结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测对菌阴空洞肺结核的诊断效能分析

目的探讨结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(Xpert)检测对菌阴空洞肺结核的诊断效能。方法选取河北省胸科医院2021年4月至2022年10月期间行手术治疗的124例肺部空洞疾病患者相关病历资料,其中菌阴空洞肺结核86例(观察组),非结核肺部空洞疾病38例(对照组)。收集患者手术标本Xpert检测和外周血结核感染T细胞斑点(T-SPOT)试验结果,分析二者对菌阴空洞肺结核的诊断效能。结果Xpert检测和T-SPOT试验诊断菌阴空洞肺结核的敏感度为68.6%、75.6%,特异度为97.4%、68.4%。Xpert检测的敏感度低于T-SPOT试验(χ^(2)=5.832,P<0.001),特异度高于T-SPOT试验(χ^(2)=21.469,P<0.001)。2种方法在观察组中的阳性检出率均高于对照组[Xpert检测:68.6%(59/86)比2.6%(1/38);T-SPOT试验:75.6%(65/86)比31.6%(12/38)](均P<0.001)。受试者工作特征曲线分析结果显示,Xpert检测诊断菌阴空洞肺结核的曲线下面积为0.830,T-SPOT试验的曲线下面积为0.729,Xpert检测的准确度高于T-SPOT试验(P<0.001)。结论Xpert检测对菌阴空洞肺结核有比较可靠的诊断效能。

RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术在儿童支原体肺炎早期诊断及疗效判断中的价值

目的 考察实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)在儿童肺炎支原体肺炎(MPP)早期临床诊断中的价值及其在评价MPP转归以及判断药物疗效中的作用。方法 选取社区获得性肺炎(CAP)住院患儿451例,所有患儿在入院24 h内采集血清标本,采用被动凝集试验检测肺炎支原体(MP)特异性抗体[MP抗体检测(MP-Ab)],并采集咽拭子标本提取MP-RNA(MP-SAT法)。对MPP患儿在完成大环内酯类药物治疗第1疗程、完成大环内酯类药物治疗第3疗程时复查MP-Ab和MP-RNA。根据MPP诊断标准将其分为MPP组(n=183)和非MPP组(n=268)。比较MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性(敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值)。对病程<7 d入院前未使用大环内酯类药物的MPP患儿进行动态观察,考察在大环内酯类药物(阿奇霉素)治疗MP不同时间点(入院时、完成第1疗程和完成第3疗程时)MP-SAT和MP-Ab的阳性率以及患儿临床和影像学表现(咳嗽、发热、肺部体征和CT表现)变化情况。结果 MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性比较差异无统计学意义(P>0.05);病程<7 d患儿组中MP-SAT诊断MPP的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均优于MP-Ab(P<0.001或P<0.05或P<0.01)。病程<7 d入院前未使用大环内酯类药物治疗的MPP患儿共42例,该组患儿在入院时、完成阿奇霉素治疗第1疗程和完成阿奇霉素治疗第3疗程时,MP-SAT检测阳性率分别为88.09%(37/42)、88.09%(37/42)和9.52%(4/42);MP-Ab检测阳性率分别为26.19%(11/42)、100.00%(42/42)和100.00%(42/42),在不同时间点MP-SAT和MP-Ab阳性率比较差异有统计学意义(P<0.001,P<0.05,P<0.001)。该组患儿完成第3疗程时MP-SAT阳性率较入院时明显下降(P<0.001),临床症状(咳嗽、发热)、肺部体征及肺部CT表现较入院时明显好转(均P<0.001),MP-SAT结果与临床症状、肺部体征及肺部影像学表现变化趋势相一致。结论 SAT检测MP-RNA可作为儿童MPP的早期诊断依据,同时也可作为评价MPP转归及判断临床治疗效果的指标。

