一种检测蛋白酶活性的荧光素酶报告基因系统的构建及应用

为建立一种检测蛋白酶活性的方法,本研究将IL-1β前体基因和荧光素酶基因融合,克隆至p CAGGS真核载体,构建了基于荧光素酶的报告基因系统(iGLuc),同时构建GLuc真核表达质粒作为对照。以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶为检测对象,利用该报告基因系统对病毒蛋白酶活性进行检测,将iGLuc中蛋白酶酶切位点(FVCDAN)相对应的基因序列替换为Kpn I酶切位点,构建重组质粒Kpn I-iGLuc,然后分别将PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶切割位点对应的核酸序列插入至报告基因Kpn I-iGLuc中的Kpn I位点,构建重组质粒nsp4-iGLuc和S273R-i GLuc。分别将报告基因质粒(iGLuc、GLuc、Kpn I-i GLuc、nsp4-i GLuc和S273R-iGLuc)与不同剂量的相应蛋白酶真核表达质粒共转染HEK293T细胞,24 h后检测上清中荧光素酶GLuc的活性。结果显示,转染i GLuc、nsp4-iGLuc或S273R-iGLuc质粒的上清中荧光信号随着相应蛋白酶的剂量增加而升高,呈现剂量依赖性,而缺失蛋白酶切位点的对照质粒无该现象,表明构建的荧光素酶报告基因能够特异性地检测细胞蛋白酶和病毒蛋白酶的活性。本研究首次建立了一种检测蛋白酶活性的方法,并以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶验证了该方法的应用价值,为后续开展高通量化筛选抗PRRSV、ASFV等药物的研究奠定了基础。

48孔板荧光素酶报告基因实验边缘效应

为了研究48孔板荧光素酶报告基因实验边缘效应以及寻找可能消除边缘效应的方法措施。本研究用常规方法培养人胚肾细胞HEK293,运用脂质体转染试剂Lipofectamin 2000将荧光素酶报告基因质粒p GL4.13Z和内参质粒p RL-TK共转染入48孔板中的HEK 293细胞。转染后24 h用荧光素酶报告基因实验检测试剂测量细胞的荧光素酶活性,比较角落孔、边缘孔以及中间孔测定值的差异,以及内参照海肾荧光素酶活性校准后的差值,并通过细胞计数来观察此种差异是否与细胞数目和转染效率相关。在此基础上,寻找可能减小边缘效应的方法,如细胞种植入48孔板后将其室温静置、48孔板重叠、放弃使用边缘孔。运用48孔细胞培养板进行荧光素酶报告基因实验存在边缘效应,边缘孔与中间孔的荧光素酶活性测定值有显著的差异且有统计学意义（p〈0.05）,而边缘效应的产生与细胞数目和转染效率无明显关联。细胞种植入48孔板后将其室温静置1.5 h、或重叠一个48孔板以及空置边缘孔都不能减弱边缘效应;然而将48孔板四周边缘孔填充液体（磷酸盐缓冲液（1＊PBS）,水）,可以削弱边缘效应。用48孔细胞培养板进行荧光素酶报告基因实验会产生边缘效应,并可能造成对实验结果的误判;48孔板四周边缘孔填充相应的液体可以削弱边缘效应。

