Cd^(2+)对BY-2细胞的毒性机制及水杨酸的缓解作用

镉对生态环境的危害表现出对植物这种定生生物的毒害性。以绿色荧光蛋白(GFP)膜泡标记的烟草BY-2细胞为实验材料,分别在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察了Cd2+对植物细胞的毒害作用和机制,并研究了水杨酸(SA)处理对Cd2+植物细胞毒害的缓解作用。研究发现激光共聚焦显微镜可以观察到Cd2+处理3 h后细胞荧光亮度减弱,6 h时细胞皱缩和液泡缩小,9 h细胞大多死亡。在Cd2+胁迫同时加入SA,可显著提高细胞成活时间,荧光亮度增强、液泡化程度加大,同时能够观察到荧光标记的细胞膜包裹Cd2+的高荧光颗粒。SA处理的细胞还通过高度液泡化来缓解重金属Cd2+的毒性。结果表明具有生物活性的SA诱导细胞的液泡化,并通过膜成分对重金属的包裹和结合进一步降低了重金属对植物细胞的毒害。因此水杨酸缓解重金属对植物细胞的毒性,是通过诱导细胞的液泡化和膜对重金属离子的包裹束缚而实现的。

小鼠3T3-L1前脂肪细胞系的增强绿色荧光蛋白标记(英文)

细胞模型是研究细胞分化原理以及进行高通量筛选的有效工具。为了建立特异性标记的脂肪细胞分化模型 ,构建了包括脂肪细胞分化特异性表达基因PPARγ2的启动子在内的载体 (pPPARγ2 promoter EGFP) ,用电穿孔方法转染小鼠 3T3 L1前脂肪细胞 ,用显微荧光观察和RT PCR确认PPARγ2基因的内源表达。结果显示 ,EGFP基因成功转入 3T3 L1前脂肪细胞 ,观察到细胞分化过程中EGFP表达和脂肪积累 ,RT PCR分析表明EGFP代表了稳定而真实的PPARγ2基因的内源性表达。建立了由脂肪组织特异表达基因PPARγ2的表达控制的EGFP标记的小鼠 3T3 L1前脂肪细胞系 ,目前国内外尚未见用同样方法对前脂肪细胞进行特异性标记。

Bcl-2反义寡核苷酸增强阿糖胞苷诱导原代白血病细胞凋亡的研究

背景与目的:有研究证实,针对bcl-2mRNA翻译起始区和蛋白编码区的2个有效反义作用靶点的反义寡核苷酸能增强HL-60和K562细胞对阿糖胞苷(Ara-C)、柔红霉素、足叶乙甙的敏感性。本研究观察这两个新靶点的反义寡核苷酸对Ara-C诱导原代培养的急性白血病(AL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞凋亡的影响。方法:用细胞记数法观察细胞的生存情况;免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测细胞Bcl-2蛋白水平;用姬姆萨染色法观察并用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:靶向bcl-2mRNA翻译起始区与靶向蛋白编码区的两个反义寡核苷酸分别与Ara-C联合作用AL、CLL细胞48h,细胞的活性受到明显的抑制,分别同无关寡核苷酸(NS-ODN)联合Ara-C组、单用Ara-C组进行比较,差异有显著性(P<0.05)。这两个不同靶点的反义寡核苷酸分别与Ara-C联用均能明显下调AL、CLL细胞Bcl-2蛋白的表达,并且联合作用AL、CLL细胞48h的凋亡细胞百分率分别与NS-ODN联合Ara-C组、单用Ara-C组进行比较,差异有显著性(P<0.05)。与靶向bcl-2mRNA翻译起始区的反义寡核苷酸比较,靶向蛋白编码区的反义寡核苷酸提高AL细胞对Ara-C的敏感性作用要强些(P<0.05)。结论:针对bcl-2mRNA翻译起始区和蛋白编码区两个靶点的反义寡核苷酸能增强Ara-C诱导AL、CLL细胞的凋亡。

