食源性致病菌多重实时荧光PCR检测扩增内标的构建及评价

多重实时荧光PCR在食源性致病菌检测中具有重要的作用,扩增内标(IAC)可用来指示其检测过程中可能出现的假阴性检测结果。采用来源于人类腺病毒基因的一段序列设计IAC,并对其检测特异性、扩增效率以及与目的致病菌基因组DNA的抗干扰扩增能力进行了评估。结果表明,本IAC引物在供试菌株中均没有非特异性扩增结果,扩增效率达99.44%,而且对供试沙门氏菌(Salmonella spp.)、大肠杆菌O157:H7(Escherichiacoli O157:H7)以及单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的多重实时荧光PCR扩增没有任何干扰,在食源性致病菌多重检测技术的建立中具有广泛的应用前景。

含有扩增内标的食品中猪肉和鸡肉成分Taqman探针实时荧光PCR检测方法的建立

【目的】建立含有扩增内标(IAC,Internal amplification control)的用于食品中猪肉和鸡肉成分鉴别的Taqman探针实时荧光PCR检测方法。【方法】分别基于猪的beta actin基因和鸡的transforming growth factor基因设计引物和探针;考察引物和探针的特异性与灵敏度;设计并构建扩增内标,优化体系中扩增内标浓度,建立内标实时荧光PCR体系;使用该检测体系对鲜肉和熟肉来源的DNA模板进行检测评价;应用该体系对市售38份样本进行盲样检测。【结果】含有扩增内标的Taqman探针实时荧光PCR体系能有效地进行食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测,非目标物种在40个循环内均无出现扩增,检出限均为0.5 ng DNA;该体系对鲜肉和熟肉来源的DNA模板检测无显著差异;对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。【结论】该方法准确稳定,可用于食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测。

荧光定量PCR和环介导等温扩增方法检测隐球菌CAP10基因的比较研究

目的建立荧光定量PCR和环介导等温扩增技术(LAMP)检测隐球菌荚膜相关蛋白基因(CAP10)的方法,并比较和评价两种方法的优缺点。方法针对新型隐球菌CAP10基因序列,使用在线软件设计引物,并构建质粒标准品,优化反应条件后用荧光定量PCR和LAMP两种方法检测定量的质粒,分析其敏感性和特异性,并检测临床标本。结果荧光定量PCR检测CAP10质粒的敏感性为6.8×101拷贝,LAMP方法的敏感性为6.8×103拷贝,PCR检测阳性率比LAMP方法高。两种方法特异性好,对脑膜炎奈瑟菌、白色念珠菌、热带念珠菌、黄曲霉、黑曲霉和大肠埃希菌的检测结果均为阴性。结论成功建立了检测CAP10基因的荧光定量PCR方法敏感性和特异性高,但是需要特殊仪器;LAMP方法敏感性较低,但其操作简单,无需特殊仪器和设备,加入核酸染料即能观察结果。两者均适用于新型隐球菌感染的检测。

等位基因特异性引物和TaqMan-MGB探针双抑制野生等位基因扩增的实时荧光定量PCR检测JAK2V617F突变率

本研究建立在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F突变率的荧光定量PCR检测方法并探讨其临床应用价值。在实时荧光定量PCR分析系统中,应用等位基因突变引物和等位基因野生TaqMan-MGB探针共同抑制JAK2V617F野生等位基因扩增,从而特异性地扩增JAK2V617F突变等位基因。通过测定不同JAK2V617F突变率标准品及其循环阈值(Ct值),建立JAK2V617F突变率定量测定方法,并对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率进行检测。结果表明,建立的方法定量检测JAK2V617F突变率的下限为0.1%,检测JAK2V617F突变率的批内、批间平均变异率分别为4.1%和6.1%。对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率检测显示,其中2例为JAK2V617F阳性,突变率分别为0.64%和0.98%。结论:建立的JAK2V617F突变率定量检测方法具有检测灵敏度高和重复性好的特性,适合骨髓增殖性疾病的诊断及疾病进程和疗效监测。本方法检测原理可用于各种单碱基突变率的检测,具有广泛的应用前景。

基于突变阻滞扩增系统的实时荧光PCR技术检测幽门螺杆菌23S rRNA基因突变及其评价

目的探索突变阻滞扩增系统(ARMS)联合实时荧光PCR技术用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因突变的可行性。方法以幽门螺杆菌23S rRNA基因2143位点的两种基因型(野生型为AAA,突变型为AGA)质粒DNA为研究模型,设计ARMS引物同时对实时荧光PCR体系进行优化,对突变阻滞扩增系统联合实时荧光PCR技术的基因分型特异性进行评价。结果在与模板匹配的ARMS引物3'端附近故意引入错配碱基,降低该ARMS引物浓度和镁离子浓度,并采用两步PCR循环的反应程序,使ARMS引物的特异性增强,能够得到清晰的基因分型结果。结论这种基于突变阻滞扩增系统的实时荧光PCR技术,实验设计简便,特异性较好,并有望在此基础上发展成为适合临床应用的突变检测方法。