基于Golden Gate高效构建psiCHECK双荧光素酶报告基因的方法及应用

目的 基于Golden Gate技术构建psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体,并探讨其能否用于RNA干扰(RNA interference, RNAi)药物筛选。方法 通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增CcdB致死基因、氯霉素基因与Golden Gate组装所需的BsmBI酶切位点,将其克隆至psiCHECK-2载体,构建出重组载体psiCHECK-CcdB。利用2种大肠杆菌DB3.1与DH5α对该载体的致死效率进行检测,选用1 387 bp大小的外源片段克隆至psiCHECK-CcdB载体,检测其连接效率,并验证重组载体能否发挥双荧光素酶报告系统功能,监测目的基因的表达变化。结果 菌落PCR以及测序鉴定psiCHECK-CcdB重组质粒构建成功,该质粒可有效致死无法耐受CcdB毒素的大肠杆菌DH5α菌株,在DB3.1菌株中正常生长。采用Golden Gate的方法可将外源片段简单快速克隆至psiCHECKCcdB载体中,连接效率显著提高且低背景克隆。通过测定双荧光素酶表达强度,证实了小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向性结合目的基因可显著下调荧光素酶的表达,成功发挥双荧光素酶报告基因功能。结论 本研究成功构建了psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体,应用Golden Gate组装技术,简化了实验操作流程,降低了实验成本,具备较高的阳性克隆率与多片段一次性组装的潜力,在RNAi药物筛选领域应用前景广阔。

虫荧光素酶报告基因用于二噁英类化学物质的检测

虫萤光素酶报告基因检测二英类化学物质与传统的EROD法比较 ,灵敏度及线性范围均优于EROD法 ,并且检测时间缩短 ,操作简便。

荧光素酶报告基因法测定废气中二噁英类物质

研究二噁英类生物检测法的主要目的是简化二噁英类分析流程,并找出快速检测的结果与HRGC-HRMS(高分辨气相色谱-高分辨质谱)结果之间的换算系数,从而可以利用快速检测的结果和换算系数来推算HRGC-HRMS的结果.介绍了CALUX(荧光素酶报告基因法)分析废气中二噁英类物质的原理,并采用该方法分析了我国27个废气样品,以期找出其测定结果与HRGC-HRMS结果之间的换算系数.结果表明,这2种测试方法数据相关性显著,R2为0.994 8,数据间的换算系数为0.379.试验表明,CALUX法具有很好的推广性,如果再适当增加废气样品的数量,对换算系数进行适当的优化,则所得换算系数可推广.

TNF-α3′-UTR双荧光素酶报告基因系统的构建及丹参酮类药物筛选

目的构建并鉴定p GL3-TNF-α3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,以此基于调控TNF-α转录后水平对丹参酮类成分进行筛选。方法反转录人脐静脉内皮细胞HUVEC的mRNA成c DNA,以之为模板,PCR扩增含TNF-α3'-UTR的DNA片段全长,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p GL3-control上,构建出p GL3-TNF-α3'UTR全长的荧光素酶报告基因载体并进行鉴定。将所构建的p GL3-TNF-α3'UTR与p SVRenilla质粒组成双荧光素酶报告系统共转染至单核巨噬细胞RAW264.7,经脂多糖诱导后利用该双荧光素酶报告基因表达系统判定丹参酮类成分对TNF-α转录后调控是否有影响。结果成功构建p GL3-TNF-α3'UTR荧光素酶报告基因,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致。脂多糖(LPS)可以明显诱导转入p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光强度。丹参酮类成分中隐丹参酮可以明显降低LPS诱导的p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光素酶活性。结论成功构建含TNF-α3'UTR区的双荧光素酶报告基因表达系统,并以此从丹参酮类化合物中筛选出隐丹参酮,可以对TNF-α的转录后水平进行抑制调控。

NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体的构建与鉴定

背景与目的:构建NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。材料与方法:以PCR法从SHEEC食管癌细胞基因组DNA中扩增NGAL基因5’侧翼转录调控区不同长度片段G0-G6(-1431-+84)。PCR产物经pGEM-Teasy转载,再定向亚克隆插入pGL3-Basic。重组子通过特异限制性内切酶切割,琼脂糖电泳予以鉴定。结果:成功构建NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体7个,pGLB-G0-G6。结论:为借助于双荧光素酶报告基因检测系统研究确定NGAL基因5’侧翼转录调控区转录调控元件的分布特点以及转录调控元件与转录调控蛋白之间相互作用的性质提供了基本实验条件。

