基于荧光激活细胞分选技术的超高通量酶活性筛选方法及其应用

基于荧光激活细胞分选(FACS)技术的超高通量酶活性筛选方法是新出现的一类高通量筛选技术.它利用流式细胞仪高灵敏度、高通量的特点,能以极高的速度(>108/天)对大容量酶基因文库进行筛选.FACS筛选技术的出现突破了常规筛选方法低效、耗时、费力等瓶颈问题,极大地提升了人类对大容量基因文库的探索能力,因此在新酶基因筛选、酶活性检测、酶定向进化等领域有广泛的应用潜力.综述了FACS超高通量酶活性筛选方法的最新研究进展,着重介绍了其在酶定向进化中的应用.

荧光激活细胞分离技术在角膜缘干细胞研究中的应用

目的探讨荧光激活细胞分离技术(FACS)在体外培养的兔角膜缘上皮细胞生物学特性研究中的应用。方法收集新西兰白兔的角膜缘组织进行组织块培养。采用FACS分离出体外培养的兔角膜缘上皮细胞中的侧群(SP)细胞和非SP细胞。用2%锥虫蓝染色法对分离出的SP细胞进行克隆形成率(CFE)检测以评估SP细胞的活性,用免疫组织化学染色检测K3/12和ABCG2蛋白在SP细胞和非SP细胞中的表达。结果SP细胞在体外培养的兔角膜缘上皮细胞中占(0.22±0.09)%,分离出的SP细胞的CFE为(5.52±0.45)%,而非SP细胞为(0.78±0.73)%,二者差异有统计学意义(t=2.17,P<0.01);大部分SP细胞呈K3/K12抗原阴性,ABCG2免疫标记呈阳性;而非SP细胞呈K3/K12抗原阳性,ABCG2免疫标记呈阴性。结论FACS可以应用于体外培养的兔角膜缘上皮细胞的SP细胞分离,分离出的SP细胞具有较强的增生能力。

荧光激活细胞分选转基因标记斑马鱼神经元

对常规试验方法加以改进,使之适用于斑马鱼脑部荧光标记神经细胞的分选。以lhx5∶Kaede转基因株系为例,利用转基因斑马鱼脑部制备单细胞悬液进行荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting,FACS),获得lhx5荧光标记细胞。提取总RNA后进行基因芯片分析从而了解lhx5标记神经元的基因表达特性。结果显示,通过本流程可成功制备斑马鱼幼鱼脑部单细胞悬液,lhx5∶Kaede平均荧光阳性率为6%。提取RNA质量及总量均能满足基因芯片要求。基因芯片结果显示lhx5及其他标记分子的表达均得到了显著富集。有效地分离斑马鱼幼鱼中枢神经系统荧光标记细胞,可用于特定细胞群的基因表达谱分析。

荧光激活细胞分选技术加速酶定向进化

目前,定向进化技术是改造工业酶的主要方法,而高通量筛选技术是酶定向进化的瓶颈技术之一。其中,荧光激活细胞分选技术(FACS)因其具有极高的筛选效率和广阔的通用性逐渐成为酶定向进化中首选的高通量筛选技术。依据不同的区室化策略,将荧光激活细胞分选技术分成细胞、液滴和微室高通量筛选技术。本文综述这3种新兴的筛选方法在技术方面的优劣势,并展望荧光激活细胞分选技术在未来的应用前景。

集成化荧光激活液滴分选系统研究

高通量的荧光激活液滴分选技术在大规模生化试验中能够显著降低实验成本,缩短实验时间,因此在微生物菌株筛选、新药研发、高通量单细胞研究等众多领域具有广泛的应用。然而,目前使用的荧光激活液滴分选系统大多基于光学试验器件搭建,系统的灵活性、稳定性相对较差,搭建的技术门槛较高,限制了该技术在生命科学研究等领域的推广应用。设计一种集成化的荧光激活液滴分选系统,通过特定光路设计,系统所需的荧光激发和探测光路实现集成化、模块化封装,荧光激发和探测功能模块缩小到160 mm×143 mm×54 mm,大幅缩减系统体积。可以通过给普通显微镜增加功能模块的方式,快速实现分选系统的搭建,从而提高荧光激活液滴分选技术的易用性。相比现有文献报道的荧光激活液滴分选系统,成本下降到1/5,体积减小为1/40,有利于该技术的工业化推广。

