荧光漂白恢复、荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点

荧光漂白恢复(FRAP)、荧光共振能量转移(FRET)和荧光相关光谱(FCS)是三种以荧光为基础的检测技术,常用来研究分子间相互作用。对三种技术的特点做以比较和讨论。

基于荧光漂白恢复技术检测乳脂肪球膜上生物分子的流动性

为了推动乳制品的精准评价,采用高分辨率激光共聚焦显微镜(CLSM)结合多荧光探针技术观察乳脂肪球的微观结构,并利用荧光漂白恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)定量检测母乳、牛乳、羊乳中乳脂肪球膜上生物分子的流动性。结果表明:3种乳的微观结构基本一致,均出现了新月区,证明了新月区是局部磷脂富集区;乳脂肪球中甘油三酯和水溶性蛋白质的动态分子比例较高,极性脂质和磷脂酰胆碱的动态分子比例较为接近,鞘磷脂的动态分子比例最差;牛乳中甘油三酯的流动性慢于母乳和羊乳,母乳中极性脂的流动性最慢。FRAP可以直观地表征乳脂肪球膜上生物分子的流动性,可为乳状液中膜界面的生化特性研究提供新的方法。

荧光漂白恢复技术及其在生物膜系统研究中的应用

荧光漂白恢复(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)技术,是通过对细胞特定区域荧光分子的漂白及恢复,研究活细胞中各类分子运动及结合特性的技术。FRAP技术广泛应用于细胞膜组分的动态变化、蛋白质的寡聚化、蛋白质的循环、细胞骨架动力学、核膜结构以及细胞信号转导等研究领域,具有重要的应用价值。本文简要介绍了FRAP技术的原理及分类,并着重总结了其在生物膜系统研究中的应用。

在荧光漂白恢复测量中荧光恢复起始时间的研究

在荧光漂白恢复测量中,漂白过程结束的准确时间相对于漂白控制信号后沿会有一定的延迟时间,不易确定.光电倍增管快门开启又要推迟一段时间.因此,荧光恢复起始时间,即漂白结束的瞬间不能准确给出,开始阶段数据收集不全.本文分析了荧光恢复起始时间不准确所造成的误差,测量了起始时间.并尽量减少此误差,使恢复初期收集到的数据更完全,荧光恢复过程的时间座标更准确.

荧光漂白恢复技术在细胞生物学中的应用

荧光漂白恢复(FPR)技术已发展成为定量测定细胞膜分子的流动性的方法之一。本文着重介绍了FPR技术应用于测定细胞膜中和细胞质内分子的运动,这些测定将有助于研究活细胞中膜分子的运动方式、功能及其相互关系。

激光共聚焦显微镜荧光漂白后恢复实验的制样优化

利用激光共聚焦显微镜进行荧光漂白后恢复(FRAP)实验为研究分子的流动性提供了新的手段。然而,在拟南芥根毛细胞中进行荧光漂白后恢复实验时,由于拍摄时长的影响经常会导致样品脱离原来的焦平面,从而无法获得可靠的数据。以拟南芥根尖为材料,通过实验比较激光共聚焦显微镜下的常规制片、指甲油封片以及甘油制片,结果表明,利用指甲油封片能更好地解决样品离焦问题,可以获取有效的实验数据。

荧光光漂白恢复技术在检测膀胱平滑肌细胞间通讯功能中的应用

目的 探讨膀胱平滑肌细胞间通讯的功能变化。方法 利用荧光光漂白恢复 (FRAP)技术检测膀胱平滑肌细胞GJIC功能。结果 在相同的时间内 ,对实验组和对照组膀胱平滑肌细胞漂白后平均荧光恢复率相比较 ,实验组显著高于对照组 (P <0 0 5 )。

荧光漂白后恢复技术及其在活细胞分子机制研究中的应用

荧光漂白后恢复(FRAP)是一项利用荧光探针研究活体细胞中各类分子迁移特性的技术。简要介绍了FRAP技术的原理和具体实施要求,列出了动态比和扩散系数的计算公式,并例举了近几年FRAP技术在细胞分子机制研究中的应用。

一种观察藻胆体移动的光漂白后荧光恢复技术

文章从样品制备、测定方法、数据分析方面就如何应用光漂白后的荧光恢复(FRAP)技术观测蓝藻藻胆体在类囊体膜上的移动进行介绍,得到的结果表明FRAP技术可以直接而有效地观测蓝藻藻胆体在类囊体膜上的移动情况。

