荧光漂白后恢复技术及其在活细胞分子机制研究中的应用

荧光漂白后恢复(FRAP)是一项利用荧光探针研究活体细胞中各类分子迁移特性的技术。简要介绍了FRAP技术的原理和具体实施要求,列出了动态比和扩散系数的计算公式,并例举了近几年FRAP技术在细胞分子机制研究中的应用。

一种研究酵母朊病毒流动性的荧光漂白后恢复技术的改良

为建立一种经济简便的利用荧光漂白后恢复技术检测酵母朊病毒流动性的方法,在参照文献荧光漂白后恢复技术研究酵母朊病毒流动性的基础上,借助表达融合蛋白GFP-Sup35p的酵母朊病毒模型(NGMC),对文献法的样片制备过程进行改良。采用YPAD培养基和价格低廉的普通载玻分别替代文献使用的培养酵母的合成培养基和固定酵母的腔室载玻片。结果表明:改良法在保持文献法准确性的基础上,操作更为简单,极大地降低了实验成本。

基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复实验方法建立

发展了基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复(TIR/FRAP)的成像方法,该方法通过全内反射显微镜(TIRFM)和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)的联合使用,将全内反射荧光成像和荧光漂白后恢复技术相结合,可广泛用于研究质膜附近分子动力学特征。LSCM对任意感兴趣区域(ROI)执行光漂白,TIRFM特异性采集漂白前后细胞质膜附近的荧光信号,通过NIS-Elements软件程序实现显微镜模式间的自动快速切换。相比目前通用的基于全内反射的光漂白方法,这种方法具备灵活可变漂白区域的优势,可以满足大多数的基于全内反射的光漂白后恢复实验需求。同时,这种技术方法也为开发TIRFM或LSCM与其他设备的联用方法奠定了实践基础。

异位和正常子宫内膜间质细胞对上皮细胞间隙连接细胞间通讯的影响

目的研究体外异位和正常子宫内膜间质细胞对内膜上皮细胞间隙连接细胞间通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)功能的不同影响。方法取24例卵巢处子宫内膜异位灶以及10例正常子宫内膜,分离、纯化上皮细胞和间质细胞,建立体外上皮细胞单独培养、上皮细胞与间质细胞共培养模型。在激光共聚焦显微镜下采用荧光漂白后恢复技术分别检测各组上皮细胞的GJIC功能。结果①异位内膜上皮、间质细胞纯度分别为92%、95%,对照组内膜上皮、间质细胞纯度分别为95%、98%;②单独培养的异位内膜上皮细胞与单独培养的正常内膜上皮细胞的GJIC功能无显著性差异(P>0.05);③与正常间质细胞共培养后,上皮细胞中GJIC功能明显上调,而与异位内膜间质细胞共培养的上皮细胞中GJIC功能未见明显变化。结论异位间质细胞丧失了调节上皮细胞GJIC的能力,这种调节能力的异常可能与子宫内膜异位症发生有关。

EMs异位及在位内膜间质细胞Cx43的表达及GJIC功能的体外研究

目的:研究子宫内膜异位症(EMs)的异位与在位内膜间质细胞中Cx43的表达及间隙连接细胞间通讯(GJIC)功能,探讨间质细胞GJIC功能异常对EMs发病的影响。方法:取24例卵巢处子宫内膜异位灶、41例EMs在位内膜以及30例正常子宫内膜,分离出间质细胞,加入雌、孕激素培养,建立体外间质细胞培养模型。利用激光共聚焦显微镜(LSCM)分别检测三组间质细胞的Cx43表达及GJIC功能。结果:间质细胞成功培养率分别为:异位内膜组45.8%(11/24)、EMs在位内膜组92.7%(38/41)、对照组93.3%(28/30),异位内膜间质细胞纯度为95%,在位内膜间质细胞纯度达98%。EMs异位内膜间质细胞中Cx43表达水平及GJIC功能明显比其他两组低,正常对照组的Cx43表达水平及GJIC功能最高,且差异均有显著性(P﹤0.01)。结论:(1)同时建立EMs异位内膜、在位内膜及正常内膜间质细胞的体外模型,有助于研究EMs的发病机制;(2)间质细胞中Cx43蛋白表达下调及其GJIC功能异常与EMs发生有关,调节Cx43表达或GJIC功能可能是潜在的治疗策略。

