用于标记细菌肽聚糖的荧光D-氨基酸的研究进展

肽聚糖(Peptidoglycan,PG)是细菌细胞壁的主要组成成分,对于维持细胞形态、稳定胞体渗透压起重要作用,干扰PG的生物合成会破坏细胞壁结构,导致细菌死亡。细菌中普遍存在L-和D-氨基酸,其中D-氨基酸是PG合成的基本单元。荧光D-氨基酸(Fluorescent D-amino acids,FDAAs)是修饰有荧光基团的D-氨基酸类似物,可被细菌内源性转肽酶识别并整合在PG层中,所携带的荧光基团能够在新合成的PG上释放荧光信号。哺乳动物细胞通常无法识别D-氨基酸,因此,这种荧光标记策略能够在生物体内应用。近年来,FDAAs已成为可视化细菌PG生长和重塑的强大工具。本文围绕目前已开发的FDAAs展开讨论,并介绍这种标记策略在可视化PG增长、细菌抗生素敏感性分析、肠道菌群研究以及细菌感染治疗等的应用,最后对该研究方向的发展前景进行了展望。

IRES序列连接的D-氨基酸氧化酶与绿色荧光蛋白基因导入K562e细胞的表达

内部核糖体进入位点 (IRES)序列来源于脑心肌炎病毒 ,它可翻译一条mRNA上的两个开放读框 ,由其连接的两个基因的表达率相同。本实验应用以IRES序列连接D 氨基酸氧化酶 (DAAO)和绿色荧光 (GFP)基因构建的逆转录病毒载体 ,转染K5 6 2e细胞获得稳定表达GFP的单克隆细胞KDfGC和KDfGd,测定转基因细胞的荧光阳性率以及荧光强度 ,用D 丙氨酸 (D Ala)作用DAAO+细胞 ,并用酚红氧化法测定培养上清H2 O2 。结果表明 ,KDfGC和KDfGd细胞的荧光阳性率分别为 94 .6 4 % ,96 .31% ;2× 10 4细胞的荧光强度分别为 2 0 2U和 174U。GFP荧光强度与H2 O2 的产量间呈指数相关。结论 :IRES序列调控的双基因可同时表达 ,GFP的荧光强度可以间接地反映DAAO基因的表达水平 ,为了解目的基因表达水平高低提供了新的方法。

绿荧光蛋白的荧光强度在D-氨基酸氧化酶活性检测中的应用

目的 :探讨在转基因细胞KDfGc和KDfGd,以内部核糖体进入位点 (IRES)序列连接的绿荧光蛋白 (GFP)的荧光强度为单位 ,衡量D 氨基酸氧化酶 (DAAO)活性的准确性。 方法 :白血病细胞系K5 62e经转染含IRES序列连接的GFP和DAAO基因的逆转录病毒载体pLDfG ,获得稳定表达GFP和DAAO基因的单克隆细胞KDfGc和KDfGd,以流式细胞仪和Lowry测定其荧光阳性率以及平均荧光强度、蛋白量 ,用D 丙氨酸 (D Ala)作用DAAO+细胞 ,并用酚红氧化法测定培养上清H2 O2 。 结果 :KDfGc和KDfGd细胞的荧光阳性率分别为 94 .64%和 96.3 1%。 2× 10 4细胞的平均荧光强度分别为 2 0 2U和 174U。 2× 10 4细胞的蛋白量分别为 13 .17μg和 7.12 μg ,KDfGc、KDfGd细胞每微克蛋白量每小时产生的H2 O2 峰值无差异 ,而以单位荧光来衡量 ,两细胞具有明显差别。 结论 :在含IRES序列的转基因细胞 ,以GFP的平均荧光强度为度量单位 ,比以细胞蛋白量能更准确地反映DAAO的活性。

杯[4]芳烃硼酸与氨基酸配位作用的荧光光谱研究

用荧光光谱滴定法研究了 1 0种杯 [4 ]芳烃硼酸与 4种氨基酸的配位作用 ,根据扩展的 Hilderbrand-Benesi公式 ,计算出配合物的稳定常数和配位反应的 Gibbs自由能变化 .杯 [4 ]芳烃硼酸与 L-丙氨酸的配位能力和配位选择性均较强 ,可以使用杯 [4 ]芳烃硼酸通过荧光光谱法鉴别

绿色荧光蛋白标记的D氨基酸氧化酶基因在人宫颈癌细胞中的表达研究(英文)

为了探讨绿色荧光蛋白标记的红色酵母D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因在人宫颈癌细胞 (HeLa细胞 )中的表达及其功能 ,采用基因重组技术构建了含有CMV启动子和EGFP、DAAO基因开放阅读框 (ORF)的真核表达载体 pIRES DAAO。脂质体法转染HeLa细胞 ,荧光显微镜下观察转染细胞中绿色荧光蛋白的表达 ,流式细胞术分析转染效率并筛选荧光阳性细胞 ,命名为HeLa D。以不同浓度的前药D Ala处理HeLa D细胞 ,MTT法检测细胞存活率。结果显示 ,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在HeLa D细胞中表达 ,流式细胞术成功筛选出HeLa D细胞。前药D Ala能明显杀伤HeLa D细胞。结果表明 ,EGFP可作为报告基因快速筛选DAAO表达载体转染的细胞 ,DAAO/D