荧光定量核酸扩增检测技术与环介导等温扩增技术在呼吸道感染病原体检测中的对比研究

目的对比荧光定量核酸扩增检测技术与环介导等温扩增技术在呼吸道感染病原体检测中的应用价值。方法随机在2020年1月~2023年1月天津市河东区疾病预防控制中心接收的呼吸道感染的患者中选取120例作为研究对象,分别采用荧光定量核酸扩增(PCR)检测技术与环介导等温扩增技术(LAMP)检测呼吸道病原体,并对检测结果进行比较分析。结果120例患者中使用LAMP检出细菌感染85例(阳性率为70.83%)。荧光定量PCR检出细菌感染72例(阳性率60.00%),差异无统计学意义(P>0.05);其中LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的检出率高于荧光定量PCR法,差异有统计学意义(P<0.05);采用荧光定量PCR与LAMP法对呼吸道感染10种病原体进行检测,结果表明,除LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、流感嗜血杆菌的检测一致性极好,荧光定量PCR对耐甲氧西林葡萄球菌的检测一致性极好(Kappa≥0.75),其余病原体采用荧光定量PCR与LAMP法检测一致性均中等(0.4≤Kappa<0.75)。结论荧光定量PCR与LAMP两种检测方法对呼吸道感染病原体检出率均较高,其中LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的检出率高于荧光定量PCR法。

“一锅法”等温核酸扩增策略联合荧光定量侧流层析技术对多种细菌16S rRNA的超灵敏检测

致病菌对人类健康构成了极大的威胁,因此及时、灵敏地检测病原体是确诊感染源、预防疾病传播和改善患者治疗的关键。最近的研究表明,细菌的16S rRNA包含了种间差异信息,而典型的细菌则拥有约10000个16S rRNA拷贝。因此,使用16S rRNA作为检测模板对于低浓度病原体的即时检测(POCT)具有重大意义。

抗酸涂片与利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测在耐药肺结核诊断中的应用价值

目的探讨抗酸涂片与利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(Xpert MTB/RIF)检测在耐药肺结核(PTB)诊断中的应用价值。方法选取2020年3月至2022年3月福建省漳州市龙海区疾病预防控制中心收治的95例疑似耐药PTB患者作为研究对象。采集患者的纤维支气管镜肺泡灌洗液进行病原菌分离鉴定(阳性标本进行药敏试验)及抗酸涂片与Xpert MTB/RIF检测。比较病原菌分离鉴定和药敏试验、抗酸涂片及Xpert MTB/RIF检测的阳性率,并以病原菌分离鉴定和药敏试验结果为金标准,比较抗酸涂片、Xpert MTB/RIF检测对耐药PTB的诊断价值及与金标准的一致性。结果95例疑似耐药PTB患者病原菌分离鉴定和药敏试验阳性率为36.84%(35/95),抗酸涂片阳性率为29.47%(28/95),Xpert MTB/RIF检测阳性率为42.11%(40/95),差异有统计学意义(P<0.05)。以病原菌分离鉴定和药敏试验结果为金标准,Xpert MTB/RIF检测的诊断灵敏度、特异度、准确度均高于抗酸涂片,且与金标准的一致性高于抗酸涂片,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论抗酸涂片与Xpert MTB/RIF检测均对耐药PTB具有良好的诊断价值,但Xpert MTB/RIF检测的价值优于抗酸涂片。