非小细胞肺癌凋亡及相关基因bcl-2和bax的表达

目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)细胞凋亡与相关基因bcl-2、bax表达产物的关系及其临床意义。方法:应用流式细胞术和间接免疫荧光标记法进行检测。结果:凋亡率,Bcl-2、Bax蛋白标记率在NSCLC组与对照组中的差别有统计学意义(P<0.05)。NSCLCI期凋亡率明显高于II、III期组(P<0.01)。NSCLCI期组Bcl-2蛋白标记率明显低于II、III期组(P<0.01)。NSCLC中Bcl-2蛋白标记率与凋亡率呈负相关(r=-0.667,P<0.01)。Bax标记率与凋亡率无直线相关性(r=0.230,P>0.05)。Bcl-2/Bax>1组凋亡率明显低于Bcl-2/Bax≤1组(P<0.05)。结论:随着NSCLC临床分期的进展凋亡率下降,Bcl-2通过抑制凋亡影响NSCLC的进展。NSCLC细胞内存在一种对死亡讯号的应答模式:bcl-2/bax。

芯片杂交中荧光标记样品定量与非定量的比较研究

比较在芯片杂交中 ,荧光标记样品定量与非定量对杂交结果的影响。其方法是 ,提取经As2 O3 作用K5 6 2细胞前后的总RNA ,逆转录成cDNA第一链 ,并分别用Cy3/Cy5标记。标记后的样品再次定量或不定量 ,但均取相同体积上样与K5 6 2芯片杂交 ,用扫描仪扫描并分析。其结果 ,标记后样品定量与不定量杂交的结果都与理论推测一致 ,但以样品定量进行杂交的效果更好 ,标记样品杂交前再次定量的 ,分析发现 2个基因表达下调 ;杂交前不定量仅取相同体积进行杂交的 ,发现 6个基因片段表达下调 ,其中只有 2个基因与细胞凋亡通路密切相关。认为在芯片的杂交检测中 ,对荧光标记样品杂交前再次定量可大大提高杂交结果的可靠性。

通痹灵对于白细胞介素2及其受体α链影响的体内外实验(英文)

背景:通痹灵是由《金匮要略》中桂枝芍药知母汤加减而成,运用于临床治疗类风湿关节炎已十多年,拟从白细胞介素2及白细胞介素2受体α链(CD25)的角度,从体内和体外两个方面,阐明其调控细胞免疫以及抗类风湿关节炎的作用机制。目的:从体内体外两个方面,研究通痹灵对于胶原诱导性关节炎大鼠关节滑膜原代细胞分泌白细胞介素2,以及通痹灵总碱对于白细胞介素2受体的α链CD25表达的影响。设计:以实验动物为研究对象的完全随机设计,对照实验研究。单位:一所大学的金匮教研室,及另一所大学的生命科学院组织移植与免疫中心。材料:实验于2001-04/07在广州中医药大学第一附属医院中心实验室完成。清洁级Wistar大鼠36只,雄性,购自中山大学医学院实验动物中心,动物合格证号2000A050。体质量(110g±20)g。分为正常组,造模组,甲氨喋呤高剂量组,甲氨喋呤低剂量组,复方通痹灵高剂量组,复方通痹灵低剂量组,每组6只。方法:体内实验,采用胶原诱导性关节炎大鼠动物模型,容积法测量足肿胀度,原代滑膜细胞培养,放免法检测培养液上清,观察通痹灵对滑膜内白细胞介素2的影响;体外实验,分离大鼠淋巴细胞,佛波醇酯或刀豆蛋白体外刺激,双色免疫荧光标记,流式细胞仪检测,观察通痹灵总碱对CD3+,CD25+表达的影响。主要观察指标:复方通痹灵?