ATRA调节人异位子宫内膜间质细胞GJIC Connexin基因、蛋白的作用及意义

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)对人异位子宫内膜间质细胞间隙连接细胞间通讯(GJIC)、connexin基因、蛋白的调节作用及意义。方法:取24例子宫内膜异位症患者卵巢处异位内膜标本,分离纯化得到间质细胞,分别用0.1mmol/L、1mmol/L、10mmol/LATRA处理24h、48h、72h、96h、120h,同时设置空白对照组,采用荧光漂白后恢复技术检测异位内膜间质细胞的GJIC功能,并检测与GJIC功能密切相关的Cx43、Cx26、Cx32的基因及蛋白表达。结果:ATRA处理72h内,1mmol/L、10mmol/L组的异位内膜间质细胞荧光恢复功能明显增强;0.1mmol/LATRA组的异位内膜间质细胞荧光恢复功能无明显变化。未经ATRA处理的异位内膜间质细胞中无Cx43、Cx26、Cx32的mRNA及蛋白表达;经1mmol/LATRA处理后,异位内膜间质细胞中检测到Cx43mRNA和蛋白表达,但未见Cx26、Cx32的mRNA及蛋白表达。结论:ATRA能选择性地诱导Cx43基因及蛋白表达,从而有效上调异位内膜间质细胞的GJIC功能;ATRA可能是治疗子宫内膜异位症的潜在药物。

光学显微成像技术在液-液相分离研究中的应用

近十年来,科学家们发现液-液相分离在许多生理过程中扮演重要角色,发挥着许多生物学功能。一旦发生异常,将会导致多种疾病产生。在生物学研究中,光学显微成像技术是液-液相分离主要的研究工具之一。本文阐述了几个重要的光学显微成像技术在液-液相分离的研究中的应用和对比,以观察相分离的存在和形成等过程。详细地阐述了运用共聚焦显微技术中的荧光漂白后恢复技术(FRAP)检测其扩散和物质交换的特性,并总结了应用该技术时的成像条件、注意事项和参数应用,为科学研究者提供技术选择的依据。

星状孢菌素对近紫外线损伤的兔晶状体上皮细胞通讯血管内皮生长因子的保护作用

目的观察近紫外线对兔晶状体上皮细胞通讯功能的影响,探讨星状孢菌素在近紫外线辐射时对细胞通讯功能的保护作用。方法建立体外培养兔晶状体上皮细胞的近紫外线辐射模型,星状孢菌素作为实验因素,设为正常组、对照组和实验组,应用激光共聚焦显微镜荧光光漂白恢复技术检测细胞的荧光恢复率以评估细胞的通讯功能,采用免疫印迹法分析各组连接蛋白(Cx)43的表达水平。结果近紫外线照射15min后,实验组及对照组的细胞形态均发生变化,但实验组的变化较对照组轻。近紫外线照射10和15min后,实验组荧光恢复率均显著高于对照组(P值均<0.05)。近紫外线照射10min后,实验组晶状体上皮细胞Cx43的表达显著高于对照组(P<0.05),但显著低于正常组(P<0.05)。结论近紫外线辐射可损伤晶状体上皮细胞的通讯功能,星状孢菌素对细胞通讯功能具有显著的保护作用。