诺如病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的设计与优化

为设计一种快速、高灵敏度检测诺如病毒(Norovirus,NV)的方法.本文通过检索参考NCBI数据库中收录的国内典型流行的NV毒株BJSMQ的基因序列NC_039476.1,合成了NV的标准重组质粒,根据NV的ORF1基因保守序列设计一组特异性引物和荧光探针;通过正交试验进行程序及试剂反应体系的优化,设计TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明该检测方法具有高灵敏度,最低检测限可达1.2 copies/μL,且在标准重组质粒浓度1.2×10^(5)~1.2×10^(0) copies/μL范围内具有较好的线性关系,其R^(2)=0.9907;该方法特异性强,在病毒的混合重组质粒样液中仅与NV病毒反应;组内和组间的重复性良好,变异系数(CV)值均小于2%;在数字PCR试验中进一步验证了该方法的可行性.本文设计的TaqMan荧光定量PCR检测方法可用于NV毒株的快速准确检测,有望成为NV诊断的有效工具.

结核分枝杆菌实时荧光重组酶介导的等温扩增检测方法的建立与应用

目的由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的结核病(tuberculosis,TB)是全球第二大单一感染致死病因,快速和准确的结核诊断技术有助于对其进行精准防控。方法针对MTB菌株插入序列IS6110高度保守区域设计引物和exo探针并进行筛选,建立了MTB实时(real-time,RT)荧光重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法。通过检测11种非结核分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌评价RT-RAA方法的特异性。以实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,q PCR)方法作为平行对照,应用RT-RAA方法扩增梯度稀释的含有目的基因序列不同拷贝数的重组质粒p EASY-Blunt-IS6110,以评价RT-RAA方法的检测敏感度和重复性。将建立的MTB RT-RAA方法应用于173份肺结核临床样品检测中,同时与q PCR方法进行比较。结果建立的MTB RT-RAA方法在42℃条件下30min内即可完成反应;与非结核分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌均无交叉反应;最低检测模板质粒浓度为116拷贝/2μl,优于q PCR方法(138拷贝/2μl);组内和组间的变异系数均小于8%,重复性好。对于肺结核临床样品的检测,RT-RAA方法检测的阳性率与q PCR方法差异无统计学意义。结论本研究建立的MTB RT-RAA方法是一种方便、灵敏和低成本的MTB快速检测方法,具有良好的应用前景。

核酸扩增荧光检测技术(PCR)检测肺炎支原体(MP)在社区幼儿获得性肺炎辅助诊断中的意义

目的肺炎支原体(MP)核酸扩增荧光检测技术(PCR)测定在社区幼儿获得性肺炎早期辅助诊断的意义。方法收集玉林市二医院住院及社区幼儿门诊就诊患呼吸道感染及发热幼儿310例,通过三种不同方法即PCR法、血清法和培养法测定MP-DNA及MP-Ab,分析这三种方法测定结果的时间性、敏感性、特异性。评价PCR早期测定方法诊断的可行性。结果 PCR早期测定MP方法与血清法比较有统计学意义(P<0.5),与培养法比较无统计学意义(P>0.5)。结论核酸扩增荧光检测技术(PCR)可作为检测社区幼儿肺炎支原体(MP)早期检测诊断指标。

基于锁核酸及等位位点特异性扩增技术的KRAS基因突变检测荧光定量PCR方法研究

基于等位位点特异性扩增的原理,设计锁核酸修饰KRAS基因突变特异性扩增引物,结合封阻探针技术,建立检测KRAS基因突变的荧光定量PCR方法。结果发现,锁核酸修饰的引物及探针可显著提高等位位点特异性扩增技术用于复杂样本中的微量基因突变检测的敏感度,该技术检测KRAS基因突变的敏感性可达0.01%~0.1%。进一步用建立的荧光定量PCR方法检测52例结直肠癌患者血浆标本,并用DNA测序法作为对照,同时用健康人血浆标本建立阴性检测结果判读标准,以初步评价该方法应用于循环DNA中KRAS基因突变检测的可行性。结果发现结直肠癌患者KRAS基因突变主要是G12C、G12A和G12R,而且q PCR法的阳性检出率为46.15%,高于DNA测序法(13.46%),阴性结果与DNA测序法的符合率为100%。此外,结直肠癌患者外周血KRAS基因的突变检出率与文献报道组织标本中的突变检出率及常见突变类型基本相符。上述结果说明该方法检测循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)具有较高的可靠性,可以用于肿瘤患者循环血液中KRAS基因突变的检测。