利用荧光激活细胞分选技术获取荧光蛋白标记肾小球足细胞

目的:本实验旨在以双荧光蛋白标记的转基因小鼠为动物模型,建立适用于小鼠荧光标记足细胞的分选方法。方法:对现有的常规实验方法加以优化,在使用报告基因小鼠的前提下辅以更有效的磁珠灌注法提取肾小球,进一步制备单细胞悬液进行荧光激活细胞分选(FACS),获得绿色荧光蛋白标记足细胞。利用荧光显微镜及荧光定量PCR分析证实分选所得足细胞基因表达特性。结果:通过本实验方法可更有效制备肾小球单细胞悬液和高纯度的足细胞,每只小鼠可提取超过3×105的足细胞,占细胞总量的14.93%,质量可满足后续转录谱和蛋白组学等相关研究。结论:应用FACS技术可有效地从荧光标记小鼠中提取高纯度足细胞,为足细胞基因组学、蛋白组学水平的研究奠定基础。

基于四配位铂配合物敏化多重共振热激活延迟荧光的窄发射蓝色溶液加工有机发光二极管

有机发光二极管(OLED)已经在智能手机方面获得了商业应用,由于目前规模生产的OLED采用蒸镀工艺,使其价格居高不下。为此,我们采用溶液加工方法,使用铂配合物作为敏化剂,多重共振热激活延迟荧光材料作为发光分子,实现了高效、高色纯度、低效率滚降的器件开发。磷光敏化剂的引入可使三线态激子高效转化为单线态激子。得益于磷光敏化剂较短的激子寿命,基于溶液加工的蓝色多重共振热激活延迟荧光器件不仅实现了13.2%的外量子效率,而且在1000 cd/m^(2)亮度下的效率滚降仅为25.8%。为了进一步抑制Dexter能量转移,我们采用具有外围位阻但发光核相同的分子作为客体,可使外量子效率提升至13.6%,并抑制光谱展宽。该研究为设计高色纯度、高效率的溶液加工器件提供了一个通用的策略。

基于化学激活荧光素酶表达基因法和标准方法评估动物源性固态食品中17种二噁英类化合物毒性当量的相关性比较

为使化学激活荧光素酶表达基因法(CALUX)在动物源性固态食品中二噁英类化合物毒性当量筛查中具有更好的适用性,使其能够与标准方法高分辨气相色谱-高分辨质谱法(HRGC-HRGC)的评估结果相互转换,分别基于CALUX和HRGC-HRGC评估了肉类、海鲜类和配方乳粉这3类典型动物源性固态食品中7种2,3,7,8-取代的多氯代二苯并二噁英(PCDDs)和10种2,3,7,8-取代的多氯代二苯并呋喃(PCDFs)的毒性当量,分析两种方法测定结果的相关性,并确定换算关系和适宜样品类型。结果表明:基于HRGC-HRMS得到的样品中17种目标物的毒性当量(TEQ)下限值为0.001~0.106 pg·g^(-1),TEQ上限值为0.004~0.242 pg·g^(-1),远低于欧盟法规EC 1881/2006规定的限量值(3.5 pg·g^(-1));基于CALUX得到的肉类样品中17种目标物的毒性当量(BEQ)值为0.74~1.30 pg·g^(-1),海鲜类样品中17种目标物的BEQ值为0.31~0.63 pg·g^(-1),配方乳粉样品中17种目标物的BEQ值为0.043~0.074 pg·g^(-1);肉类和配方乳粉样品的BEQ值与TEQ值的相关性较差,而海鲜类样品的BEQ值与TEQ上限值相关性较好。