基于锁核酸及等位位点特异性扩增技术的KRAS基因突变检测荧光定量PCR方法研究

基于等位位点特异性扩增的原理,设计锁核酸修饰KRAS基因突变特异性扩增引物,结合封阻探针技术,建立检测KRAS基因突变的荧光定量PCR方法。结果发现,锁核酸修饰的引物及探针可显著提高等位位点特异性扩增技术用于复杂样本中的微量基因突变检测的敏感度,该技术检测KRAS基因突变的敏感性可达0.01%~0.1%。进一步用建立的荧光定量PCR方法检测52例结直肠癌患者血浆标本,并用DNA测序法作为对照,同时用健康人血浆标本建立阴性检测结果判读标准,以初步评价该方法应用于循环DNA中KRAS基因突变检测的可行性。结果发现结直肠癌患者KRAS基因突变主要是G12C、G12A和G12R,而且q PCR法的阳性检出率为46.15%,高于DNA测序法(13.46%),阴性结果与DNA测序法的符合率为100%。此外,结直肠癌患者外周血KRAS基因的突变检出率与文献报道组织标本中的突变检出率及常见突变类型基本相符。上述结果说明该方法检测循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)具有较高的可靠性,可以用于肿瘤患者循环血液中KRAS基因突变的检测。

旋转式三温区微流控PCR扩增平台的研制

微流控芯片用于聚合酶链式反应(PCR)可提高检测效率和自动化程度,但目前把核酸提取、扩增、检测功能集成到一块芯片上仍比较困难,此外,微流控芯片专用PCR仪也存在温度控制不够快速、精准的问题。作者采用空间上温度循环代替时间上温度循环的设计思路,搭建了一套旋转式三温区微流控PCR扩增平台,对大肠杆菌进行核酸提取和扩增。结果表明,旋转式三温区微流控PCR扩增平台拥有较好的热均匀性和热稳定性,平台的升降温速率分别为3.5℃/s和2.67℃/s,单次循环时间为110 s。与9700型PCR仪相比,所建平台的温度控制方案更为简单、升降温速率更高、循环时间更短。本研究结果可为实现核酸提取、扩增一体化的微流控PCR设备的研发提供参考。

诺如病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的设计与优化

为设计一种快速、高灵敏度检测诺如病毒(Norovirus,NV)的方法.本文通过检索参考NCBI数据库中收录的国内典型流行的NV毒株BJSMQ的基因序列NC_039476.1,合成了NV的标准重组质粒,根据NV的ORF1基因保守序列设计一组特异性引物和荧光探针;通过正交试验进行程序及试剂反应体系的优化,设计TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明该检测方法具有高灵敏度,最低检测限可达1.2 copies/μL,且在标准重组质粒浓度1.2×10^(5)~1.2×10^(0) copies/μL范围内具有较好的线性关系,其R^(2)=0.9907;该方法特异性强,在病毒的混合重组质粒样液中仅与NV病毒反应;组内和组间的重复性良好,变异系数(CV)值均小于2%;在数字PCR试验中进一步验证了该方法的可行性.本文设计的TaqMan荧光定量PCR检测方法可用于NV毒株的快速准确检测,有望成为NV诊断的有效工具.

含有扩增内标的食品中猪肉和鸡肉成分Taqman探针实时荧光PCR检测方法的建立

【目的】建立含有扩增内标(IAC,Internal amplification control)的用于食品中猪肉和鸡肉成分鉴别的Taqman探针实时荧光PCR检测方法。【方法】分别基于猪的beta actin基因和鸡的transforming growth factor基因设计引物和探针;考察引物和探针的特异性与灵敏度;设计并构建扩增内标,优化体系中扩增内标浓度,建立内标实时荧光PCR体系;使用该检测体系对鲜肉和熟肉来源的DNA模板进行检测评价;应用该体系对市售38份样本进行盲样检测。【结果】含有扩增内标的Taqman探针实时荧光PCR体系能有效地进行食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测,非目标物种在40个循环内均无出现扩增,检出限均为0.5 ng DNA;该体系对鲜肉和熟肉来源的DNA模板检测无显著差异;对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。【结论】该方法准确稳定,可用于食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测。