bcl-2与GM-CSF的LdsRNA对肿瘤细胞生长的抑制作用

目的 探索bcl-2-9GM-CSF的长链dsRNA(Longer doublestrand RNA，LdsRNA)对肿瘤细胞生长的抑制作用。方法使用体外转录法制备地高辛标记的bcl一2和GM—CSF基因的LdsRNA，转染THP1、HL-60和K562髓系白血病细胞系，分别以MTT法、免疫组化、免疫荧光技术和紫外分光光度计检测细胞LdsRNA转染水平，细胞增殖，特异性bcl-2蛋白表达和细胞总蛋白含量。结果LdsRNA能显著抑制THP1细胞增殖(P<0．05)和蛋白质合成，对HL-60和K562细胞系也有一定的抑制作用。结论LdsRNA能抑制肿瘤细胞的增殖，为以后利用LdsRNA用于肿瘤的治疗奠定一定的理论基础。

蛋白酶激活受体-2介导A549细胞胞浆游离钙的释放

目的:研究蛋白酶激活受体(PAR)2激动剂(SLIGKV和tc LIGRLO)、胰蛋白酶及其抑制剂(SBTI、α1AT)对A549肺上皮细胞胞浆内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响。方法:用Fluo3AM荧光标记技术和激光扫描共聚焦显微镜检测不同因素处理的A549肺上皮细胞[Ca2+]i。结果:胰蛋白酶、SLIGKV、tc LIGRLO均能引发A549肺上皮细胞[Ca2+]i的增加,平均荧光强度分别比加入试剂前增加92%,47%和130%。SBTI和α1AT可抑制胰蛋白酶诱导的细胞[Ca2+]i的增加。结论:PAR2可介导A549肺上皮细胞[Ca2+]i的释放增加,SBTI和α1AT可抑制胰蛋白酶诱导的细胞[Ca2+]i的增加。

雷公藤甲素对小鼠淋巴细胞体外活化的抑制作用

目的研究雷公藤甲素(TRD)对小鼠T淋巴细胞活化标志CD69、CD25及细胞因子IL2及IFNγmRNA表达的影响,为阐明其免疫抑制作用提供分子药理学依据。方法无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入不同浓度的雷公藤甲素预先孵育1h,用多克隆刺激剂刀豆蛋白(ConA)刺激T细胞活化,利用荧光标记的单克隆体双染技术,流式细胞仪检测TRD对小鼠T细胞CD69、CD25表达的影响;采用半定量RTPCR技术从mRNA水平检测TRD对细胞因子IL2、IFNγmRNA的表达的影响。结果TRD能抑制T细胞早期活化标志CD69和CD25,同时TRD也能抑制IL2及IFNγmRNA的表达。结论TRD对T细胞早期活化分子及细胞因子表达的抑制作用可能是其发挥免疫抑制作用的机制之一。

皮质酮对原代培养的海马神经元及其Ca^(2+)/CaMKII的影响

在培养液中加入 10 7、10 6和 10 5浓度(mol/L)的皮质酮,采用MTT染色测定、Fura 2 /AM的荧光标记以及Western印迹的方法,观察了不同浓度的皮质酮作用下海马神经元形态学和细胞存活率的变化以及胞浆内游离钙离子浓度 [Ca2+ ]i和CaMKII表达的变化规律, 探讨其对原代培养的大鼠海马神经元及其Ca2+ /CaMKII的影响和可能的机制。结果发现: 10 6、10 5浓度的皮质酮对海马神经元的形态学影响较大,与对照组比较,细胞存活率明显降低; [Ca2+ ]i分别为 113. 1022±16. 9716、155.3794±20. 7727;CaMKII的表达也明显减少;三者的变化均显著 (P<0. 01 ),而 10 7浓度的皮质酮对上述指标影响不大 (P>0.05)。此外,相关性分析表明: [Ca2+ ]i和CaMKII的表达呈现负相关(P<0. 05)。以上结果提示,皮质酮对大鼠海马神经元的作用存在浓度依赖效应,浓度越高,对大鼠海马神经元的损伤越大,同时也验证了皮质酮是啮齿类动物的主要的应激激素。