一种新型双荧光素酶报告基因表达载体的构建

目的:构建一种新型的双荧光素酶报告基因表达载体。方法:设计并扩增海肾荧光素酶基因hRLUC,将其插入到双酶切的含有萤火虫荧光素酶报告基因(Firefly)的载体pGL4.10中,得到pGL4.10-hRLUC;使用lipofectamine3000将pGL4.10和pGL4.10-hRLUC分别转染入HEK293细胞,检测细胞中荧光素酶活性,以未转染细胞作对照。结果:使用PCR方法获得hRLUC表达单元(2 350 bp);双荧光素酶报告基因表达载体pGL4.10-hRLUC经酶切和测序鉴定,插入正确。转染pGL4.10组荧光素酶活性相对值为(220.311±2.082);转染pGL4.10-hRLUC的细胞中荧光素酶活性低于pGL4.10转染细胞,高于未转染细胞(P<0.05)。结论:成功构建了双荧光素酶报告基因(hRLUC和Firefly)表达载体。

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性。方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。结果成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性。结论成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础。

二恶英反应增强子调控的虫荧光素酶报告基因质粒的构建

为加强二恶英类化学物质的快速筛选和半定量检测 ,我们构建了一在二恶英反应增强子调控下的虫荧光素酶报告基因质粒。二恶英反应增强子来源于pHAV质粒 ,MMTV启动子来源于 pCatM质粒 ,上述两者连接后与虫荧光素酶载体连接 ,转染人HepG2肝癌细胞 ,以 2 ,3,7,8 四氯代二苯并二恶英 (TCDD)诱导报告基因表达后检测虫荧光素酶活性。结果表明该质粒中虫荧光素酶的表达受二恶英反应增强子的调控 ,且在一定浓度范围内虫荧光素酶的活性与TCDD的量呈线性关系。研究显示该质粒转染的细胞株有望用于快速筛选及半定量检测二恶英 ,可进一步加强研究作为二恶英类化学物质监测的常规方法。

小鼠HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及功能鉴定

利用PCR技术扩增小鼠高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因启动子序列,构建小鼠HMGB1启动子荧光素酶报告基因pGL3-basic-HMGB1.经PCR、酶切及测序鉴定后,用脂质体法将pGL3-basic-HMGB1转入巨噬细胞264.7中,并应用萤光素酶测定系统检测其活性.检测结果显示pGL3-basic-HMGB1具有启动子活性.小鼠HMGB1启动子荧光素酶报告基因pGL3-basic-HMGB1的成功构建,为进一步研究HMGB1提供基本材料.

双荧光素酶报告基因系统的应用研究进展

双报告基因即在一个信号系统内同时表达,但独立测量的两个荧光酶的报告基因。在双报告基因系统中,一个报告基因活性的改变,与基因表达的特定实验条件相关,而另个报告基因的组成型活性则提供内对照,使实验值正态化。目前很多实验都采用了荧光素酶报告基因(Luc),但从检测速度、灵敏度和线性范围来考虑,双荧光素酶即萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Renilla luciferase)的组合,可以较好地体现检测结果的精确性。本文以萤火虫双荧光素酶报告基因系统为重点,综述了该报告系统的特点、应用和近年来的研究进展。

人白介素-15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的克隆人白介素-15(IL-15)基因系列启动子,构建IL-15基因启动子荧光素酶报告基因载体。方法通过PCR方法从HaCaT细胞基因组DNA中获得IL-15基因编码序列5′上游七段逐步缺失的IL-15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因pGL3-Basic载体上,构建IL-15基因系列启动子报告基因载体;用脂质体转染法将含最长启动子序列的报告基因载体转染至HaCaT细胞,并设置空白对照组和LPS组分别处理;24 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果经PCR方法扩增出七段逐步缺失的IL-15基因启动子片段,PCR及双酶切鉴定各重组体构建正确;瞬时转染HaCaT细胞后经报告基因检测得知所克隆最长序列具有启动子活性。结论成功构建了IL-15系列启动子报告基因载体,并在HaCaT细胞中初步活性分析得知所克隆IL-15基因调控系列内包含启动子核心区域,为进一步研究IL-15表达调控机制奠定了实验基础。

荧光素酶报告基因在干细胞体内示踪研究中的应用

活体生物发光技术是一种新兴的成像技术．是利用荧光素酶在活体内的可检测性、可视性和持续表达性，以暗视野CCDm（Charge—coupleddevice，电荷偶联设备）相机系统为基础的一种成像技术，它能有效地对报告基因标记的实验对象进行实时、原位的观测，可在完整的体内环境中快速获得时间、空间的信息。生物发光技术具有非侵入性，可以减少实验动物的数量，减少动物个体差异对实验数据的影响.