荧光定量PCR和环介导等温扩增方法检测隐球菌CAP10基因的比较研究

目的建立荧光定量PCR和环介导等温扩增技术(LAMP)检测隐球菌荚膜相关蛋白基因(CAP10)的方法,并比较和评价两种方法的优缺点。方法针对新型隐球菌CAP10基因序列,使用在线软件设计引物,并构建质粒标准品,优化反应条件后用荧光定量PCR和LAMP两种方法检测定量的质粒,分析其敏感性和特异性,并检测临床标本。结果荧光定量PCR检测CAP10质粒的敏感性为6.8×101拷贝,LAMP方法的敏感性为6.8×103拷贝,PCR检测阳性率比LAMP方法高。两种方法特异性好,对脑膜炎奈瑟菌、白色念珠菌、热带念珠菌、黄曲霉、黑曲霉和大肠埃希菌的检测结果均为阴性。结论成功建立了检测CAP10基因的荧光定量PCR方法敏感性和特异性高,但是需要特殊仪器;LAMP方法敏感性较低,但其操作简单,无需特殊仪器和设备,加入核酸染料即能观察结果。两者均适用于新型隐球菌感染的检测。

结核分枝杆菌实时荧光重组酶介导的等温扩增检测方法的建立与应用

目的由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的结核病(tuberculosis,TB)是全球第二大单一感染致死病因,快速和准确的结核诊断技术有助于对其进行精准防控。方法针对MTB菌株插入序列IS6110高度保守区域设计引物和exo探针并进行筛选,建立了MTB实时(real-time,RT)荧光重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法。通过检测11种非结核分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌评价RT-RAA方法的特异性。以实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,q PCR)方法作为平行对照,应用RT-RAA方法扩增梯度稀释的含有目的基因序列不同拷贝数的重组质粒p EASY-Blunt-IS6110,以评价RT-RAA方法的检测敏感度和重复性。将建立的MTB RT-RAA方法应用于173份肺结核临床样品检测中,同时与q PCR方法进行比较。结果建立的MTB RT-RAA方法在42℃条件下30min内即可完成反应;与非结核分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌均无交叉反应;最低检测模板质粒浓度为116拷贝/2μl,优于q PCR方法(138拷贝/2μl);组内和组间的变异系数均小于8%,重复性好。对于肺结核临床样品的检测,RT-RAA方法检测的阳性率与q PCR方法差异无统计学意义。结论本研究建立的MTB RT-RAA方法是一种方便、灵敏和低成本的MTB快速检测方法,具有良好的应用前景。

实时荧光核酸恒温扩增技术和液体培养法检测解脲脲原体的比较

目的:对实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)和液体培养法检测解脲脲原体(UU)的结果进行评估,以选择更为快速、准确、实用的临床检测方法。方法:共采集180例疑似泌尿生殖道感染患者的尿液及2份拭子样本,一份拭子样本用于液体培养,另一份拭子和尿液样本用于SAT检测。结果:液体培养和尿液SAT检测阳性率均为61.1%,拭子SAT检测阳性率为63.3%,其中16例拭子培养和拭子SAT检测结果不一致,18例拭子培养和尿液SAT结果不一致,但与拭子培养比较,拭子和尿液SAT结果均无统计学意义(P>0.05,kappa>0.75)。结论:SAT检测UU可以尿液为样本,检测效能与液体培养和拭子SAT基本相当,但尿液SAT法取样方便,检测快速,适于临床实验室对UU的检测。

荧光定量核酸扩增法对婴幼儿CMV感染的诊断价值

目的探讨荧光定量核酸扩增(FQ-PCR)方法对婴幼儿巨细胞病毒(CMV)感染的诊断价值。方法用FQ-PCR检测疑似CMV感染的206例婴幼儿尿液的CMV-DNA,同时用ELISA法检测血中CMV-IgG和CMV-IgM。并对其中的121例CMV感染的病例进行回顾性分析。结果 FQ-PCR检测出117例CMV-DNA阳性,阳性率为56.79%(117/206);ELISA检测CMV-IgM和IgG的阳性率分别为49.02%(101/206)和92.23%(190/206)。121例CMV感染病例中以肝脏受累发生率最高(38.84%),其次是呼吸系统(31.40%)、泌尿系统(15.70%)、血液系统(9.09%)及消化系统(4.95%)。结论 FQ-PCR检测对CMV感染的诊断有重要作用,且CMV感染对婴幼儿的影响广泛,以肝脏和呼吸系统受累为主。

