荧光相关光谱及其在单分子检测中的应用进展

单分子检测在生命科学、化学、物理学等领域具有重要的意义。荧光相关光谱是单分子检测的新技术,在生命科学领域有巨大的应用潜力。综述了荧光相关光谱单分子检测的原理、实验技术以及在生物分子相互作用、活细胞、核酸、疾病诊断、高通量筛选以及与毛细管电泳联用等领域的研究,并展望了其发展前景。

多光子激发荧光与毛细管电泳联用的实验研究

将多光子激发荧光探测与毛细管电泳技术相结合,研制了多光子激发荧光 毛细管电泳联用装置。这种方法可以高效快速的分离检测复杂样品中多种不同的荧光分子。作者对5HT ,FAD ,NADH这三种重要的生物分子,不用染料标记,分别用双光子激发和三光子激发,进行了直接的分离、识别和检测。得到的检测限分别是5HT 1. 0×10 -6mol·L-1,FAD 7. 4×10 -7mol·L-1,NADH 9. 8×10 -7mol·L-1。5HT的检测限比紫外吸收低2个数量级;FAD和NADH的检测限比紫外吸收低1个数量级。

蛋白质纯化虚拟仿真课程的教学设计

目的蛋白质纯化是医学与生物学实验教学课程中的一个重要内容,本文通过设计新的蛋白质纯化虚拟仿真教学内容,开发虚拟仿真教学系统,希望学生能够更有效率地掌握蛋白质纯化技术的要点,提升教学质量。方法利用3D虚拟仿真技术,构建虚拟仿真实验室。结合线下教学经验,确定虚拟仿真教学中需要体现的教学内容、教学重点、核心仪器的特色、评分指标、考核方式、操作体验等。结果本文基于3D虚拟仿真技术构建了蛋白质纯化虚拟仿真实验室,和传统教学相比,虚拟仿真教学可以提高教学效率,节省教学成本和场地占用;教学设计和虚拟仿真教学系统融合了教学、练习和考核模块,根据以往的教学经验优化了评分体系,保证学生更加有效、严谨地掌握技术细节;涵盖了全新的教学内容——荧光检测联用的分子排阻层析,添加了蛋白质层析的常用案例,保证了内容的新颖与实用;完全再现了现实实验室中仪器设备的搭建模式,实现虚拟学习与实际操作的无缝衔接。结论蛋白质纯化虚拟仿真教学系统由虚及实,由点及面,把控细节,保证学生动手能力和探索能力的提高,学以致用,并且拥有传统教学模式不可比拟的优势。

液质联用(LC／MS)技术在单克隆抗体(曲妥珠单抗)结构表征上的应用

目的:应用LC/MS(液质联用)和LC/MSE方法(液相色谱/非数据依赖二级质谱数据采集方法,等频率切换高与低碰撞能量进行质谱数据扫描)对单克隆抗体(曲妥珠单抗,人源化单克隆免疫球蛋白IgG1)的结构进行深度表征。方法:先用LC/MS对曲妥珠单抗完整蛋白及其亚基(轻链和重链)的相对分子质量进行测定;然后用多种酶(胰蛋白酶和AspN)酶解蛋白并用LC/MSE肽图分析法对曲妥珠单抗的氨基酸全序列进行解析和确定,同时对可能发生的翻译后修饰(PTMs)进行定性和定量分析。再通过PNGase F酶来释放抗体上的糖链并应用LC/FLR/MS(液相色谱荧光检测与质谱联用)方法对其糖基化修饰进行结构分析及确认。结果:对曲妥珠单抗的完整蛋白及其亚基(轻链和重链)的相对分子质量测定得到良好的质量准确度,由此可判定特定蛋白修饰在轻链和重链上的分布。通过对曲妥珠单抗酶解后的氨基酸全序列确认,可对其翻译后修饰以及可能的错误氨基酸序列进行解析。该抗体肽图分析的氨基酸序列覆盖率是100%。糖基化分析是通过对游离的N-链接寡糖进行2-AB荧光标记后再用LC/FLR/MS(液相色谱荧光检测与质谱联用)方法来进行的。联合使用这些分析方法,能够有效地对不同批号和不同工艺的抗体药物进行常规质量检测和深度表征,控制药物质量,为患者提供安全可靠的生物治疗药品。结论:结合液质联用(LC/MS和LC/MSE)技术,通过完整蛋白相对分子质量的测量,肽图分析测定氨基酸序列以及翻译后修饰的定性和定量分析,结合游离N-链接寡糖的分析表征,对单克隆抗体曲妥珠单抗进行了全面的结构表征,并建立了一套单克隆抗体结构表征的平台化方案。