多重荧光PCR方法与血清凝集方法对沙门氏菌分型鉴定的结果对比

目的 探讨多重荧光PCR方法和血清凝集方法在沙门氏菌分型鉴定结果中的意义。方法 选取扬州市邗江区疾病预防控制中心在2022年9月—2023年6月接诊的4940例进行门诊健康证筛查的患者,上述患者均接受血清凝集方法以及多重荧光PCR方法进行检测,探究两种检测方式在沙门氏菌中的检出率以及沙门氏菌分型鉴定结果。结果 多重荧光PCR方法检出效能与血清凝集方法检出效能间无统计学意义(P>0.05);在沙门氏菌分型鉴定结果中对比,多重荧光PCR鉴定方法所检测出的沙门氏菌分型中,肠炎沙门氏菌(1株),鼠伤寒沙门氏菌(1株),B群沙门氏菌(3株)较血清凝集鉴定方法检出率高,但组间对无统计学意义(P>0.05)。结论 多重荧光PCR方法和血清凝集方法在沙门氏菌检测和分型鉴定中各有优势,在特定的应用场景下可以选择适合的方法来提高检测效率和准确性,但本研究存在一定的局限性、年限短、样本量少,今后可加大样本量进一步研究。

应用荧光PCR方法检测食品中的单核细胞增生李斯特氏菌

[目的]发展一种快速、敏感、特异的荧光PCR方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌。[方法]针对单增李斯特氏菌溶血素基因(hlyA),设计特异的引物和TaqMan探针,优化体系,建立荧光PCR检测方法,对该方法的特异性和敏感性进行评价,并且在对188个进出口食品样本的检测中与传统方法进行对比。[结果]经对20株不同菌属的标准菌株和30株野生李斯特氏菌菌株检测,结果显示该方法具有良好的特异性。灵敏度检测结果表明,经过24h增菌,该方法的检测低限为1cfu/g,整个流程只需27h。在实际样本的检测中,检测结果与传统方法结果一致。[结论]该方法能快速、简便和准确地检出单核细胞增生李斯氏菌,具有良好的应用前景。

袋鼠疱疹病毒1型实时荧光PCR方法的建立

为实现袋鼠临床样本中疱疹病毒1型(Macropodid herpesvirus 1,MaHV-1)的出入境快速检测,基于MaHV-1的gB基因序列设计特异引物和TaqMan探针,建立了一种MaHV-1荧光PCR检测方法。试验结果显示,该方法只对MaHV-1 gB基因呈现特异性扩增,与禽传染性喉气管炎病毒、伪狂犬病毒和牛传染性鼻气管炎病毒不发生交叉反应,对阳性标准质粒对照(pCR-MaHV-1-gB)的最低检测限为8个拷贝数/反应。该方法的组内和组间试验的Ct值变异系数介于0.17%～0.96%之间,具有良好的重现性。试验结果表明,本研究建立的实时荧光PCR方法可用于袋鼠MaHV-1的病原学检测。

水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10^(6)~1.0×10^(1) copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10^(1) copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^(-2) pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。

炭疽杆菌双毒力因子荧光PCR检测方法的建立及应用

由炭疽杆菌(Bacillus anthracis)引起的炭疽(anthrax)是严重危害人类和家畜健康的重大传染病。为了提高出入境口岸对不明粉未快件样品的查验效率,防范通过包裹夹带生化武器,本研究使用TaqMan探针技术,建立了针对炭疽杆菌两种毒力质粒pOX1和pOX2的双重荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和稳定性进行了试验。结果显示:本研究建立的炭疽杆菌双重荧光PCR检测方法具有较强的特异性,只特异性检出炭疽杆菌pOX1和pOX2,而与金黄色葡萄球菌等19种对照病原菌均无交叉反应;灵敏度与单重荧光PCR方法相近,最低检测限可达10 copies/μL;稳定性好,反应体系低温保存2、4、6、8个月后,检测阳性质粒的Ct值和峰值相差不大。应用该方法检测600份猪牛羊组织样本,均未检出炭疽杆菌阳性核酸。本研究建立的双重荧光PCR检测方法为炭疽杆菌的快速检测提供了技术支撑。