幽门螺杆菌作用后AGS细胞内钙离子的动态变化研究

背景幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染与胃癌发生密切相关,但致病机制尚未清晰。细胞毒素相关蛋白A(CagA)是Ⅰ型Hp的主要毒力因子,在Hp诱导的疾病特别是胃癌的发展中起重要作用。前期的研究发现,Hp作用后人胃腺癌上皮细胞(AGS)的钙离子相关蛋白钙网织蛋白CRT以及钙离子结合蛋白CALNUC磷酸化程度发生改变,提示Hp可能会影响AGS细胞的钙稳态,通过钙离子通路影响细胞的增殖或凋亡。目的研究Hp作用于人胃腺癌上皮细胞后,AGS细胞内钙离子的时序性变化,以及CagA对AGS细胞内钙离子的影响,进一步揭示Hp的致病机制。方法采用钙离子荧光标记示踪法,AGS细胞以Fluo-3/AM荧光指示剂负载,特异性地活体标记AGS内的钙离子,采用激光共聚焦显微镜观察分析Hp26695及其CagA缺失株(Hp26695△CagA)分别作用于AGS细胞1h、2h、3h、4h、5h、6h后,AGS细胞内钙离子的变化情况。结果幽门螺杆菌与AGS细胞相互作用1h,胞内Ca2+部分流失,5h胞内Ca2+大量流失。1～6h内,Hp26695与Hp26695△CagA作用的AGS细胞荧光强度没有显著差异。结论Hp作用会导致AGS细胞内Ca2+剥夺,且与CagA的存在无明显关联性。

基质金属蛋白酶-2及其抑制剂在肺癌侵袭转移中作用的研究

目的探讨基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)及金属蛋白酶组织抑制剂-2(tissueinhibitorofmetalloproteinase-2,TIMP-2)与肺癌生物学行为的关系。方法对MMP-2、TIMP-2蛋白进行间接免疫荧光标记,采用流式细胞仪进行定量检测。结果MMP-2、TIMP-2蛋白及MMP-2/TIMP-2在肺癌组织中的表达量明显高于癌旁正常肺组织(P<0.01),在小细胞肺癌(SCLC)中的表达量显著高于非小细胞肺癌(NSCLC)(P<0.01);MMP-2、TIMP-2蛋白在腺癌中的表达量高于鳞癌,但无显著差异(P>0.05);有淋巴结转移病例中明显高于无淋巴结转移者(P<0.01),MMP-2表达与术后生存期呈负相关(r=-0.68,P<0.01),TIMP-2与术后生存期呈正相关(r=0.55,P<0.01)。而MMP-2/TIMP-2比值与术后生存期呈负相关(r=-0.45,P<0.05)。三者均与临床分期及病理学分级无关。结论在肺癌的发生中,MMP-2/TIMP-2失衡,MMP-2表达的上调是一个关键事件;可作为肺癌恶性程度及预后判断的指标。

鼠抗人多聚体蛋白聚糖单克隆抗体对骨髓瘤细胞株生长的抑制作用

目的研究多聚体蛋白聚糖(syndecan 1,CD138)单克隆抗体(mAb)4B3 对天然表达syndecan 1的人多发性骨髓瘤(MM)细胞XG 1 和XG 2 的生物学效应。方法采用间接免疫荧光标记和流式细胞术分析,通过4B3mAb观察XG 1和XG 2细胞膜上syndecan 1荧光标记阳性率;按常规培养方式对XG 1、XG 2进行细胞培养和台盼蓝染色记数,观察不同浓度的4B3mAb对XG 1和XG 2细胞体外生长作用。结果4B3mAb能识别XG 1 和XG 2 细胞表达的syndecan 1 分子,表达率与商品化的鼠抗人syndecan 1 mAb(BB4)相似;同时,4B3mAb与XG 1 和XG 2 细胞膜上synde can 1荧光标记阳性率基本一致,反应均呈强阳性;加入不同浓度的4B3mAb,XG 1 细胞数量2 d后开始下降,而XG 2细胞3 d后数量出现减少。结论4B3mAb抗体对XG 1 和XG 2 均具有明显的生长抑制作用,但XG 2细胞的生长抑制作用早于XG 1,可为MM的生物治疗提供新途径。