恒温扩增核酸仪校准方法

介绍了恒温扩增核酸分析仪的工作原理。根据仪器的性能提出了该仪器的校准项目和技术指标:温度示值误差、温度均匀度、温度波动度、样本检测重复性、荧光强度或浊度检测重复性和荧光强度或浊度线性;重点探讨了仪器计量指标的校准方法,形成了一套系统的恒温扩增核酸分析仪校准方法,并对恒温扩增核酸分析仪进行了实际校准。结果表明,该方法科学合理、简便易行,可操作性强,可用于评价仪器计量性能,为仪器日常的校准工作以及国家计量校准规范的制定奠定了基础。

核酸扩增荧光检测技术(PCR)检测肺炎支原体(MP)在社区幼儿获得性肺炎辅助诊断中的意义

目的肺炎支原体(MP)核酸扩增荧光检测技术(PCR)测定在社区幼儿获得性肺炎早期辅助诊断的意义。方法收集玉林市二医院住院及社区幼儿门诊就诊患呼吸道感染及发热幼儿310例,通过三种不同方法即PCR法、血清法和培养法测定MP-DNA及MP-Ab,分析这三种方法测定结果的时间性、敏感性、特异性。评价PCR早期测定方法诊断的可行性。结果 PCR早期测定MP方法与血清法比较有统计学意义(P<0.5),与培养法比较无统计学意义(P>0.5)。结论核酸扩增荧光检测技术(PCR)可作为检测社区幼儿肺炎支原体(MP)早期检测诊断指标。

恒温荧光扩增法快速检测食品中金黄色葡萄球菌

目的建立恒温荧光扩增法快速检测食品中的金黄色葡萄球菌.方法基于重组酶介导链替换核酸扩增技术针对金黄色葡萄球菌nuc基因的保守区域设计特异性引物和探针,建立了检测金黄色葡萄球菌的恒温荧光扩增检测方法,并评价其敏感性、特异性、重复性和符合率.结果该方法可在常温(37~42℃)实现核酸快速扩增,20 min即可完成反应;敏感性较高,金黄色葡萄球菌的检出限为9.12×10^(2) CFU/mL;特异性强,与大肠埃希氏菌O157∶H7、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌的核酸均无交叉反应;不同稀释度菌液检测阈值时间的变异系数为5.78%~5.93%,重复性较好;采用该方法与荧光聚合酶链反应方法同时对50份临床样品进行检测,总符合率均为100%,差异不显著(P>0.05).结论本研究建立的金黄色葡萄球菌恒温荧光扩增检测方法具有敏感性高、特异性强、时间短的特点,可用于金黄色葡萄球菌的快速检测.

核酸扩增实时检测荧光染料的研究进展

核酸扩增反应能够在短时间内将特定DNA模板的数量增加106~109倍,显著提高微量核酸检测的灵敏度,但同时扩增产物的遗漏极易造成交叉污染,影响后续检测。扩增反应通过添加荧光染料实现的实时闭管检测,不仅可以避免反应结束后开管操作所导致的交叉污染,还可以通过反应动力学对样品中模板的起始拷贝数定量,以及通过熔解曲线分析鉴别多种靶标来源、进行基因突变扫描和基因分型检测。目前常用的商业化实时检测荧光染料,如SYBR Green I、Eva Green等,其精确结构信息尚未披露,因此只能通过实验“试错法”选取合适染料,无法从根本上获知染料结构和分析性能之间的关系。本文将通过对目前常用的核酸实时检测荧光染料性质和应用进行总结,为其优化选择、设计和开发提供参考依据。