兔源F型多杀性巴氏杆菌荧光定量PCR检测方法的建立

为建立特异性强且敏感性高的兔源F型多杀性巴氏杆菌(Pm)快速检测方法,本实验根据F型Pm fcbD基因的保守序列设计特异性引物和探针,经反应条件优化,建立了检测兔源F型Pm的荧光定量PCR方法。利用该方法检测兔源F型Pm、兔源A和D型Pm、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、魏氏梭菌和金黄色葡萄球菌等临床常见兔源病原菌,结果显示,该方法仅对兔源F型Pm检测为阳性,其余病原菌均为阴性,特异性强。利用该方法分别检测10倍倍比稀释(1×10^(8)拷贝/μL~1×10^(0)拷贝/μL)的兔源F型Pm基因组DNA,进行敏感性试验,结果显示该方法的检测限为10拷贝/μL,敏感性分别是已报导的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的100倍和10倍,敏感性高。利用该方法对不同稀释度的质粒标准品进行批内和批间重复性试验,结果显示,批内和批间变异系数均小于3%,重复性好。利用该方法检测64份已知结果的临床样品,结果显示该方法的检测结果与已报导的双重PCR方法和环介导等温扩增方法检测结果的符合率均为100%,准确性高。本研究首次以fcbD为靶基因建立兔源F型Pm的荧光定量PCR检测方法,为兔源F型Pm的检测提供了有力的技术手段。

山羊痘病毒和绵羊痘病毒荧光PCR检测方法的建立与应用

为了建立山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV)和绵羊痘病毒(Sheep pox virus,SPPV)快速荧光PCR检测方法,本研究对2种病毒的保守基因P32基因在GeneBank上进行Blast比对,设计合成特异性荧光PCR引物和探针,构建了该病原特异性基因P32的重组质粒。建立了可以同时检测山羊痘病毒和绵羊痘病毒荧光PCR方法,对方法的特异性、敏感性和重复性进行研究,结果显示该方法具有高度的特异性,除了识别山羊痘病毒和绵羊痘病毒基因组外,对羊的基因组及山羊和绵羊常见病原的基因组均不发生交叉反应。在敏感性和重复性实验中,该方法对山羊痘病毒和绵羊痘病毒的检测限为1000Copies·mL-1,变异系数小于3%,因此具有优良的敏感性和稳定性。用该方法检测实验室模拟制备的样品,检测结果与预期相符合。

猪源盖塔病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

猪盖塔病毒感染是由盖塔病毒(GETV)引起母猪妊娠初期胎儿死亡、初生仔猪发病的一种繁殖障碍性疾病。猪是自然界中GETV的主要扩增宿主,可以产生足够高的病毒血症滴度来感染叮咬的蚊子并维持GETV的传播周期,所以定期对猪群进行GETV监测对于预防潜在的GETV暴发具有重要意义。本研究通过分析GETV E2蛋白基因特征,设计特异性引物和探针,条件优化后建立检测GETV感染的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明:以阳性质粒为标准品建立的标准曲线在1×10^(2)~1×10^(7)copies/μL内呈现良好的线性关系,扩增效率为1.61;该检测方法的最低检出限低至3.16 TCID50/mL,远远低于普通PCR的检测限3.16×10^(3)TCID50/mL;组内、组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性和稳定性。本研究建立的方法能够快速有效的检测和定量GETV,为猪群中GETV监测提供可靠的检测方法。

犬瘟热病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据犬瘟热病毒N基因序列的保守区域,设计合成特异性引物,制备标准质粒,通过优化实时荧光定量PCR反应条件建立标准曲线,进行灵敏度、组内组间重复性、特异性试验。结果表明,该方法最低检出限度为2.77个拷贝,重复性、特异性良好,说明所建立的荧光定量PCR方法能够快速准确完成犬瘟热病毒检测。

