荧光漂白恢复、荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点

荧光漂白恢复(FRAP)、荧光共振能量转移(FRET)和荧光相关光谱(FCS)是三种以荧光为基础的检测技术,常用来研究分子间相互作用。对三种技术的特点做以比较和讨论。

荧光相关光谱的原理、技术及应用

本文介绍荧光相关光谱的原理、技术以及其在生命科学和化学领域内的应用。

荧光相关光谱分析仪的硬件采集系统设计

对荧光相关光谱技术(FCS)以及相关测量进行介绍。系统解决了"窄信号"采集的问题,实现了上位机与下位机的高速数据传输。并且结合具体应用背景,开发出对应的上位机软件。

应用荧光相关光谱测定L-色氨酸的浓度

应用FLS920P型荧光光谱仪对L-色氨酸溶液进行三维荧光光谱检测,从中发现:L-色氨酸的特征荧光峰位于270/350nm。设定发射波长为350nm,测量激发谱。由测量结果发现在250~260nm区间,谱线斜率较大、线性度好。因此选取250,255和260nm三个激发波长,在每个激发波长下分别测量相应的荧光发射谱。基于三条不同的荧光发射谱,构建以激发波长为外扰变量的自相关光谱;而以浓度为外扰变量的自相关光谱,是以超纯水在不同激发波长的平均谱作为参考光谱,通过参考光谱与样本平均谱的相关计算得到。在此基础上,将相关光谱数据分别与偏最小二乘回归(PLSR)和径向基神经网络(RBFNN)相结合,建立溶液中L-色氨酸含量的预测模型,研究结果表明:采用浓度为外扰变量构造的荧光相关光谱信噪比较高,建模的预测效果要好;而在外扰变量相同时,基于径向基神经网络建立的预测模型比基于偏最小二乘回归建立的预测模型对溶液中L-色氨酸浓度的预测结果更为准确。其中,以浓度为外扰变量时的径向基神经网络预测模型准确度最高,该模型的预测相关系数为99.91%,预测均方根误差为0.033μg·mL^(-1)。研究结果表明,使用该方法能够对溶液中的物质含量进行准确测定,可为食品安全监管提供帮助。

激光共聚焦扫描成像-荧光相关光谱系统的研究及其应用

本文中我们采用激光共聚焦光学构型和振镜扫描模式,通过优化光学构型和元件配置,构建了一套细胞扫描成像-荧光互相关光谱联用系统。该系统具有高分辨活细胞成像和原位分析功能,能够用于活细胞内生物分子浓度的测定以及生物分子扩散行为、酶的活性和分子相互作用的研究。进而,我们构建了稳定表达p53-EGFP和MDMX-m Cherry的细胞模型,将构建的系统用于活细胞核内p53-MDMX蛋白相互作用的研究。

最大熵法分析寡聚核苷酸链内碰撞的荧光相关光谱(英文)

准确地由荧光相关光谱(FCS)的实验数据提取动力学信息一直是一个挑战.本文对比了三种主要的方法:依赖于模型的多指数函数法,经验的拓展指数函数法和不依赖于模型的最大熵法.多指数函数法的物理意义直接但在复杂体系中难以应用和解释.拓展指数函数法简单易行但其物理意义含混不清.最大熵法不依赖于具体的物理模型但拟合结果对实验噪音很敏感.经研究我们发现一个好的选择是将最大熵法和多指数函数法结合在一起使用.对寡聚核苷酸链内碰撞荧光相关光谱的研究发现,在单链DNA中可以形成碱基对时,有两个并行的链内碰撞反应.以前的拓展指数函数法分析则不能提供这样的信息.我们建议在荧光相关光谱研究中审慎地使用最大熵法.

人体血清中原卟啉荧光相关光谱分析方法研究

原卟啉(PPIX)是血清中内源性荧光物质之一,目前研究表明癌症病人血液中的原卟啉含量高于正常人水平。因此,测定血清样品中的PPIX含量对于癌症病人的早期诊断具有重要的意义。本文中以超灵敏的荧光相关光谱(FCS)单分子检测技术,建立了直接测定血清中PPIX的含量的新方法。通过对100例正常人血清样本和12例疑似癌症病人血清样本(甲胎蛋白AFP含量异常)中PPIX的FCS数据分析,发现相对于检测PPIX-HSA的单个分子荧光强度和总荧光强度,PPIX-HSA在病人血清中的浓度与正常人血清有着极显著差异。FCS方法具有样品需求量少、分析时间短、可实现自动化操作等优点,有望成为癌症临床诊断的一种新方法。