基于2-氰基吡啶电子受体的热激活延迟荧光材料

合成了4种以2-氰基吡啶为电子受体的发光材料,考察了不同电子给体对材料发光性能的影响.研究结果表明,化合物5-(10H-吩噻嗪-10-基)吡啶腈(PTPN)的单晶结构中,吡啶环之间的分子间氢键及吩噻嗪基团之间的C-H···π分子间相互作用使吡啶环与噻吩基团之间形成共平面的构型,导致其发光由薄膜中的520 nm蓝移至400 nm.4种化合物在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄膜中的发光波长在434~520 nm之间.化合物5-(10H-吩噁嗪-10-基)吡啶腈(PXPN),PTPN和5-[9,9-二甲基吖啶-10(9H)-基]吡啶腈(DAPN)的光致发光量子效率(PLQY)在0.17~0.57之间,具有热激活延迟荧光(TADF)发光性质,延迟荧光寿命在4.1~5.3μs之间,单重态/三重态能隙(ΔEST)在0.045~0.069 eV之间.化合物5-(3,6-二叔丁基-9H-咔唑-9-基)吡啶腈(BCPN)的PLQY为0.91,发光寿命为12.4 ns,为荧光发射.电致发光器件性能测试表明,4种材料均发射绿光,其中DAPN的综合器件性能最佳,掺杂器件的最大亮度可达2855 cd/m^(2),峰值电流效率(CE)、功率效率(PE)和外量子效率(EQE)分别为37.6 cd/A,12.6 lm/W和10.4%.基于化合物BCPN的器件形成了高效的电致激基复合物,器件的最大亮度可达2367 cd/m^(2),峰值CE,PE和EQE分别为29.3 cd/A,11.5 lm/W和9.4%.该研究表明,氰基吡啶受体能形成稳定的分子间氢键,可用于TADF材料的开发.

蓝光热激活延迟荧光分子设计策略概述

热激活延迟荧光(thermally activated delayed fluorescence,TADF)分子由于三重态上的激子可以通过反向系间窜越到单重态并辐射发出荧光,因此在有机发光二极管(organic light-emitting diode,OLED)中理论上可以实现100%的激子利用率。具有TADF特性的发光材料融合了第一代荧光材料和第二代磷光材料的优点,不仅可以实现100%的内量子效率,还有助于降低器件的材料成本,被誉为第三代OLED发光材料,并成为突破高效稳定蓝光OLED瓶颈的潜在解决方案。本文从发光机理出发,系统阐述了高效稳定蓝光TADF分子的设计策略,包括高荧光量子产率、短延迟荧光寿命、窄发射光谱半峰宽、显著的水平分子取向和良好的光电稳定性等。本文旨在为高性能蓝光TADF分子的开发提供理论支持。最后,总结了当前蓝光TADF材料存在的问题,并对其未来的发展前景进行了展望。

基于四氰基受体单元的高效近红外热激活延迟荧光

以二吡啶并吩嗪为受体单元,三苯胺(TPA)为给体单元,设计合成了近红外(NIR)热激活延迟荧光(TADF)材料11,12-双[4-(二苯基氨基)苯基]联吡啶[3,2-a:2',3'-c]吩嗪-3,6,10,13-四甲腈(FCNPZ-TPA).在FCNPZ-TPA分子的受体单元上引入4个氰基增加了受体单元的吸电子能力.考虑到TPA具有优异的给电子能力,将强给体-强受体单元同时引入分子骨架中,使得FCNPZ-TPA的发射波长红移到近红外区域.另外,给体(D)和受体(A)单元之间空间位阻导致FCNPZ-TPA具有扭曲D-A分子构型,从而实现了较小的单线态-三线态能级差(ΔE_(ST)).得益于FCNPZ-TPA分子刚性骨架以及较小的ΔE_(ST),当FCNPZ-TPA掺杂在主体4,4'-二(9-咔唑)联苯中时,该有机支光二极管器件在发射波长为742 nm处实现了8.01%的最大外量子效率(EQE).

具有分子间电荷转移效应的D-σ-A型热激活延迟荧光材料及其电致发光性能

设计合成了三种D-σ-A型热激活延迟荧光(TADF)材料2-(4-(9H-咔唑-9-基)苯氧基)蒽-9,10-二酮(AQOPCZ)、2-(4-(二苯氨基)苯氧基)蒽-9,10-二酮(AQOPDPA)和2-(4-(9,9-二甲基吖啶-10(9H)-基)苯氧基)蒽-9,10-二酮(AQOPDMAC)。这三种材料均采用C-Oσ键连接受体和供体,由于σ键阻断供体和受体之间的共轭,较好地实现了三种材料最高未占分子轨道(HOMO)和最低已占分子轨道(LUMO)轨道之间的分离,因此三种材料都获得了很小的三线态与单线态之间的能级差(ΔEST<0.1 eV)和显著的TADF特性。更重要的是,这三种材料与常见的TADF材料不同,它们几乎没有分子内电荷转换(intra-CT)效应,但都具有显著的分子间电荷转换(inter-CT)效应。由于这种强的inter-CT效应,三种TADF材料的荧光光谱在非掺杂薄膜中均显示出长波发射(580~652 nm),并且与溶液中的发射波长(552~574 nm)相比表现出显著的红移。基于这三种TADF材料的发光器件均表现出了较好的电致发光性能,其中,基于AQOPCZ的OLED展现出了最好的器件性能,其最大外量子效率(EQEmax)为6.07%,最大亮度为8 320 cd·m-2。本工作为长波TADF材料的设计、合成和研究提供了有益的参考。