B7-H1启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测

目的构建含B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体,转染肝癌Hep G2细胞进行活性检测。方法 PCR扩增B7-H1启动子上游区域基因片段,并插入到含有荧光素酶报告基因的载体PGL3-Basic中构建重组子,经双酶切和测序鉴定后,将重组子转染Hep G2细胞,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶表达活性。结果成功地构建了6种不同长度的PGL3-B7-H1-Luc荧光素酶表达质粒,分别命名为P88、P175、P203、P398、P723和P960。瞬时转染Hep G2后经报告基因检测,P175、P203、P398、P723和P960所含5段启动子均具有转录活性,IFN-γ作用后启动子活性明显增强,而P88转染组IFN-γ作用后,荧光素酶活性无显著变化。结论成功构建了B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体。

STAT3荧光素酶报告基因检测系统的构建及其检测STAT3活化能力的研究

目的构建STAT3荧光素酶报告基因检测系统并检测STAT3活化能力,为筛选STAT3活性调控相关药物提供实验基础。方法基因合成STAT3反应元件序列,退火形成含酶切位点的双链DNA,内切酶XhoⅠ和HindⅢ双酶切报告基因载体p GL6-TA,T4 DNA连接酶将STAT3反应元件插入p GL6-TA载体多克隆位点,将该载体转染He La细胞,G418筛选STAT3荧光素酶报告基因稳定表达的单克隆He La细胞株。5,10,20 ng/ml不同浓度激动剂IL-6和20,40,80μmol/L抑制剂S3I-201刺激单克隆He La-STAT3-Luc细胞,检测荧光素酶对应的发光值验证STAT3荧光素酶报告基因检测系统的检测能力。结果测序和比对结果显示,STAT3荧光素酶报告基因系统p GL6-STAT3-Luc中STAT3反应元件序列正确;G418成功筛选出稳定表达STAT3荧光素酶报告基因的单克隆He La细胞株;5,10和20 ng/ml浓度IL-6可刺激He La-STAT3-Luc细胞中荧光素酶的活性显著升高(P<0.001),且分别升高5.4,10.3和20.0倍;不同时间点检测1 ng/ml和5 ng/ml浓度IL-6刺激He La-STAT3-Luc细胞,其荧光素酶的活性呈现线性增长趋势;40μmol/L和80μmol/L浓度的抑制剂S3I-201与10 ng/ml浓度IL-6共刺激He La-STAT3-Luc细胞,其荧光素酶的活性显著降低(P<0.001),STAT3活化的抑制率分别为18.9%和43.7%。结论成功构建STAT3荧光素酶报告基因检测系统,该系统具有有效检测STAT3活化水平的能力。

Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测

目的:扩增Id1启动子基因,构建Id1启动子的报告基因载体.方法:通过PCR及双酶切方法,从HepG2细胞基因组DNA中获得Id1基因编码序列上游包含不同长度碱基的两段Id1启动子序列;分别克隆到报告基因pGL3-enhancer载体上,构建包含两段不同长度Id1启动子的报告基因载体;用脂质体转染法将两报告基因载体分别转染至肝癌HepG2细胞系;采用双荧光素酶报告基因系统评估Id1启动子活性.结果:经PCR方法扩增出大小分别为1096bp和266bp的两段不同长度的Id1启动子片段,序列测定其编码序列及读框正确,酶切鉴定亚克隆序列正确.瞬时转染HepG2后经报告基因检测,两段启动子均具有转录活性.结论:成功构建了Id1启动子的报告基因载体,为进一步研究Id1启动子和肝癌的关系奠定了实验基础.

