基于荧光漂白恢复技术检测乳脂肪球膜上生物分子的流动性

为了推动乳制品的精准评价,采用高分辨率激光共聚焦显微镜(CLSM)结合多荧光探针技术观察乳脂肪球的微观结构,并利用荧光漂白恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)定量检测母乳、牛乳、羊乳中乳脂肪球膜上生物分子的流动性。结果表明:3种乳的微观结构基本一致,均出现了新月区,证明了新月区是局部磷脂富集区;乳脂肪球中甘油三酯和水溶性蛋白质的动态分子比例较高,极性脂质和磷脂酰胆碱的动态分子比例较为接近,鞘磷脂的动态分子比例最差;牛乳中甘油三酯的流动性慢于母乳和羊乳,母乳中极性脂的流动性最慢。FRAP可以直观地表征乳脂肪球膜上生物分子的流动性,可为乳状液中膜界面的生化特性研究提供新的方法。

荧光漂白恢复技术及其在生物膜系统研究中的应用

荧光漂白恢复(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)技术,是通过对细胞特定区域荧光分子的漂白及恢复,研究活细胞中各类分子运动及结合特性的技术。FRAP技术广泛应用于细胞膜组分的动态变化、蛋白质的寡聚化、蛋白质的循环、细胞骨架动力学、核膜结构以及细胞信号转导等研究领域,具有重要的应用价值。本文简要介绍了FRAP技术的原理及分类,并着重总结了其在生物膜系统研究中的应用。

荧光光漂白恢复技术在检测膀胱平滑肌细胞间通讯功能中的应用

目的 探讨膀胱平滑肌细胞间通讯的功能变化。方法 利用荧光光漂白恢复 (FRAP)技术检测膀胱平滑肌细胞GJIC功能。结果 在相同的时间内 ,对实验组和对照组膀胱平滑肌细胞漂白后平均荧光恢复率相比较 ,实验组显著高于对照组 (P <0 0 5 )。

纳秒脉冲诱导肿瘤细胞缝隙连接通讯恢复的实验研究

将纳秒脉冲作用于人肝癌细胞(Hep-G2),通过荧光漂白恢复(FRAP)技术,检测荧光萃灭后肿瘤细胞的荧光强度变化情况,以研究纳秒脉冲对肿瘤细胞缝隙连接通讯(GJIC)功能变化的影响。经纳秒脉冲处理后,与对照组相比,处理组荧光恢复率显著增加,且随着时间的推移,所有处理组的荧光恢复率都达到对照组的3倍以上。此外,处理组肿瘤细胞的荧光漂白恢复率随脉冲个数的增加而升高。实验结果表明,纳秒脉冲促进了肿瘤细胞缝隙连接通讯功能的恢复,且在固定的脉冲宽度和幅值下,GJIC对纳秒脉冲作用的响应程度与施加的脉冲个数呈正相关。研究结果不仅为纳秒脉冲用于GJIC障碍性疾病的治疗提供了一条全新的途径,而且也深化了纳秒脉冲诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究。

应用FRAP技术研究高蛋白中间水分食品体系中的分子迁移

文中构建了酪蛋白酸钠和浓缩乳蛋白这2种高蛋白中间水分食品模型体系,并采用荧光漂白恢复技术对模型体系在贮藏过程中微观结构变化以及分子迁移运动等进行观察。实验结果表明:高蛋白中间水分模型体系的荧光恢复率与蛋白的种类和贮藏时间有关,其中,浓缩乳蛋白模型体系较酪蛋白酸钠模型体系的荧光强度恢复迅速,且随着贮藏时间的延长,这2种模型体系的荧光强度恢复率呈逐渐减缓的趋势。由此可见,高蛋白中间水分食品在贮藏前期体系中小分子在热力学牵引下发生迁移运动有可能进一步导致体系微结构及质地的改变。