溶剂化对有机给、受体分子热激活延迟荧光的影响及调控

具有热激活延迟荧光(Thermally activated delayed fluorescence,TADF)特性的有机给、受体(Donor-acceptor,D-A)分子体系通过反向系间窜越捕获三重态激子,可以将内量子效率的理论上限提高到100%,因而受到极大关注。通常,具有分子内电荷转移特性的D-A体系可以通过构建扭曲的分子构象来减小单、三重态之间的能差ΔES-T,以确保反向系间窜越快速发生。当分子被激发后,若激发态构象中D-A的二面角更接近90°时,ΔES-T会更小,延迟荧光也会增强。然而,快速的溶剂化过程常常会影响激发态构象、分子内电荷转移过程、延迟荧光发射,这使得研究TADF分子发光过程更富有挑战。本文综述了本课题组近期在溶剂化对D-A体系延迟荧光的影响及调控方面所取得的初步进展。结果显示,强极性溶剂会导致非辐射弛豫增加,不利于TADF发射;改变溶剂粘度会影响激发态构象弛豫,从而可以实现对TADF的增强或减弱的调控。这些结果有助于理解溶剂化效应与构象弛豫、TADF之间的关系,为TADF分子的设计与合成提供指导。

三配位Au(I)配合物热激活延迟荧光机理的量子力学/分子力学研究:晶体环境的关键作用

近年来,三配位Au(I)配合物的热激活延迟荧光现象引起了人们的关注.然而,其发光机理尚不清楚.本文采用密度泛函理论、含时密度泛函理论以及量子力学/分子力学方法研究了Au(I)配合物在气相和晶体中的激发态性质.在这两种环境下,S_(1)和T_(1)激发态主要涉及HOMO和LUMO,表现出明显的金属-配体电荷转移和配体内电荷转移特征.HOMO和LUMO的空间分离有助于缩小S_(1)和T_(1)之间的能隙,加速T_(1)到S_(1)的反向系间窜跃.在300K时,反向系间窜跃速率比磷光发射速率快,实现了热激活延迟荧光.但在77 K时,反向系间窜跃通道阻塞,热激活延迟荧光消失,因此低温时实验上只观测到磷光现象.这项工作有助于进一步了解有机金属配合物的热激活延迟荧光发光机理.

基于荧光检测的高通量筛选技术和装备助力细胞工厂构建

微生物工业制造是以微生物细胞工厂为核心,利用低成本、可再生资源为原料,实现高附加值化合物的绿色生产。依赖于“设计-构建-测试-学习”(DBTL)循环的微生物细胞工厂开发过程中“测试”阶段已成为制约合成生物学和代谢工程发展的瓶颈之一。基于微量滴定板(MTP)高通量自动化筛选平台极大降低了高通量筛选过程的劳动强度,流式细胞术和液滴微流控技术的发展大幅度提高了筛选通量。尤其是荧光激活液滴分选(FADS)高通量筛选技术的开发为自动化、高通量和低消耗筛选工作提供了新的解决方案。本文综述了不同高通量筛选技术在合成生物学和代谢工程领域应用的主要进展,重点介绍了近几年荧光激活细胞分选技术(FACS)和FADS在微生物细胞工厂和酶定向进化方面的应用实例,关注了待测分子与荧光信号偶联的常用策略,并简单介绍目前国内外基于液滴微流控技术高通量筛选装备的研发情况。

光激活荧光蛋白及其在植物分子细胞生物学研究中的应用

光激活荧光蛋白是指用特定光照射时,其荧光特性发生显著改变的一类荧光蛋白。借助光激活荧光蛋白的这种特性,可以实现对活细胞、细胞器或胞内分子的时空标记和追踪。该文介绍了目前光激活荧光蛋白的性质,并从多个方面对其应用进行了概括,包括分子标记与动态分析、蛋白质相互作用、细胞器及细胞组分动态研究、细胞追踪以及在光激活定位显微镜中的应用等,且对目前光激活荧光蛋白在植物分子细胞生物学中的应用进行了详细介绍。