一种研究酵母朊病毒流动性的荧光漂白后恢复技术的改良

为建立一种经济简便的利用荧光漂白后恢复技术检测酵母朊病毒流动性的方法,在参照文献荧光漂白后恢复技术研究酵母朊病毒流动性的基础上,借助表达融合蛋白GFP-Sup35p的酵母朊病毒模型(NGMC),对文献法的样片制备过程进行改良。采用YPAD培养基和价格低廉的普通载玻分别替代文献使用的培养酵母的合成培养基和固定酵母的腔室载玻片。结果表明:改良法在保持文献法准确性的基础上,操作更为简单,极大地降低了实验成本。

基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复实验方法建立

发展了基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复(TIR/FRAP)的成像方法,该方法通过全内反射显微镜(TIRFM)和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)的联合使用,将全内反射荧光成像和荧光漂白后恢复技术相结合,可广泛用于研究质膜附近分子动力学特征。LSCM对任意感兴趣区域(ROI)执行光漂白,TIRFM特异性采集漂白前后细胞质膜附近的荧光信号,通过NIS-Elements软件程序实现显微镜模式间的自动快速切换。相比目前通用的基于全内反射的光漂白方法,这种方法具备灵活可变漂白区域的优势,可以满足大多数的基于全内反射的光漂白后恢复实验需求。同时,这种技术方法也为开发TIRFM或LSCM与其他设备的联用方法奠定了实践基础。

纳秒脉冲诱导肿瘤细胞缝隙连接通讯恢复的实验研究

将纳秒脉冲作用于人肝癌细胞(Hep-G2),通过荧光漂白恢复(FRAP)技术,检测荧光萃灭后肿瘤细胞的荧光强度变化情况,以研究纳秒脉冲对肿瘤细胞缝隙连接通讯(GJIC)功能变化的影响。经纳秒脉冲处理后,与对照组相比,处理组荧光恢复率显著增加,且随着时间的推移,所有处理组的荧光恢复率都达到对照组的3倍以上。此外,处理组肿瘤细胞的荧光漂白恢复率随脉冲个数的增加而升高。实验结果表明,纳秒脉冲促进了肿瘤细胞缝隙连接通讯功能的恢复,且在固定的脉冲宽度和幅值下,GJIC对纳秒脉冲作用的响应程度与施加的脉冲个数呈正相关。研究结果不仅为纳秒脉冲用于GJIC障碍性疾病的治疗提供了一条全新的途径,而且也深化了纳秒脉冲诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究。

荧光光漂白恢复技术检测PC12细胞在细菌纤维素上的生长

目的通过荧光光漂白恢复技术观察PC12细胞在纳米细菌纤维素上的生长作用。方法制备纳米细菌纤维素膜并与PC12细胞共培养,通过FRAP技术利用激光共聚焦观察PC12细胞间缝隙连接的通讯功能。结果细胞内荧光被淬灭后可通过缝隙连接通道得到一定程度的恢复,在胞内荧光漂白后第4分钟时,实验组的平均荧光漂白恢复率为(22.3±0.39)%,与对照组的(21.8±0.85)%相比差异无统计学意义。结论 PC12细胞可在细菌纤维素膜上良好生长,能维持正常的细胞间通讯功能。

基于FRAP的微间隙润滑油膜流速测量方法

薄油膜润滑广泛存在于各类精密机械与微机电系统中。微纳米间隙内的润滑油流动是影响薄膜润滑承载力的重要因素,但目前薄润滑油膜的流速测量仍然缺少有效手段。本文基于荧光漂白恢复显微技术和漂白区域形状演化过程的成像分析,建立了油膜流速测量系统,可以对微米间隙润滑油膜的速度分布进行原位测量。利用建立的系统获得了厚度为8μm时聚丁烯PB450润滑油膜的库埃特流速分布。重建的荧光漂白强度分布曲线和实验测量结果的皮尔森相关系数大于0.95,且流速分布符合已有润滑理论,证明了测量结果的可靠性。

Wy10美白与Beyond冷光美白活髓着色牙的疗效比较

目的评价Wy10美白法漂白活髓着色牙的疗效和安全性。方法用Wy10美白系统对30例患者393颗活髓着色牙进行漂白,对照组30例患者378颗活髓着色牙采用Beyond冷光美白法。利用Vita比色板色值测定法、计算机辅助分析法评价美白疗效,并通过牙髓敏感性比较问卷评估牙齿敏感情况。结果Wy10美白组与冷光美白组漂白有效率差异无统计学意义(P>0.05);两组漂白治疗前、后牙面颜色的色差值差异也无统计学意义(P>0.05)。但两组患者在术后即刻、术后1周、术后3个月、术后6个月的牙髓敏感率差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Wy10美白与冷光美白对活髓着色牙的漂白疗效无明显差异,但Wy10美白较冷光美白对牙髓的刺激性轻,临床应用安全性更好。

