标法鉴定分析粘球菌来源的双拷贝Gro ELs基因转录起始位点(TSS)及其丰度;最后,应用正态分布理论进行鉴定结果评估。【结果】明确了转录起始位点的数量、转录丰度及最可能的TSS位点:粘球菌DK1622基因组中Gro EL1拷贝存在1个启动子,TSS位点为TSS_(286);Gro EL2拷贝存在2个启动子,TSS位点分别为TSS_(548)和TSS_(502),其中TSS_(548)转录丰度是TSS_(502)的13.8倍,Gro EL1的TSS_(286)丰度是gro EL2的TSS_(548)丰度的14.3倍。【结论】预测结果指明了实验设计的范围,遗传片段分析仪内标检测法替代传统放射性标记法使实验更加简便、安全、自动、准确,正态分布理论进一步评估了实验结果的可信度,三者接合形成了完善的转录起始位点鉴定技术方案。

复合扩增微卫星DNA在脐血移植监测中的应用

目的 观察荧光标记复合扩增微卫星在脐血移植监测中应用的可行性。方法 采用检测微卫星DNA的方法 ,对 6例脐血移植的受者进行移植监测。 15个微卫星DNA用荧光标记引物复合扩增技术和DNA自动测序仪进行分型 ,比较受者移植前后或供者的DNA图谱 ,观察受者移植后DNA图谱的变化。结果 所有受者和供者均具有不同的DNA分型图谱。本组受者移植后的转归状态分为 3种 :只检测出受者基因型的受者型 ;只检测出供者基因型的供者型 ;同时检测出受者和供者基因型的嵌合型。结论 用复合扩增多个微卫星技术进行脐血移植监测 ,即使没有受者移植前或是供者的标本作比对 ,仍然可分析受者移植前后微卫星分型的变化。