荧光相关光谱法直接测定溶液中金纳米粒子浓度

本文利用金纳米粒子(AuNPs)的荧光特性,采用荧光相关光谱建立了溶液中AuNPs摩尔浓度测定的新方法。实验优化了激光强度和采样时间等实验条件。在优化的条件下检测,微区内的粒子数与AuNPs浓度具有良好线性关系。该方法成功地用于合成的溶液中AuNPs摩尔浓度的测定,测定结果与传统的方法基本一致。该方法与现有方法相比,具有灵敏高、快速简便、样品和试剂用量少、样品无损等特点,不仅可以用于溶液中AuNPs浓度的测定,而且有望应用于活细胞内AuNPs的实时原位分析。

荧光相关光谱在生物化学领域中的应用

荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)是一种通过监测荧光涨落从而获得单分子水平的分子扩散行为信息的技术。FCS高灵敏度的优点使得它已发展成为一种可以在活体外与活体内检测分子浓度、扩散系数、结合和解离常数等参数的有力工具。荧光互相关光谱(fluorescence cross-correlation spectroscopy,FCCS)是FCS技术的进一步发展,其大大扩展了FCS技术的应用范围。本文介绍了FCS及其衍生技术的原理及其在生物化学领域的应用。

荧光相关光谱(FCS)在生物活细胞中的应用

除了传统的分子浓度和扩散时间的测量荧光相关光谱(FCS),还可测量分子动力学或化学反应的动力参数.但是由于分子相互作用网络的复杂性,FCS在生物活细胞中的应用还有许多问题和困难需要解决.探讨了FCS在生物活体中分子相互作用网络、细胞膜、膜表面受体、细胞内结构分析以及胞内动力学研究等方面的应用.

CorTector^(TM) SX100:一款桌面式荧光相关光谱仪的原理和应用

荧光相关光谱检测技术具有超灵敏(单分子)、快速(数秒至数分钟)和多功能(检测分子浓度、大小和相互作用)等技术优点,且无需反应物分离,因此有潜力成为一种新型均相、高敏荧光免疫检测技术,适用于在溶液中或单个活细胞内检测生物分子特性.本文首先介绍荧光相关光谱检测技术的原理和研究进展,然后结合项目团队自主研发的目前全球唯一一款可靠、易使用的桌面式荧光相关光谱仪,进一步探讨荧光相关光谱检测技术的具体实现和潜在应用.

荧光相关光谱技术的研究进展

荧光相关光谱技术(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)将单分子荧光探测技术与统计光谱方法相结合,通过共聚焦荧光测量光学设计与单光子计数方法,测量微小探测体积内由于荧光分子运动所产生的荧光信号涨落,进而对此涨落信号进行关联函数分析,获得分析扩散运动速率、探测空间内平均分子数等重要参数,是研究生物学和生物化学的重要手段.与其他荧光成像和生物物理方法相比,FCS具有高分辨率和高灵敏度等优势,已成为用于量化分子动力学的强大技术,广泛应用于生物医学、生物物理学和化学等领域.本文首先介绍了单点FCS和荧光交叉相关光谱(fluorescence cross-correlation spectroscopy,FCCS)的基本原理,并对FCS和FCCS的实施提供了建议;然后介绍了扫描FCS和图像相关光谱(image correlation spectroscopy,ICS)的基本原理与方法,并对其不同的衍生技术进行了讨论;最后介绍了FCS在膜蛋白、DNA染色体、蛋白质和核酸、酶和多细胞生物及组织中的应用.我们相信,随着技术的发展,FCS有望为生物学研究提供更加准确、细致的信息,并推动人类对复杂生命现象的认知.

荧光三元相关光谱仪器中三元相关器的研制及应用

荧光三元相关光谱是原位研究多组分分子相互作用的一种新方法。三元相关器是荧光三元相关光谱仪器的核心计算单元。目前,我们尚未发现商品化三元相关器。本论文基于单光子计数器采集的光子信号序列的稀疏特性,提出了一种时间-光子模式相关算法,将其与传统多采样间隔时间相关算法相结合开发了改进的多采样间隔时间三元相关算法;进一步结合GPU并行加速,构建了三元相关器,显著加快了荧光三元相关光谱的运算速度;并将三元相关器成功地用于四色荧光微球和多色标记DNA荧光三元相关光谱分析。

二维相关荧光光谱技术

从发展历史、计算方程、一般规则和特有性质等方面系统地介绍了近年来在二维相关荧光光谱技术方面的方法探索和应用进展。以不同的外扰方式,如浓度、激发波长、猝灭以及其他外扰方式如pH等分类,举例阐述了二维荧光相关光谱的可操作性及其应用,并与普通一维荧光光谱比较,说明了二维荧光相关光谱技术的优势。