三羟异黄酮对BALB／c-3T3细胞间隙连接通讯的影响

[目的]研究三羟异黄酮(GEN)对细胞间隙连接通讯的影响。[方法]采用荧光漂白后恢复(fluorescence redistribution after photobleaching,FRAP)技术,在激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)下观察GEN于浓度为0、12.5、50、100μmol/L时对BALB/c-3T3细胞荧光漂白后恢复的影响。[结果]受试细胞在GEN 12.5μmol/L时经漂白后荧光恢复率为(36.13±5.43)%,与对照组差异无统计学意义;但在50、100μmol/L时经漂白后荧光恢复率分别为(32.93±5.06)%和(28.18±10.69)%,比对照组明显降低。[结论]GEN在较高剂量时抑制细胞间隙连接通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)功能,提示它在一定条件下可能有促癌作用。

激光扫描共聚焦显微镜观察近紫外线辐射对兔晶体上皮细胞通讯功能的影响

目的:通过激光扫描共聚焦显微镜荧光漂白恢复技术观察近紫外线对兔晶状体上皮细胞缝隙连接通讯功能的影响。方法:体外培养兔晶状体上皮细胞,设置空白阴性对照,分为对照组和实验组,分别以近紫外线辐射5分钟,10分钟和15分钟,用荧光光漂白恢复技术检测细胞的荧光恢复率。结果:空白对照组荧光恢复率为57.357±5.610,照射5分钟,10分钟和15分钟近紫外线辐射后的荧光恢复率分别为(%)34.205±3.652,18.909±3.017,7.129±2.917。结论:近紫外线损伤可以导致晶状体上皮细胞间通讯功能的受损。

近紫外线对兔晶状体上皮细胞通讯功能的影响

目的:观察近紫外线对兔晶状体上皮细胞通讯功能的影响.方法:对兔晶状体前囊膜行组织块细胞培养,将传代2～3代兔晶状体上皮细胞在12孔板中培养24 h后,分为正常对照组和近紫外线照射组(同一近紫外线光源下一固定位置50 cm,测得该点的功率为0.2 mW/cm2,给于同一强度,5,10,15 min不同时间的近紫外线照射,采用荧光光漂白恢复技术(FRAP),通过激光共聚焦显微镜检测各组兔晶状体上皮细胞的缝隙连接细胞间通讯(GJIC)功能变化情况.结果:FRAP测定正常对照组和近紫外线照射组细胞GJIC功能,正常对照组细胞平均荧光恢复率为(58.337±5.620)%,随着照射时间的延长,近紫外线照射组细胞平均荧光恢复率逐渐下降,分别为(34.205±3.652)%,(18.809±3.017)%,(7.029±2.917)%,与正常对照组相比较差异具有统计学意义(P<0.01).结论:近紫外线照射能降低兔晶状体上皮细胞GJIC功能,随着照射时间的增加,其功能下降越明显.

微米级核壳量子点团聚体在生物膜中的扩散与溶解及其毒性

包括量子点在内的人工纳米颗粒是近年来突出的环境污染物,为确定其在生物膜中的扩散过程和特征,应用TIRF(全内反射荧光)、FRAP(荧光漂白后恢复)等技术,研究了CdTe/CdS/ZnS核壳式量子的微米级的团聚体在细菌Comamonas testoteroni生物膜表面的吸附动力学、生物膜内部的扩散及其在生物膜中的溶解和毒性.结果表明:通过TIRF技术观察到生物膜可快速吸附>1μm的CdTe/CdS/ZnS核壳式量子点团聚体,而且通过CLSM(激光扫描共聚焦荧光显微镜)进行深度扫描发现,量子点团聚体吸附到生物膜表面后可以进一步扩散到生物膜深层,在25 min内可穿透45μm的生物膜,并在生物膜中随深度呈线性分布特征.FRAP分析表明,量子点团聚体被生物膜固定后还具有较强的移动性,漂白区的荧光强度在5 min可恢复30%.量子点团聚体在生物膜中会溶解产生Cd^(2+)、Zn^(2+)等重金属离子,从而对生物膜产生毒性并杀死细菌.研究显示,虽然纳米颗粒进入环境中会形成微米级的团聚体,但依然可以进入生物膜,对水生微生物生态系统产生危害.TIRF、CLSM和FRAP技术是研究纳米颗粒物在生物膜表面吸附和内部扩散动力学的有效工具.