应用FRAP技术评价蛋白在聚丙烯酰胺-丙烯酸凝胶中的扩散行为

药物分子从药物载体中的释放行为与载体的结构有密切关系.本实验中采用丙烯酰胺和丙烯酸等材料,运用水相沉淀的方法,制备了4种不同单体配比的聚丙烯酰胺-丙烯酸(P(Am-co-Ac))共聚物水凝胶.运用红外分析方法对P(Am-co-Ac)组成进行表征.使用荧光漂白恢复法(FRAP,fluorescence recovery after photobleaching)观察荧光素FITC标记的牛血清白蛋白(BSA)在聚丙烯酰胺-丙烯酸中的扩散行为,并以激光共聚焦显微镜进行实时成像.实验表明,FITC-BSA在不同单体配比的共聚物中的扩散系数是不同的.通过调节聚合物中单体的配比能够达到控制蛋白释放速率的作用,从而为调控蛋白和多肽类药物的缓控释放提供了可能性.

Wy10美白与Beyond冷光美白活髓着色牙的疗效比较

目的评价Wy10美白法漂白活髓着色牙的疗效和安全性。方法用Wy10美白系统对30例患者393颗活髓着色牙进行漂白,对照组30例患者378颗活髓着色牙采用Beyond冷光美白法。利用Vita比色板色值测定法、计算机辅助分析法评价美白疗效,并通过牙髓敏感性比较问卷评估牙齿敏感情况。结果Wy10美白组与冷光美白组漂白有效率差异无统计学意义(P>0.05);两组漂白治疗前、后牙面颜色的色差值差异也无统计学意义(P>0.05)。但两组患者在术后即刻、术后1周、术后3个月、术后6个月的牙髓敏感率差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Wy10美白与冷光美白对活髓着色牙的漂白疗效无明显差异,但Wy10美白较冷光美白对牙髓的刺激性轻,临床应用安全性更好。

腺病毒介导的KDR-CDglyTK系统在治疗胃癌中的旁观者效应机制

目的:探讨重组腺病毒介导KDR-CDglyTK系统杀伤胃癌SCG7901细胞时细胞缝隙连接与旁观者效应的关系.方法:感染复数(multiplicity of infection,MOI)=100时,将携带融合基因重组腺病毒体外感染SCG7901、HeLa细胞,检测细胞的感染效率以及转基因肿瘤细胞在mRNA水平上融合基因的表达;用荧光漂白恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)检测SCG7901、HeLa细胞以及芹黄素作用上述两种细胞的细胞间通讯功能.将已转染细胞和未转染细胞分别按10%∶90%和5%∶95%两种比例混合,用含或不含芹黄素的培养基,培养24 h后,在不同组中分别加入GCV、5-FC两者的混合液,72 h后用MTT法检测细胞存活率.结果:受感染的SCG7901和HeLa细胞中均有绿色荧光蛋白的表达.图像中观察到在芹黄素作用下SCG7901细胞淬灭后荧光强度明显降低,随后随着时间的推移,被淬灭细胞的荧光强度逐渐恢复,在相同时间内其恢复强度较未应用上调剂的SCG7901细胞要强;而在芹黄素作用下的HeLa细胞被淬灭后荧光强度明显降低,随时间的推移荧光强度无明显恢复,在上调剂芹黄素作用下的SCG7901与HeLa细胞间的荧光恢复率有差异.同时,观察到双自杀基因系统在转基因细胞比例分别占5%、10%时,SCG7901细胞在空白组、前药组、芹黄素组、前药+芹黄素组间细胞生存率有差异(F=144.42,P=0.000)、(F=407.83,P=0.000),而HeLa细胞在各组间的细胞生存率无统计学意义(F=0.386,P=0.765)、(F=0.895,P=0.472).结论:FRAP技术证实SCG7901细胞间通讯功能与缝隙连接有一定关系,而HeLa细胞不存在细胞间通讯功能.双自杀基因系统治疗SCG7901细胞时存在旁观者效应而且上调剂可以扩大其旁杀效应;但HeLa细胞不存在旁观者效应.双自杀基因系统治疗胃癌细胞时旁观者效应与细胞间缝隙连接有关.