腺病毒介导的KDR-CDglyTK系统在治疗胃癌中的旁观者效应机制

目的:探讨重组腺病毒介导KDR-CDglyTK系统杀伤胃癌SCG7901细胞时细胞缝隙连接与旁观者效应的关系.方法:感染复数(multiplicity of infection,MOI)=100时,将携带融合基因重组腺病毒体外感染SCG7901、HeLa细胞,检测细胞的感染效率以及转基因肿瘤细胞在mRNA水平上融合基因的表达;用荧光漂白恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)检测SCG7901、HeLa细胞以及芹黄素作用上述两种细胞的细胞间通讯功能.将已转染细胞和未转染细胞分别按10%∶90%和5%∶95%两种比例混合,用含或不含芹黄素的培养基,培养24 h后,在不同组中分别加入GCV、5-FC两者的混合液,72 h后用MTT法检测细胞存活率.结果:受感染的SCG7901和HeLa细胞中均有绿色荧光蛋白的表达.图像中观察到在芹黄素作用下SCG7901细胞淬灭后荧光强度明显降低,随后随着时间的推移,被淬灭细胞的荧光强度逐渐恢复,在相同时间内其恢复强度较未应用上调剂的SCG7901细胞要强;而在芹黄素作用下的HeLa细胞被淬灭后荧光强度明显降低,随时间的推移荧光强度无明显恢复,在上调剂芹黄素作用下的SCG7901与HeLa细胞间的荧光恢复率有差异.同时,观察到双自杀基因系统在转基因细胞比例分别占5%、10%时,SCG7901细胞在空白组、前药组、芹黄素组、前药+芹黄素组间细胞生存率有差异(F=144.42,P=0.000)、(F=407.83,P=0.000),而HeLa细胞在各组间的细胞生存率无统计学意义(F=0.386,P=0.765)、(F=0.895,P=0.472).结论:FRAP技术证实SCG7901细胞间通讯功能与缝隙连接有一定关系,而HeLa细胞不存在细胞间通讯功能.双自杀基因系统治疗SCG7901细胞时存在旁观者效应而且上调剂可以扩大其旁杀效应;但HeLa细胞不存在旁观者效应.双自杀基因系统治疗胃癌细胞时旁观者效应与细胞间缝隙连接有关.

光学在生物分子研究中的应用

综述了如荧光漂白恢复(FRAP)、荧光共振能量转移(FRET)、荧光相关光谱(FCS)、表面质膜共振(SPR)等光学方法在生物分子研究中的应用。

G蛋白偶联受体寡聚体的研究方法

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs)能以同源或异源二聚体,甚至是高阶寡聚体的形式存在,这些形式有不同于单体的特异功能特征,例如生物合成、配体连接、脱敏、内化和降解,因此成为备受关注的药物设计靶点。而对GPCRs这些寡聚体形式进行药物设计首要的任务是要确定这些受体之间能否形成寡聚体。因此,本文将全面介绍用于研究GPCRs寡聚化的生物化学和生物物理方法。

不同恶化程度胃癌细胞系的细胞间隙连接通讯功能及Cx43表达的差异

以人正常胃黏膜上皮细胞系GES-1和不同恶化程度的人胃癌细胞系(低恶化AGS细胞系、中恶化SGC-7901细胞系、高恶化BGC-823细胞系)为研究对象,采用激光共聚焦显微镜的荧光漂白恢复技术及划痕标记荧光染料示踪技术研究不同恶化程度的胃癌细胞系细胞间隙连接通讯(Gap junctional intercellular communication,GJIC)功能的差异;采用荧光定量PCR技术和间接免疫荧光技术检测间隙连接蛋白(Connexin43,Cx43)基因在mRNA和蛋白水平的表达差异,探求其与胃癌恶性程度的相关性.结果表明,在正常胃细胞系和低、中及高恶化胃腺癌细胞系中,细胞间的GJIC功能随着恶性程度的升高而减弱(AGS、SGC-7901)或消失(BGC-823),且Cx43蛋白及mRNA的表达量随着恶性程度的升高而下调(AGS、SGC-7901)或缺失(BGC-823).这提示胃癌恶性程度与胃癌细胞的GJIC功能显著相关(P<0.05),GJIC在胃癌发生中起重要作用.