过继转输的父系抗原耐受T细胞诱导受体母-胎免疫耐受的机制研究

本文目的是为了探讨过继转输的父系抗原耐受T细胞对受体孕鼠反应性T细胞的影响。以(?)CBA/J×(?)BALB/c为正常妊娠模型,(?)CBA/J×(?)DBA/2为自然流产模型,将自然流产模型CBA/ J孕鼠于孕第4天(着床期)分别腹腔注射大鼠抗小鼠CD80和CD86 mAb或大鼠同型IgG。于孕第9天,应用免疫磁珠阴性分选孕鼠的脾脏T细胞,将纯化的T细胞先进行CFSE体外荧光标记,再分别过继转输至孕第4天的CBA/J×DBA/2孕鼠。于受体孕鼠孕第9天,在父系抗原刺激下,采用单向混合淋巴细胞反应分析受体孕鼠脾脏免疫细胞对父系抗原的增殖能力,并用流式细胞术分析过继转输的T细胞及受体T细胞内细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ及细胞表面协同刺激分子CTLA-4的表达。本文结果显示,与过继转输父系抗原非耐受性T细胞相比,转输父系抗原耐受性T细胞和转输正常妊娠模型孕鼠T细胞均使受体孕鼠脾脏免疫细胞对父系抗原的增殖能力显著下降(P<0.05);同时使受体孕鼠T细胞内细胞因子IL-10及细胞表面CTLA-4的表达显著增加,而细胞因子IL-2和IFN-γ的表达则明显下降(P<0.05),细胞因子IL-4的表达不变(P>0.05)。总之,过继转输的父系抗原耐受T细胞具有抑制性免疫调节功能,诱导受体孕鼠反应性T细胞对父系抗原亦产生免疫耐受,两者协同作用则抑制母体对胚胎的免疫排斥,明显改善了自然流产模型孕鼠的妊娠预后。

银掺杂剂量对内皮细胞增殖性能的影响

利用BCA蛋白测定法对银掺杂的二氧化钛(Ag-TiO2)薄膜表面人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖性能进行了研究,并利用细胞毒性LDH实验、免疫荧光标记等方法对影响因素进行了初步探讨。实验结果表明,随着薄膜中掺银剂量的增加,细胞增殖性能降低。其降低原因不是由银的细胞毒性引起的,而是由于银离子的存在影响了内皮细胞的贴壁性能,进而影响了其后续增殖。

荧光显微技术直接观测C_(60)(C(COOH)_(2))_(2)与活细胞的相互作用

合成分离纯化了对中枢神经系统退化性疾病具有治疗效果的水溶性富勒烯丙二酸衍生物C60（C（COOH）2）2，利用荧光显微成像技术直接观察它们与活细胞的相互作用．并利用流式细胞分析技术，进一步对其细胞毒性进行了研究．实验结果发现，这种碳纳米物质能够直接进入细胞，主要集中在细胞质中．不仅如此，C60（C（COOH）2）2还可以将本身不能进入细胞的分子带入细胞中．研究还发现，在1×10^-2-1×10^2mg／L浓度范围内，C60（C（COOH）2）2无明显细胞毒性．研究结果表明C60（C（COOH）2）2在药物载带和输运方面可能具有应用前景．