荧光PCR扩增相关技术

利用荧光PCR(FPCR)技术扩增DNA是现代生物学研究的重要内容。本文以FPCR的发明为起始,以其主要的发展历程为主线,介绍和阐述了实时定量式PCR(QPCR,包括染料法、水解探针法及其衍生种类、划分为分子信标和阴阳探针等类型的杂交探针法、染料熔解曲线法和探针熔解曲线法)与数字式PCR(DPCR,主要是芯片式DPCR,cdPCR和微液滴DPCR,ddPCR)这2代阶段性方法的原理、要点、设计技巧及实际运用等,总结其主要应用领域与局限性,对比不同类型各自的特点,并对未来的发展进行展望。

实时荧光核酸恒温扩增试验对肺炎支原体感染的诊断价值

目的探讨实时荧光核酸恒温扩增试验(simultaneous amplification testing,SAT)对小儿肺炎支原体肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)的早期诊断价值。方法选取382例社区获得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)患儿进行回顾性研究,以血清学抗体检测的结果为参照,分析SAT与间接免疫荧光法诊断MPP感染的价值。结果血清学抗体检测表明共有MPP感染患儿125例,SAT诊断MPP感染的敏感度为88.00%(110/125),特异度为97.67%(251/257),Kappa值为0.873;间接免疫荧光法诊断MPP感染的敏感度为63.20%(79/125),特异度为96.50%(248/257),Kappa值为0.646;SAT的诊断敏感度、特异度和Kappa值均高于间接免疫荧光法。患儿病程及大环内酯类药物治疗史对MPP-SAT的检测阳性率有显著影响(P<0.05),病程<7 d,院外无大环内酯类药物治疗史患儿的SAT检测阳性率高于病程≥7 d,院外有大环内酯类药物治疗史的患儿。多因素logistic回归分析表明,病程及大环内酯类药物治疗史为MPP-SAT检测阳性率的独立影响因素(P<0.05)。结论SAT在MPP感染的早期诊断方面呈现显著优势,可作为MPP感染早期诊断的辅助手段;在病程早期及无大环内酯类药物治疗史的患儿中行MPP-SAT检测阳性率较高。

实时荧光PCR法与环介导等温扩增法检测食品中动物源性成分的比较

目的比较实时荧光PCR(real-time PCR)法及环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测食品中动物源性成分,为食品安全监管部门动物源性成分鉴定提供准确、高效的检测方法。方法采用实时荧光PCR法及LAMP法分别对市售肉及其制品进行牛、猪和鸡源性成分鉴定,并与标签明示的肉源成分比对,以准确性和时效性2个指标对上述2个方法进行评价。结果 Real-time PCR法检出4份样品与标签明示肉源不符,LAMP法检出5份样品与标签明示肉源不符,而16份样品中仅有1份样品2种方法检测结果不同。Real-time PCR法检测用时1.5 h,提取检测用DNA用时1.5 h,总用时3 h;而LAMP法检测用时45 min,提取检测用DNA用时20 min,总用时65 min。结论 LAMP法与Real-time PCR均具有较好的特异性、准确性,但LAMP法耗时短、成本低、操作简单,便于现场快速监督抽检。

生鲜猪肉中含扩增内标的沙门氏菌Real-time PCR检测方法的建立

建立含扩增内标的生鲜猪肉中沙门氏菌Real-time PCR检测方法,以提高检测的准确性。根据沙门氏菌ttrBCA基因设计引物和探针,利用犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因构建和目标基因相同引物的扩增内标,并对退火温度和引物、探针的浓度进行优化,建立含扩增内标的Real-time PCR检测方法,用该方法对人工污染生鲜猪肉样品进行检测。结果显示,该方法对19株非沙门氏菌检测结果均为阴性,对36株沙门氏菌检测结果均为阳性,特异性较好,热学裂解制备DNA模板法检测灵敏度达100 CFU/ml,试剂盒提取DNA制备模板法检测灵敏度达1μl2.66拷贝。在25μl反应体系中加入扩增内标103拷贝不影响目标基因的扩增,该方法能在12 h内对人工污染沙门氏菌的肉样做出检测。该方法不仅可快速检测生鲜猪肉中的沙门氏菌,同时避免了假阳性现象的产生。