双荧光素酶报告基因系统检测CYP3A4* 1G增强CYP3A4表达的调控作用

目的:探讨CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达的负调控作用。方法:设计合成包含CYP3A4*1G G或A等位基因的一系列基因片段(外显子10与内含子10交界处287和181 bp),构建CYP3A4*1G正向位于CYP3A4启动子上游的荧光素酶报告基因载体,与内参质粒pRL-TK共转染Hep G2细胞,通过双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果:与CYP3A4启动子相比较,G与A等位基因在287 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达(F=795.575,P<0.001),且G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。与CYP3A4启动子相比较,G与A等位基因在181 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达(F=23.218,P<0.001),而G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在CYP3A4内含子10与外显子10交界处CYP3A4*1G存在与CYP3A4*1G变异无关的CYP3A4启动子的抑制元件,该抑制元件对CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达起负调控作用。

AP2α荧光素酶报告基因的构建及在BMPs诱导成骨分化研究中的应用

目的构建一种携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体,并应用于筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。方法设计4个串联的AP2α效应元件(AP2α-RE),将其克隆至经Bam HⅠ和MluⅠ双酶切的pBGLuc荧光素酶报告基因质粒构建pBGLuc-AP2α-RE载体。重组腺病毒Ad-AP2α及其两种显性负性突变体Ad-dnAP2α感染小鼠间充质干细胞C3H10,通过Realtime PCR、Western blot检测AP2α的mRNA和蛋白水平表达,EMSA检测AP2α的DNA结合能力。pBGLuc-AP2α-RE转染C3H10细胞,荧光素酶报告基因检测同上各组AP2α的转录活性。Ad-BMPs感染pBGLuc-AP2α-RE转染的C3H10细胞,荧光素酶报告基因筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。结果经PCR、酶切及测序鉴定,证实AP2α-RE正确克隆至pBGLuc-AP2α-RE荧光素酶报告基因载体,Ad-AP2α感染能显著提高AP2α的表达及结合DNA的能力。显性负性突变体可以表达各自的突变体,EMSA结果显示Ad-dnAP2α-△bHLH组能显著抑制AP2α结合DNA的能力,而Ad-dnAP2α-△TAD组结合的DNA探针强于对照组。荧光素酶报告基因提示AP2α过表达组能促进AP2α转录活性,而两种显性负性突变体均能抑制AP2α转录活性。重组腺病毒BMPs感染组的AP2α转录活性均有增高,其中BMP9最为显著。结论成功构建携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体用于检测AP2α的转录活性,并初步发现BMP9对AP2α的转录活性有明显的促进作用。

双荧光素酶报告基因系统验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的调控作用

目的验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的靶向调控作用。方法利用PCR方法,根据目的基因ARHGAP29的3′非编码区(3′untranslated region,3′UTR)序列信息设计扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板,扩增ARHGAP29基因的野生型3′UTR片段(ARHGAP 29-WT 3′UTR)及突变型3′UTR片段(ARHGAP29-MUT 3′UTR),并将其分别克隆到双荧光素酶报告pmiR-RB-Report载体中,构建双荧光素酶基因报告载体,即野生型载体ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report和突变型载体ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report。将hsa-miR-1291 mimic、阴性对照(non-target control,NC组)同野生型载体、突变型载体载体分别共转染于293T细胞中,进一步检测相对荧光值。结果成功构建ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report载体(野生型载体)、ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report载体(突变型载体)。荧光检测结果显示,野生型载体转染hsa-miR-1291 mimic后,其荧光表达较NC组明显下降(0.67±0.04 vs 1.00±0.08,P=0.014);转染hsa-miR-1291 mimic后,突变型载体的荧光表达相对于野生型载体的荧光表达有所上升(1.20±0.05 vs 0.67±0.04,P<0.001)。结论初步证实hsa-miR-1291很可能对ARHGAP 293′UTR上的该位点有靶向调控作用。