鼠李糖乳杆菌Probio-M9的特异性荧光原位杂交探针设计及应用

宿主口服益生菌的定性和局部检测具有重要意义。本研究通过设计株水平特异性荧光原位杂交(FISH)探针来研究鼠李糖乳杆菌在宿主肠道中的定殖。根据鼠李糖乳杆菌Probio-M9和其它相关物种的基因组序列,分别设计了鼠李糖乳杆菌种水平特异性探针(Probe-16S)和鼠李糖杆菌Probio-M9菌株水平特异性探针(Probe-SP)。在使用15株鼠李糖乳杆菌菌株和15株其它益生菌验证这些特异性探针后,通过荧光原位杂交(FISH)验证鼠李糖乳杆菌Probio-M9菌株的特异性探针在体外和体内的适用性。结合荧光D-氨基酸(FDAA)探针,在大鼠的肠道中检测到鼠李糖乳杆菌Probio-M9的活细胞。本研究设计的FISH探针可从肠道菌群中特异性鉴定鼠李糖乳杆菌Probio-M9,该方法可与FDAA探针结合使用,以进一步探索该益生菌菌株在宿主肠道中的定位。

产D-海因酶微生物的筛选及其催化特性

为获得高活性和立体选择性海因酶生产菌株,首先采用氨基酸关环法合成了数种5'-单取代海因衍生物及N-氨甲酰-氨基酸,建立了相关液相色谱检测方法。然后以实验室保藏的野生菌株出发,利用底物诱导的方法筛选到6株具有D-海因酶活性的野生菌,其中荧光假单胞菌产生的D-海因酶具有较好的底物谱,较高的活性和立体选择性。经优化后,其最适产酶温度为30℃,培养时间为12 h,发酵活力达到92.1 U/L。该菌催化D-海因水解的最适反应温度为60℃,pH 8.5。在50 m L体系中,利用0.25 g菌体(干重)可对映选择性水解20 mmol/L对羟基苯海因底物,反应3 h转化率达到98%。

双荧光探针分子两步标记益生菌在肠道原位活性分析研究

有效补充益生菌可有益肠道健康,但是益生菌在肠道原位活性的分析却鲜有报道。本研究通过将异硫氰酸荧光素(FITC)和5(6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯[5(6)-TAMRA-SE]分别与D-赖氨酸进行偶联,获得了两种颜色的荧光D-氨基酸(fluorescent D-amino acids, FDAAs)探针:绿色探针(fluorescein-D-lysine, FDL)和红色探针(TAMRA-D-lysine, TDL),并尝试对嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus, LA)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei, LC)和韦荣球菌(Veillonella atypica, VA) 3种益生菌进行了体外标记。随后将FDAAs应用到小鼠肠道菌群标记,建立方法考察了3种常用益生菌口服定植存活情况。所有动物实验方案经由广州中医药大学动物伦理委员会审查通过。结果表明,合成的两种FDAAs可以无毒且完全对3种益生菌进行体外标记;通过FDAAs两步标记口服益生菌可知,LA存活率较高为92.30%±1.67%, LC和VA的存活率相近,分别为84.13%±4.06%、82.27%±2.43%。本研究可通过快速比较不同益生菌在体内定植存活率的变化,为益生菌在肠道原位定植活性提供理论支撑,同时对临床益生菌合理用药具有指导作用。

肠道微生物菌群成像标记策略及其应用的研究进展

哺乳动物肠道中的微生物菌群在维持宿主生理状态和病理改变中起着非常重要的作用,因此肠道微生物菌群的检测对宿主健康有着重要意义.传统的染色标记方法存在着特异性差、与活菌不相容、受其他影响因素多等问题,因此限制了对肠道微生物形态以及功能方面的深入研究.在众多的成像技术中,荧光成像技术可以显示肠道中共生菌、致病菌以及机会性致病菌的位置,还可以提供有关细菌活力、代谢交换以及宿主和微生物之间的免疫相互作用等信息,且荧光成像检测技术具有无创、对组织损伤小、特异性高、灵敏度高等优点,所以在肠道微生物检测中得到了广泛的应用.荧光成像技术在肠道微生物菌群成像研究方面发挥着重要作用,而性能优越的荧光标记探针是肠道微生物菌群荧光成像的关键因素.本篇综述主要总结了针对不同的肠道菌群而设计的标记策略,主要包括荧光探针和同位素探针,分别就代谢标记、非代谢标记以及代谢产物的特异性标记等方法进行了总结讨论,最后对该研究方向的发展前景进行了展望.