Runt相关转录因子2在人肾透明细胞癌组织的表达及其临床意义

目的探讨Runt相关转录因子2(RUNX2)在肾透明细胞癌(ccRCC)中的表达及其与患者预后和临床病理特征之间的关系。方法基于肾癌肿瘤基因组图谱(TCGA)数据, 分析RUNX2在癌和癌旁组织中的表达及其预后价值。采用多色免疫荧光标记(mIHC)技术分析RUNX2在癌和癌旁组织中的分布特征, 并结合临床资料进行χ2检验。单因素和拟合多因素Cox模型分析RUNX2及其他指标的预后价值。基于TCGA数据库, 探讨RUNX2与免疫细胞浸润的相关性。结果 TCGA数据分析结果显示, RUNX2在癌组织中的表达显著高于正常组织(P<0.001)。mIHC结果表明RUNX2在癌组织表达水平高于癌旁组织(Z=-2.123, P<0.05), 且其表达水平与患者总生存期呈负相关[P<0.01, 风险比(HR)=2.768, 95%可信区间(CI):1.120~6.838]。RUNX2表达水平与患者美国癌症联合委员会(AJCC)临床分期明显相关(χ2=4.505, P<0.05)。多因素Cox回归模型显示年龄(P<0.01, HR=1.068, 95%CI:1.024~1.113)、病理分级(P<0.05, HR=2.171, 95%CI:1.179~3.997)和AJCC分期(P<0.05, HR=4.638, 95%CI:1.086~19.793)均可以作为肾癌患者的独立预后因素。基于TCGA数据库分析, 证实肾癌组织中RUNX2与多种免疫细胞的浸润程度相关。结论 RUNX2高表达与肾癌患者不良预后明显相关。

硅壳包被的核壳型量子点荧光纳米颗粒的制备及其在细胞识别中的应用

利用反向微乳液技术,以CdTe量子点为核,SiO2为壳,一步制备了表面带有氨基和磷酸基团的核壳型量子点荧光纳米颗粒.该颗粒水溶性好,大小均匀,有效改善了CdTe量子点的不稳定性,抗光漂白性能大大增强.结合纳米技术、生物技术与荧光标记技术,基于硅壳包被的核壳型量子点荧光纳米颗粒,成功实现了对肝实质细胞的识别.

问号钩端螺旋体内化过程中细胞内游离Ca^(2+)水平变化及细胞凋亡

目的 建立观察问号钩端螺旋体 (简称钩体 )黏附的双荧光染色法 ,探讨不同毒力钩体对细胞内游离Ca2 + 水平及细胞凋亡的影响。方法 以问号钩体黄疸出血群赖型 5 6 6 0 1株和双曲钩体三堡垄群patoc型PatocⅠ株抗血清为一抗、羊抗兔IgG荧光素F(ab) 2 和罗丹明F(ab) 2 片段为二抗的双荧光染色法 ,分别检测 5 6 6 0 1株和PatocⅠ株钩体对Vero、J774A .1细胞的黏附作用。采用fluo 3 AM胞内Ca2 + 特异荧光标记激光共聚焦技术 ,检测问号钩体 5 6 6 0 1株和波摩那群波摩那型 5 6 6 0 8株、双曲钩体PatocⅠ株作用的J774A .1细胞胞内游离Ca2 + 水平的变化。采用FITC annexinⅤ PI荧光标记流式细胞术 ,检测紫外线灭活前后的 5 6 6 0 1株钩体诱导Vero和J774A .1细胞凋亡的情况。结果 所建立的双荧光染色法能清晰地观察到强毒力的 5 6 6 0 1株钩体对Vero和J774A .1细胞的黏附 ,无毒力的PatocⅠ株钩体则否。正常J774A .1细胞胞内游离Ca2 + 基础值为 (1 0 5 .0± 7.0 ) %,PatocⅠ株钩体作用细胞的荧光强度变化百分数一直波动于 (1 0 2 .2± 5 .2 ) %。 5 6 6 0 1株钩体感染J774A .1细胞胞内游离Ca2 + 浓度迅速增高 ,呈现为双峰型曲线 ,其荧光强度变化百分数分别为 (74 7.5± 35 .7) %和 (80 4 .6±4 0 .8) %。 5 6