G蛋白偶联受体寡聚体的研究方法

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs)能以同源或异源二聚体,甚至是高阶寡聚体的形式存在,这些形式有不同于单体的特异功能特征,例如生物合成、配体连接、脱敏、内化和降解,因此成为备受关注的药物设计靶点。而对GPCRs这些寡聚体形式进行药物设计首要的任务是要确定这些受体之间能否形成寡聚体。因此,本文将全面介绍用于研究GPCRs寡聚化的生物化学和生物物理方法。

不同恶化程度胃癌细胞系的细胞间隙连接通讯功能及Cx43表达的差异

以人正常胃黏膜上皮细胞系GES-1和不同恶化程度的人胃癌细胞系(低恶化AGS细胞系、中恶化SGC-7901细胞系、高恶化BGC-823细胞系)为研究对象,采用激光共聚焦显微镜的荧光漂白恢复技术及划痕标记荧光染料示踪技术研究不同恶化程度的胃癌细胞系细胞间隙连接通讯(Gap junctional intercellular communication,GJIC)功能的差异;采用荧光定量PCR技术和间接免疫荧光技术检测间隙连接蛋白(Connexin43,Cx43)基因在mRNA和蛋白水平的表达差异,探求其与胃癌恶性程度的相关性.结果表明,在正常胃细胞系和低、中及高恶化胃腺癌细胞系中,细胞间的GJIC功能随着恶性程度的升高而减弱(AGS、SGC-7901)或消失(BGC-823),且Cx43蛋白及mRNA的表达量随着恶性程度的升高而下调(AGS、SGC-7901)或缺失(BGC-823).这提示胃癌恶性程度与胃癌细胞的GJIC功能显著相关(P<0.05),GJIC在胃癌发生中起重要作用.

动脉粥样硬化中单核细胞膜流动性研究

为研究动脉粥样硬化中单核细胞膜流动性的变化,本实验选用20只新西兰白兔建立动物粥样硬化模型,提取模型组与对照组兔外周血中单核细胞,通过荧光漂白恢复技术检测单核细胞膜流动性,并结合动脉粥样硬化动物模型病理切片揭示其与动脉粥样硬化相关性。结果显示动物动脉粥样硬化模型建立成功,模型组单核细胞膜的荧光恢复率和扩散系数均低于对照组。本研究揭示了单核细胞细胞膜的流动性与动脉粥样硬化的发生有关,为今后深入探究单核细胞与动脉粥样硬化关系提供实验基础。

异位和正常子宫内膜间质细胞对上皮细胞间隙连接细胞间通讯的影响

目的研究体外异位和正常子宫内膜间质细胞对内膜上皮细胞间隙连接细胞间通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)功能的不同影响。方法取24例卵巢处子宫内膜异位灶以及10例正常子宫内膜,分离、纯化上皮细胞和间质细胞,建立体外上皮细胞单独培养、上皮细胞与间质细胞共培养模型。在激光共聚焦显微镜下采用荧光漂白后恢复技术分别检测各组上皮细胞的GJIC功能。结果①异位内膜上皮、间质细胞纯度分别为92%、95%,对照组内膜上皮、间质细胞纯度分别为95%、98%;②单独培养的异位内膜上皮细胞与单独培养的正常内膜上皮细胞的GJIC功能无显著性差异(P>0.05);③与正常间质细胞共培养后,上皮细胞中GJIC功能明显上调,而与异位内膜间质细胞共培养的上皮细胞中GJIC功能未见明显变化。结论异位间质细胞丧失了调节上皮细胞GJIC的能力,这种调节能力的异常可能与子宫内膜异位症发生有关。