基于二维相关荧光光谱鉴别葡萄酒中合成色素胭脂红的研究

为实现葡萄酒中违法添加外源人工合成色素的检测,对纯葡萄酒和掺入胭脂红色素葡萄酒的荧光谱图进行研究。由于光谱谱图重叠覆盖的影响,在掺入胭脂红色素葡萄酒的荧光光谱图上,无法直接依据色素特征荧光峰进行外源人工合成色素的识别。以浓度为外扰,配制浓度范围为0.1μg/m L^10μg/m L的系列掺入胭脂红的葡萄酒样品,采用二维相关光谱技术对对应浓度测得的荧光光谱进行研究,结果表明:采用以浓度为外扰的二维相关荧光光谱方法能够有效分离掺入胭脂红色素的特征峰,实现葡萄酒中外源胭脂红合成色素的识别。

单波长荧光交叉相关光谱单分子检测系统

基于激光共焦构型建立了一套单波长荧光交叉相关光谱检测系统,并对检测系统进行了优化,阐述了荧光交叉(相关)光谱基本理论.以荧光量子点和有机染料为标记探针,以人免疫球蛋白与羊抗人免疫球蛋白的结合反应为研究对象,利用该系统成功地实现了在单分子水平上对免疫结合产物的分子数、浓度、特征扩散时间和动力学半径等参数的表征.

基于荧光光谱的茶汤中拟除虫菊酯类农药的智能识别

基于三维荧光光谱和二维荧光相关光谱,对茶汤中两种拟除虫菊酯农药进行了识别。利用图像局部极值算法,分别提取出三维荧光光谱图和二维相关光谱图中的峰、谷位置信息,然后进行峰位匹配实现茶汤中农药组分的智能识别。结果表明,三维荧光光谱图受到荧光峰重叠的影响,不能对氰戊菊酯进行有效匹配。而利用二维相关光谱不仅可以克服这一缺点,而且不受混合物中农药组分浓度的影响。基于二维荧光相关光谱,对实际茶汤中氰戊菊酯和顺式氯氰菊酯进行了识别,识别率分别为80%和83%。

基于二维相关荧光谱定量分析水中的PAHs

针对水环境中多环芳烃(PAHs)污染现状,提出并建立一种基于二维相关荧光谱水体中PAHs的检测方法。以菲和荧蒽为研究对象,配置36个蒽荧蒽混合水溶液样品(蒽和荧蒽的浓度范围均为1×10-4~1×10^(-6) g·L^(-1)),采集了所有样品的三维荧光光谱。以激发波长为外扰,构建同步二维相关荧光谱。在此基础上建立了定量分析水溶液中蒽和荧蒽浓度的多维偏最小二乘(N-PLS)模型,对蒽和荧蒽的预测均方根误差(RMSEP)分别为5.48×10^(-6) g·L^(-1)和6.25×10^(-6) g·L^(-1)。为了比较,基于常用的三维荧光谱建立了NPLS模型,对蒽和荧蒽的RMSEP分别为5.92×10^(-6) g·L^(-1)和7.33×10^(-6) g·L^(-1)。研究结果表明:基于二维相关荧光谱检测环境中PAHs污染物是可行。

基于FPGA的实时荧光相关光谱三元数字相关器的设计与实现

面向荧光相关光谱分析应用,研究基于现场可编程逻辑门阵列(FPGA)技术的多通道实时荧光相关光谱三元数字相关器的实现方法。硬件结构基于寄存器级硬件描述语言设计和实现。基于荧光相关光谱的特点,采用多采样时间相关和模块“分时复用”的设计思想,有效减少了运算量和硬件资源消耗。将二元相关的分时复用思想扩展至三元相关,提出了适用于三元相关的分时复用方法,实现了基于FPGA的实时计算的三元数字相关器。通过对称归一化的计算方法保证了相关函数的计算精度。光子相关器基于Xilinx Zynq-7100 FPGA芯片实现,实现了三路自相关、三路互相关和一路三元相关的实时计算。实验验证了相关计算的准确性,最高时间分辨率可达40 ns,动态范围为1.57×10^(7)。

荧光共振能量转移技术在生命科学中的应用及研究进展

荧光共振能量转移(FRET)是指两个荧光基团间能量通过偶极-偶极耦合作用以非辐射方式从供体传递给受体的现象,可被用于测定分子间的距离。FRET荧光探针主要有荧光蛋白、有机荧光染料、镧系染料和量子点,近年来有许多新的应用;测试方法上与时间分辨、单分子检测、荧光寿命和荧光相关光谱等技术联用取得了更好的成效。