荧光定量PCR联合噬菌体生物扩增技术对检验结核性脑膜炎病原菌的价值评估

评估荧光定量PCR联合噬菌体生物扩增技术对检验结核性脑膜炎病原菌的临床价值。选取2013年7月至2017年7月,兰州市西固区人民医院感染科收治的102例的化脓性脑膜炎患者,随机分为对照组50例,研究组52例。经过腰穿之后取样本脑脊液,对照组患者样本应用传统的抗酸染色镜下观察法。研究组患者标本则应用荧光定量PCR联合噬菌体生物扩增技术进行分析。观察两组研究对象的病原菌阳性检出情况。对照组患者的结核分支杆菌检出阳性率为22.00%。研究组的结核分支杆菌检出阳性率为53.85%。研究组的阳性检出率明显高于对照组(P<0.05,χ2=10.9467),差异有统计学意义。证明应用荧光定量PCR联合噬菌体生物扩增技术对检验结核性脑膜炎病原菌的检出率更高。应用荧光定量PCR联合噬菌体生物扩增技术检验结核性脑膜炎病原菌更佳敏感,操作简单易行,且噬菌斑培养周期极短。可在第一时间内给出较为准确的诊断,效果肯定,值得临床检验工作中推广应用。

STR基因座荧光标记复合扩增检测及其法医学应用

目的建立荧光标记复合扩增检测4个STR基因座的方法,应用于法医学亲权鉴定与个人识别。方法用6-FAM标记D3S1754引物,HEX标记D4S2366和D12S375引物,TMR标记D1S549引物,PCR复合扩增,310基因分析仪电泳自动收集电泳结果数据,GeneScanAnalysisSoftware3.7NT计算扩增产物片段相对大小,Genotyper誖3.7NT软件进行样本基因型分型。将该方法应用于法医学亲权鉴定与个人识别。结果建立了荧光标记复合扩增检测4个STR基因座基因型的方法,具有良好的稳定性和较好的灵敏度,分型结果准确。结论研究建立的方法操作简便,分型结果稳定可靠,可用于遗传多态性研究和法医学亲权鉴定与个人识别。

论PCR扩增试验的动力学数学模型

PCR技术已日趋成熟，但因为影响因素较多、反应过程比较复杂，直到目前PCR技术已创立近20年，尚未能给出较好的描述PCR反应的数学方法。我们根据它的基本原理提出了能够描述其反应过程的动力学方程，当使用产物重量来描述时可以使用：Wamp=[Ntarg×(1+P)^n1+0．5×Cenz×U×P×Ceactiv×(n-n1)-Ntarg×(1+n×p)]×Cu×M描述，当使用荧光信号来描述时可以使用：Famp=[Ntarg×(1+P)^n1+0．5×Cenz×U×P×Ceactiv×(n-n1)-Ntarg×(1+np)]×Fc描述，这一模型准确地描述了PCR反应的产物积累规律。建立的PCR反应的动力学数学模型可以描述PCR反应的全过程。用动力学数学模型预测的PE7700仪器的G值与仪器的实际数值一致。动力学数学模型配合适当的监测设备可以构成自动化的PCR定量仪器。各实验室可根据各自的实验条件，由模型估算PCR产物数量，为PCR后产物继续处理提供较准确的数量信息。本模型阐明了PCR反应为什么会在多次循环后必然由指数扩增转变为线性扩增的分子基础，为精确定量PCR技术的建立奠定了理论基础。

经典猪瘟荧光PCR检测方法的建立与应用

猪瘟(CSF)已被世界卫生组织确定为A类传染病,为减少猪瘟病毒(CSFV)带来的经济损失,新的有效的诊断技术的开发成为关键。根据CSFV的Zaozhuang-1毒株的5'UTR基因保守区域设计出特异性引物,建立了一种猪瘟病毒荧光PCR快速检测方法。结果表明,该方法在62℃条件下扩增40个循环,灵敏度最高,最低可检测限度为10拷贝/μL;且特异性良好,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)均无特异性扩增。对临床样本进行检测,结果显示,荧光定量PCR检测结果合格率为100%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性良好、符合率高,适用于经典猪瘟的快速检测。

山羊绒和绵羊毛混合物荧光PCR法测试研究

根据GB/T 36433—2018《纺织品山羊绒和绵羊毛的混合物DNA定量分析荧光PCR法》标准,通过试验计算得出羊绒和羊毛的扩增效率分别为95.26%和98.60%,并以此对方法中用到的引物、探针和扩增条件等进行进一步验证。此外,结合固相萃取技术,探究常规不过柱法、常规过柱法和试剂盒法3种不同前处理方法对羊绒和羊毛混合物样品测试结果的影响。结果表明:常规不过柱法有局限性,仅适用于颜色较浅的样品;而常规过柱法和试剂盒法在测试颜色较深的样品方面有一定的优势,在定性和定量方面结果比较一致;这3种方法可以满足试验者的不同需求,进一步提高试验效率。