基于三苯胺/二苯砜的热激活延迟荧光材料

通过Suzuki反应合成了三种基于三苯胺/二苯砜的热激活延迟荧光(TADF)材料(1–3),采用紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱、时间分辨荧光发射光谱、循环伏安(CV)测试、理论计算、热重分析和差示扫描量热法,系统地研究了三种材料的光物理、电化学、延迟荧光性能和热稳定性.材料1–3均为基于分子内电荷转移(ICT)的双极性分子.三种材料在薄膜中的单线态-三线态能级差分别为0.46、0.39和0.29 e V.荧光量子效率和荧光寿命的测试结果表明,三种材料均能发射延迟荧光,其中材料3具有最佳的延迟荧光性能.材料1–3的最高占有分子轨道(HOMO)能级分别为–4.91、–4.89和–4.89 e V.结合UV-Vis吸收光谱中得到的能隙(Eg)值,我们得到材料1–3的最低未占分子轨道(LUMO)能级,分别为–1.74、–1.89和–1.94 e V.热分析的结果表明,材料1–3具有其较高的热分解温度(Td,失重5%时的温度),分别为436、387和310°C.

Eu^(3+)离子激活荧光粉Ca_(1.9)Eu_(0.1)NaMg_(2-x)Zn_x(VO_4)_3(0≤x≤1)的发光性质

采用固相反应法合成了Eu^(3+)离子激活的Ca_(1.9)Eu_(0.1)NaMg_(2-x)Zn_x(VO_4)_3(0≤x≤1),并研究了其发光和热猝灭性能。经粉末X射线衍射确认,反应产物由目标相和微量杂质相EuVO_4构成。在355 nm激发下,样品中均能同时观察到来自[VO_4]_3-基团和Eu^(3+)离子的特征发光。研究结果表明:随着x值的增加,上述两种发光的强度均先增加后降低;而它们的最强激发峰位置由347 nm逐渐地红移至356 nm,Stokes位移也逐渐地减小。这种现象应归因于Zn3d轨道和O2p轨道间很强的轨道杂化效应,这种效应随着x值的增加而逐渐增强。此外,Eu^(3+)离子荧光发射强度最大值对应的x值与自激活荧光的不同。当x=1.0时,两者的相对强度差别最大。经荧光热猝灭测试确认,上述现象是由样品中的自激活荧光表现出比Eu^(3+)离子荧光更严重的荧光热猝灭造成的。因而,在紫外光激发下,样品发出荧光的颜色具有温度敏感性。

采用聚合物基质材料的热激活延迟荧光及其敏化器件

报道了基于热激活延迟荧光材料2,4,5,6-四(9-咔唑基)-间苯二腈(4CzIPN),聚合物聚(9-乙烯基咔唑)(PVK)和小分子材料2,2′-(1,3-苯基)二[5-(4-叔丁基苯基)-1,3,4-噁二唑](OXD-7)为共主体材料的发光器件,器件的外量子效率达到13%;进一步研究4CzIPN敏化5,6,11,12-四苯基并四苯(Rubrene)的器件,外量子效率达到9.2%,为未掺杂4CzIPN器件的5.4倍。通过瞬态光谱测量证实敏化器件的发光机制为F?rster能量转移,并探讨了Rubrene浓度和载流子平衡对器件发光特性的影响,推测Rubrene自聚集是限制敏化器件效率的内在原因。

单层热激活延迟荧光有机发光器件及其激子分布特性

单层结构对简化有机电致发光器件(OLED)的制备工艺及降低其制造成本具有重要意义。本文采用非掺杂热激活延迟荧光(TADF)发光层,结合C_(60)(2 nm)/MoO_(3)(3 nm)/C_(60)(2 nm)修饰的ITO阳极及4,7-二苯基-1,10-菲啰啉(Bphen,3 nm)修饰的Ag阴极,制备了单层TADF器件(TADF-OLED)。该单层TADF-OLED具有良好的空穴和电子注入能力,开启电压为3 V,最大电流、功率及外量子效率分别可达到37.7 cd/A、47.4 lm/W和13.24%。然后,我们利用“探针法”研究了该单层TADF-OLED的激子分布情况,发现大部分激子在发光层靠近阳极侧形成。最后,我们利用经典电磁学理论对器件的光取出效率进行模拟分析,证实了这种激子分布特性有助于实现较高的光取出效率,进而改善器件的外量子效率。