EMs异位及在位内膜间质细胞Cx43的表达及GJIC功能的体外研究

目的:研究子宫内膜异位症(EMs)的异位与在位内膜间质细胞中Cx43的表达及间隙连接细胞间通讯(GJIC)功能,探讨间质细胞GJIC功能异常对EMs发病的影响。方法:取24例卵巢处子宫内膜异位灶、41例EMs在位内膜以及30例正常子宫内膜,分离出间质细胞,加入雌、孕激素培养,建立体外间质细胞培养模型。利用激光共聚焦显微镜(LSCM)分别检测三组间质细胞的Cx43表达及GJIC功能。结果:间质细胞成功培养率分别为:异位内膜组45.8%(11/24)、EMs在位内膜组92.7%(38/41)、对照组93.3%(28/30),异位内膜间质细胞纯度为95%,在位内膜间质细胞纯度达98%。EMs异位内膜间质细胞中Cx43表达水平及GJIC功能明显比其他两组低,正常对照组的Cx43表达水平及GJIC功能最高,且差异均有显著性(P﹤0.01)。结论:(1)同时建立EMs异位内膜、在位内膜及正常内膜间质细胞的体外模型,有助于研究EMs的发病机制;(2)间质细胞中Cx43蛋白表达下调及其GJIC功能异常与EMs发生有关,调节Cx43表达或GJIC功能可能是潜在的治疗策略。

ATRA调节人异位子宫内膜间质细胞GJIC Connexin基因、蛋白的作用及意义

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)对人异位子宫内膜间质细胞间隙连接细胞间通讯(GJIC)、connexin基因、蛋白的调节作用及意义。方法:取24例子宫内膜异位症患者卵巢处异位内膜标本,分离纯化得到间质细胞,分别用0.1mmol/L、1mmol/L、10mmol/LATRA处理24h、48h、72h、96h、120h,同时设置空白对照组,采用荧光漂白后恢复技术检测异位内膜间质细胞的GJIC功能,并检测与GJIC功能密切相关的Cx43、Cx26、Cx32的基因及蛋白表达。结果:ATRA处理72h内,1mmol/L、10mmol/L组的异位内膜间质细胞荧光恢复功能明显增强;0.1mmol/LATRA组的异位内膜间质细胞荧光恢复功能无明显变化。未经ATRA处理的异位内膜间质细胞中无Cx43、Cx26、Cx32的mRNA及蛋白表达;经1mmol/LATRA处理后,异位内膜间质细胞中检测到Cx43mRNA和蛋白表达,但未见Cx26、Cx32的mRNA及蛋白表达。结论:ATRA能选择性地诱导Cx43基因及蛋白表达,从而有效上调异位内膜间质细胞的GJIC功能;ATRA可能是治疗子宫内膜异位症的潜在药物。

人脐动脉内皮细胞和平滑肌细胞体外培养鉴定及缝隙连接通讯功能测定

目的:应用双光子激光扫描共聚焦显微镜鉴定体外培养的脐动脉内皮细胞(ECs)和平滑肌细胞(SMCs),应用荧光光漂白恢复技术(FRAP)测定血管ECs、SMCs之间的缝隙连接通讯(GJIC)功能。方法:人脐动脉ECs、SMCs分离培养,Ⅷ因子和SMα-actin相关抗原鉴定ECs和SMCs,应用FRAP技术测定血管内皮细胞、平滑肌细胞之间的GJIC功能,记录实时成像结果,应用动态比(M)计算漂白区域内标记荧光的分子中动态分子的比例。结果:第一组ECs和SMCs单独培养,选择漂白细胞与周围至少3个同种细胞相连接,SMCs被漂白后平均M值为31.79±5.69;ECs被漂白后平均M值为23.43±2.11;第二组ECs和SMCs混合培养,选择ECs和SMCs独立相连的2个细胞,SMCs被漂白后平均M值为14.47±3.28,ECs被漂白后平均M值为6.41±0.80。结论:FRAP实时动态恢复曲线可直接观察荧光恢复强度及速度,参照FRAP恢复曲线,M值可做为组间GJIC比较相对定量的可靠指标,通过检测证实ECs和SMCs之间存在GJIC,且荧光由ECs向SMCs方向的传递大于由SMCs向ECs方向的传递。

