酵母双杂交技术构建稀有鮈鲫不同雌激素受体亚型的重组荧光酵母

目前关于环境雌激素(environmental estrogens,EEs)的效应评估大多数是基于人的雌激素受体(estrogen receptor,ER)的离体检测,缺乏EEs对鱼类ER影响的研究。本研究利用酵母双杂交技术构建模式生物稀有鮈鲫不同ER亚型重组荧光双杂交酵母,用以快速检测EEs的雌激素活性并研究不同ER亚型对17β-雌二醇(E 2)敏感度的差异。采用反转录多聚酶链反应法获取稀有鮈鲫ERα、ERβ1和ERβ2的配体结合域(LBD)序列,构建并鉴别诱饵质粒pGBKT7-ERα-LBD、pGBKT7-ERβ1-LBD和pGBKT7-ERβ2-LBD。将诱饵质粒和猎物质粒pGAD424-GRIP1同时转化荧光酵母Y187-Luc,分别构建3株稀有鮈鲫ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1重组荧光双杂交酵母,并考察了E 2、双氢睾酮(DHT)、9-顺维甲酸(9-cis RA)、三碘甲状腺原氨酸(T 3)和孕酮(PG)对荧光素酶的诱导情况。结果显示:ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1重组荧光双杂交酵母能够专一性地被E 2诱导产生荧光素酶,并存在显著的剂量-效应关系,半数效应浓度(EC 50)值分别为1.98×10^-9、1.77×10^-10、和3.52×10^-10 mol·L^-1,对E 2的敏感程度排序为:ERβ1-GRIP1>ERβ2-GRIP1>ERα-GRIP1。研究表明,稀有鮈鲫不同ER亚型对E 2的响应具有差异,3株重组荧光双杂交酵母不仅可以应用于快速识别内分泌干扰物中的类雌激素物质,分析稀有鮈鲫不同ER亚型对EEs的敏感性,解析雌激素污染物对稀有鮈鲫的作用机制,评估鱼类接触EEs的潜在风险,以期为水质保障和污染治理提供重要依据。

基于红色荧光蛋白的酵母双分子荧光互补技术的建立

目的在酵母细胞中建立基于酵母增强型红色荧光蛋白(yEmRFP)的双分子荧光互补技术,用于直观地检测蛋白质相互作用。方法利用分子克隆技术将yEmRFP的N端片段(1~159 aa,RN159)和C端片段(160~236 aa,RC160)分别与转录因子Jun和Fos的碱性亮氨酸拉链结构域(bZIP)—bJun和bFos或其缺失突变体bFosΔZip相融合,构建重组质粒,其中bFosΔZip与bJun不存在相互作用,可作为阴性对照组,将重组质粒转化酵母细胞后,通过营养缺陷培养基筛选转化成功的酵母菌落,利用荧光显微镜和流式细胞仪检测酵母中重组yEmRFP蛋白质的荧光信号,判定该技术是否可用于检测蛋白质相互作用。结果成功构建了RN159和RC160与bJun和bFos或bFosΔZip相融合的重组质粒。酵母表达体系中bJun和bFos的相互作用使yEmRFP重新组装为完整荧光蛋白质,通过荧光显微镜检测到强的红色荧光信号,利用流式细胞仪藻红蛋白(PE)通道计数20000个酵母细胞,其中约有25%酵母细胞具有红色荧光;而阴性对照组未检测到荧光信号,同样在流式细胞仪PE通道中未检测到明显的红色荧光信号,表明此体系无自发激活现象。结论成功开发了基于yEmRFP的酵母双分子荧光互补技术,可用于直观、快速检测和筛选蛋白质相互作用。

人脑中硒蛋白W与鞘脂激活蛋白原相互作用的筛选与验证

硒蛋白W(SelW)是人脑中一种重要的硒蛋白.在缺硒的条件下,SelW在脑中具有优先储备的特性,但其具体机制和在脑中的功能至今尚不清楚.本文以SelW突变体SelW′为"诱饵",采用酵母双杂交系统对人胎脑文库进行筛选,获得与SelW相互作用的蛋白,其中一种为鞘脂激活蛋白原(PSAP).采用荧光共振能量转移技术中的受体漂白和敏化发射两种方法,验证了SelW与PSAP的相互作用.构建表达载体在大肠杆菌中成功表达出SelW′,利用Pull-down技术验证了SelW′与PSAP在细胞外的直接相互作用.采用免疫共沉淀的方法验证了上述两种蛋白在昆明小鼠脑组织中的内源性相互作用.基于SelW和PSAP的已知生物功能,推测SelW可能在脑部发育和神经退行性疾病形成过程中发挥着重要作用.

奇趣珍闻

焰火湖 在北美洲大巴哈马岛上有一个湖,如果夜晚泛舟湖上,会别有一番情趣,随着船桨一起一落划动,会激起点点火花,恰似放出的焰火,偶而被船桨惊动跃出水面的小鱼儿,也是磷光闪闪,非常好看。原来这个湖里生长着一种含有荧光酵母的浮游生物,当它在水中被搅动后,便会放出五光十色的火花来。