猪传染性胃肠炎荧光定量PCR检测与治疗

猪传染性胃肠炎(TGE)为一类兽医临床常见的传染病,TGE的主要临床表现为严重腹泻、呕吐、脱水。与猪流行性腹泻(PED)的临床特征相似,二者常出现混合感染,导致临床诊断困难。PCR技术是快速诊断TGE的重要方法,TGEV作为TGE的病原体,其核衣壳蛋白(N)基因是PCR检测的靶基因。建立敏感特异的荧光定量PCR方法用于检测TGEV。本病的临床表现为呕吐、腹泻和脱水等症状,具有高传染性和致死率。如果病猪没有得到及时治疗,有可能感染其他猪只,就此影响健康猪只的健康及养殖场的经济收益。因此,做好猪传染性胃肠炎疾病诊断和治疗工作意义重大。基于此,笔者分析猪传染性胃肠炎荧光定量PCR检测与治疗方法。

食品和饲料中火鸡源性成分的实时荧光PCR检测方法

为对产品真实性提供技术支撑,作者建立了食品和饲料中火鸡源性成分的检测方法。采用TaqMan探针实时荧光PCR方法,对火鸡源性成分特异性、灵敏度进行检测并进行实际应用。实验表明,建立的检测方法具有特异性和高灵敏度,检测限为0.001%。通过对市售食品和饲料样品的检测,建立的方法适用于食品和饲料中火鸡源性成分的检测。

比较多重荧光PCR方法与血清凝集方法对沙门菌分型鉴定的效果

目的通过应用多重荧光PCR试剂盒对沙门菌进行分型,比较与传统血清凝集分型情况的差异,探讨多重荧光PCR试剂盒在沙门菌分型中的有效性。方法选取2018-2021年门头沟区感染性腹泻病例中检出的82株沙门菌进行传统血清鉴定分型及多重荧光PCR分型,采用SPSS 20.0软件对数据资料统计分析。结果82株沙门菌中用血清凝集方法可以区分81株,分为14个血清型;多重荧光PCR试剂盒成功鉴定74株,分为11个血清型,鉴定表中包含其中的78株沙门菌,符合率为94.87%。肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌等常见型别沙门菌检出率100%。结论沙门菌血清型分子鉴定用多重荧光PCR试剂盒具有快速、简单、高效的特点,对常见型别沙门菌鉴定符合率高,但罕见血清型的鉴定还是要依靠传统方法进行判定,在实际工作中两者可互为补充以精准、快速确定感染来源。

食品和饲料中猫源性成分实时荧光PCR检测方法

采用实时荧光PCR方法对食品和饲料中猫源性成分进行TaqMan探针检测。结果表明:该检测方法具有特异性强、灵敏度高的特点,在动物和植物材料基质中,均能检出0.01%的猫源性成分,适用于市售食品和饲料中猫源性成分的检测。

结核分枝杆菌复合群检验中应用荧光定量PCR方法的临床价值

目的对荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法检验结核分枝杆菌复合群的效果做出分析。方法选取2022年3月—2023年5月在长春市传染病医院诊治的疑似结核患者118例作为研究对象,共计156份临床样本,以实验室培养为金标准,对荧光定量PCR法的检验结果进行分析。结果在118例疑似结核患者中,经荧光定量PCR法检测,其阳性检出率为64.10%,与实验室培养检查结果相比,差异无统计学意义(χ^(2)=2.078,P>0.05);经荧光定量PCR法检测,其准确度、特异度、灵敏度分别为97.44%、100.00%、96.15%。结论为结核可疑患者使用荧光定量PCR法进行检测,可获取较高的检测准确度,且灵敏度和特异度均较高,临床应用价值较高。

建立单管双向荧光PCR方法检测NQO1基因609C／T多态性

目的建立单管双向荧光PCR方法快速测定人NAD（P）H：醌氧化还原酶1[NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQ01]基因609C／T多态性。方法以人NQ01基因中的609C／T位点，设计双向引物，优化反应条件，应用SYBR Green Ⅰ双向荧光PCR扩增191份人基因组DNA标本，并通过对产物进行熔解曲线分析，根据产物Tm值进行等位基因单核苷酸多态性分型。对其中62份标本用经典的PCR-限制性片段长度多态方法进行基因型分型，验证结果准确性。结果62份样本的单管双向荧光PCR方法的基因型结果与PCR-限制性片段长度多态法分型结果符合率100％。191份样本中，纯合野生型（CC）占28％，杂合型（CT）占50％，纯合突变型（TT）占22％。结论单管双向荧光PCR方法检测NQ01基因609C／T多态性，操作简便、反应过程快速，结果直观，敏感性、准确性和稳定性好，适用于临床样本检测及流行病学调查研究。