近紫外线对兔晶状体上皮细胞通讯功能的影响

目的:观察近紫外线对兔晶状体上皮细胞通讯功能的影响.方法:对兔晶状体前囊膜行组织块细胞培养,将传代2～3代兔晶状体上皮细胞在12孔板中培养24 h后,分为正常对照组和近紫外线照射组(同一近紫外线光源下一固定位置50 cm,测得该点的功率为0.2 mW/cm2,给于同一强度,5,10,15 min不同时间的近紫外线照射,采用荧光光漂白恢复技术(FRAP),通过激光共聚焦显微镜检测各组兔晶状体上皮细胞的缝隙连接细胞间通讯(GJIC)功能变化情况.结果:FRAP测定正常对照组和近紫外线照射组细胞GJIC功能,正常对照组细胞平均荧光恢复率为(58.337±5.620)%,随着照射时间的延长,近紫外线照射组细胞平均荧光恢复率逐渐下降,分别为(34.205±3.652)%,(18.809±3.017)%,(7.029±2.917)%,与正常对照组相比较差异具有统计学意义(P<0.01).结论:近紫外线照射能降低兔晶状体上皮细胞GJIC功能,随着照射时间的增加,其功能下降越明显.

星状孢菌素对近紫外线损伤的兔晶状体上皮细胞通讯血管内皮生长因子的保护作用

目的观察近紫外线对兔晶状体上皮细胞通讯功能的影响,探讨星状孢菌素在近紫外线辐射时对细胞通讯功能的保护作用。方法建立体外培养兔晶状体上皮细胞的近紫外线辐射模型,星状孢菌素作为实验因素,设为正常组、对照组和实验组,应用激光共聚焦显微镜荧光光漂白恢复技术检测细胞的荧光恢复率以评估细胞的通讯功能,采用免疫印迹法分析各组连接蛋白(Cx)43的表达水平。结果近紫外线照射15min后,实验组及对照组的细胞形态均发生变化,但实验组的变化较对照组轻。近紫外线照射10和15min后,实验组荧光恢复率均显著高于对照组(P值均<0.05)。近紫外线照射10min后,实验组晶状体上皮细胞Cx43的表达显著高于对照组(P<0.05),但显著低于正常组(P<0.05)。结论近紫外线辐射可损伤晶状体上皮细胞的通讯功能,星状孢菌素对细胞通讯功能具有显著的保护作用。

5-HT_(1A)受体蛋白在PC12细胞膜转运的动态变化

目的在神经元样PC12活细胞上进行实时、可视和定量研究5-羟色胺1A受体的时空分布、膜转运和信号传导机制。方法运用RT-PCR方法获得小鼠5-HT1A基因,并插入到pEGFP-N1真核表达载体中。采用阳离子脂质体方法将质粒转染至PC12细胞和HEK293细胞中,通过G418筛选出稳定表达5-HT1A-EGFP的PC12细胞系。运用激光共聚焦成像系统观察活细胞中5-HT1A-EGFP的表达情况,利用光漂白荧光恢复(FRAP)技术在PC12细胞膜局部漂白后观察5-HT1A-EGFP荧光蛋白在细胞膜上转运的情况。结果克隆所获得的小鼠5-HT1A基因是准确的。5-HT1A-EGFP蛋白清晰的分布于PC12和HKE293细胞膜上。通过FRAP技术观察到漂白区域的细胞膜在100s内有部分恢复,说明受体在细胞膜上发生转运。结论建立了稳定表达5-HT1A-EGFP融合蛋白的PC12细胞系,并利用活细胞成像和FRAP技术观察分析并证实了5-HT1A受体在PC12细胞的膜表面的表达和转运的动态变化。