一步核酸扩增法检测早期宫颈癌前哨淋巴结转移的效果

目的评价一步核酸扩增法(one-step nucleic acid amplification,OSNA)检测早期宫颈癌前哨淋巴结(sentinel lymph node,SLN)转移的效能及对非前哨淋巴结(nSLN)转移的预测价值。方法前瞻性纳入68例早期宫颈癌患者,收集术中SLN组织标本。所有患者均行系统盆腔淋巴结清扫。术中将每枚SLN分为2份,一份行OSNA检测,一份行快速冰冻切片(frozen section,FS)检测;术后病理检测结果作为诊断金标准。分析OSNA、FS与术后病理结果评估微转移(micrometastasis,MM)及宏转移(macrometastases,MC)的一致性,并比较评估特异度、灵敏度;比较OSNA与FS评估MC及MM的灵敏度。比较OSNA检出不同SLN阳性数患者盆腔nSLN阳性比例。结果68例患者中,共收集SLN130枚,43例检出1枚SLN、22例检出2枚SLN、3例检出2枚以上SLN,平均每例患者1.9枚SLN。术后病理检出阳性SLN 26枚(20.0%),其中13枚为MC、13枚为MM。OSNA检出阳性SLN 29枚(22.3%),其中13枚为MC、16枚为MM,4枚为假阳性;101枚OSNA阴性的SLN中,1枚术后病理检测为阳性。OSNA检测SLN转移的特异度、灵敏度、阴性预测值、阳性预测值分别为96.2%、96.2%、99.0%、86.2%(P=0.375),与术后病理一致性较好(Kappa值=0.885);FS检测SLN转移的特异度、灵敏度、阴性预测值、阳性预测值分别为100%、61.5%、91.2%、100%(P=0.002),与术后病理一致性一般(Kappa值=0.719)。对于MC SLN,OSNA与FS检出的灵敏度均为100%;对于MM SLN,OSNA检出灵敏度为92.3%、FS检出灵敏度为23.1%(P=0.030)。盆腔nSLN阳性患者中,OSNA检出阳性SLN>1枚患者比例高于检出1枚SLN阳性患者(77.8%vs 22.2%,P=0.041)。OSNA检出SLN阳性患者术后病理显示肿瘤细胞分化更差、增殖指数更高,且存在淋巴脉管侵犯。结论OSNA操作简便、快速,检测SLN转移的灵敏度与术后病理相近,高于FS,可用于术中判断早期宫颈癌SLN转移。

荧光定量核酸扩增系统在肺结核及利福平耐药性检测中的应用价值分析

目的:探究荧光定量核酸扩增(Gene Xpert MTB/RIF)系统在肺结核及利福平耐药性检测中的应用价值。方法:选取2021年2月~12月本院收治的102例结核分枝杆菌感染的患者为观察组,对照组选取健康体检者50例。所有受试者接受Gene Xpert MTB/RIF系统分析、痰液酸性罗氏培养、痰液抗酸染色镜检。统计上述检测方法对核酸分枝杆菌的检出率,并分析Gene Xpert MTB/RIF系统在利福平耐药检测中的应用价值。结果:在观察组102例结核分枝杆菌感染患者中,Gene Xpert MTB/RIF系统全部检测出阳性,其中高级、中级、低级以及极低级结核分枝杆菌感染者分别为12例、30例、32例以及4例;总检出率同病原菌酸性罗氏培养检出的相符率为76.47%,同抗酸染色镜检出的相符率为57.84%。Gene Xpert MTB/RIF系统检测出利福平耐药16例,比例法药敏试验检测出利福平耐药19例,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Gene Xpert MTB/RIF系统对结核分枝杆菌的检测具有良好的准确率,能够有效提高检测效率,同时对利福平耐药基因的表达有一定的鉴别作用,在结核病的早期诊断、防治以及排查工作中具有较高的应用价值。