建立一种EGFR突变检测的凸环引物荧光PCR新方法

目的建立一种能快速、有效检测EGFR突变的凸环引物荧光PCR新方法。方法同时用凸环引物荧光PCR技术法和Sanger测序法对混有不同比例的EGFR突变型质粒的样本进行对照检测,以对比两者灵敏度;采用两种方法对93例肺癌组织的EGFR基因进行热突变位点E746-A750del和L858R的检测,并统计其符合率。结果在93例肺癌组织的DNA中,凸环引物荧光PCR技术法和Sanger测序法检测到EGFR突变分别为29例(E746-A750del 15例,L858R14例)和28例(E746-A750del 15例,L858R 13例),符合率达96.6%,且凸环引物荧光PCR技术法能检测出混有5%突变质粒型的样本,其灵敏度达5%,比Sanger测序法高。结论凸环引物荧光PCR技术法比测序法更为简便,且灵敏度更高,易于实现,2小时内即可得出准确结果。

牛传染性鼻气管炎病毒恒温隔绝式荧光PCR检测方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)方法,本研究采用文献报道的引物和探针,通过优化反应体系,首次建立了检测IBRV核酸的iiPCR方法。结果显示该方法仅特异性检测出IBRV,而对牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛腺病毒3型、牛冠状病毒、牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌等病原则不能检出。该方法的检测下限为2.4拷贝/μL质粒标准品,并具有良好的重复性。对临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR方法的检测结果一致;该方法配合PetNAD核酸萃取试剂盒,从核酸提取到报告检测结果仅需1h,具有操作简便、快速、可现地化的特点。对9个省29份商品化冻精检测结果显示,IBRV阳性率为24%(7/29),表明我国流通的商品化冻精携带IBRV情况普遍。本研究为IBRV的现地检测提供了一个可靠的方法。

食品中单增李氏菌实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

运用实时荧光PCR(Real timePCR)技术建立了对食品中单增李氏菌进行检测的快速方法,设计的引物和探针的序列特异性强,省去凝胶电泳的繁琐,降低了污染的可能性.在对26种病原菌进行检测过程中,运用实时荧光PCR法和经典培养法进行比较,结果表明用实时荧光PCR法检测单核细胞增多李斯特氏菌,更快速、敏感、特异性更高.

禽坦布苏病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据ATmV非结构蛋白NS1的基因特征,设计特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和之前建立的RT-PCR方法同时对临床15份疑似ATmV感染的病料进行检测,计算其符合率。【结果】成功建立了检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,当NS1基因含量为(2.67×102)^(2.67×107)拷贝/μL时有良好的线性扩增,其扩增相关系数为0.998,扩增效率为99.9%。建立的ATmV实时荧光定量PCR检测方法敏感度高,最低检测限为2.67×102拷贝/μL;特异性强,对水禽常见病毒(如Ⅰ型鸭肝炎病毒、新型鸭呼肠孤病毒、禽流感病毒、禽Ⅰ型副粘病毒与番鸭细小病毒等)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.39%~1.17%和0.51%~1.82%。对临床送检的15份病料,TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的阳性率为73.33%(11/15),RTPCR方法的阳性率为60.0%(9/15),2种方法的符合率为100.0%。【结论】建立了基于TaqMan探针的ATmV实时荧光定量PCR检测方法,该方法可应用于ATmV感染的早期检测。

黄瓜花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立检测香蕉中黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的实时荧光定量方法.【方法】根据CMV外壳蛋白(CP)保守序列设计了TaqMan实时荧光定量PCR特异性探针及引物,优化反应体系检测TaqMan探针实时荧光定量方法的灵敏度、特异性和重复性.【结果和结论】该方法检测灵敏度为4.2×102μL-1,比普通PCR高100倍,且与香蕉束顶病毒Banana bunchy top virus(BBTV)、香蕉线条病毒Banana streak virus(BSV)无交叉反应,特异性和重复性都较好.用实时荧光定量PCR检测14份田间香蕉样品有5份样品为阳性,进一步证明建立的实时荧光定量方法可用于香蕉CMV的检测.