鸽A群轮状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

鸽A群轮状病毒(group A rotavirus,RVA)是影响养鸽业健康发展的主要病原之一。为实现鸽RVA的高通量快速检测,根据目前国内外流行的鸽RVA VP6基因保守区域设计特异性引物与探针,建立了一种可以特异性检测鸽RVA的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评估。结果显示,该方法灵敏度高,最低检测限为7.22×10^(2)copies/μL;特异性强,与鸽群其他常见病毒无交叉反应;重复性好,组内与组间重复变异系数均小于1.5%。利用该方法和普通RT-PCR方法对200份临床样品进行检测,发现荧光RT-PCR方法的病毒阳性检出率高于普通RT-PCR方法,二者符合率为94.00%。结果表明,本研究建立的实时荧光RT-PCR方法敏感、特异、准确,重复性好,可为开展鸽RVA的临床检测及流行病学调查提供技术支持。

4种猪腹泻病毒恒温隔绝式荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒,本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针,经过方阵法优化恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)反应条件,建立了检测这4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法。用建立的iiRT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV),并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果显示该方法特异性强,对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的检测下限分别为10^(2)、10^(2)、10^(3)、10^(3)TCID_(50)/mL,并具有良好的组内和组间重复性;而荧光定量PCR方法的检测下限分别为10^(1)、10^(2)、10^(2)、10^(2)TCID_(50)/mL,敏感性略高于iiRT-PCR。2种方法对22份临床样品的检测结果符合率为100%,PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV阳性率分别为40.91%、9.09%、45.45%、9.09%,其中PEDV与PoRV混合感染率为18.18%,PDCoV与PoRV混合感染率为4.55%。本研究建立的iiRT-PCR为临床现场检测4种猪腹泻病毒提供了一种简便快速的方法。

H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

旨在提高对禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)检测效率,及时发现疫病。本研究通过分析M基因以及H5、H7和H9亚型的HA基因序列保守区域,设计并合成了相关探针和引物,建立了禽流感病毒(AIV)四重荧光RT-PCR检测方法,该方法可在检测禽流感病毒(AIV)的同时,确定病原是否为H5、H7和H9亚型。结果显示,该检测方法耗时短、特异性好、检测下限达到10^-5 ng·μL^-1。采用该方法检测临床采集的13个活禽交易市场的384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品,经检测,其中有60份样品为流感病毒阳性,且全部是H9亚型,该结果与行业标准方法(NY/T 772-2013)检测结果一致,κ值为1(P<0.001)。本方法能实现对禽流感病毒及H5、H7和H9亚型的高通量快速检测,将在AIV快速检测中发挥重要作用。

鸡传染性支气管炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速准确检测鸡传染性支气管炎病毒的方法,根据鸡传染性支气管炎病毒的核衣壳蛋白基因进行引物和探针设计,建立了一种能够检测鸡传染性支气管炎病毒的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法进行特异性和灵敏度检测,同时与国家标准检测方法进行对比。结果显示,本检测方法特异性好,不与其他相关病毒发生交叉反应,灵敏度可达到10-4 ng/μL,与国标检测方法的符合率达100%。结果表明,本研究建立的检测方法可以准确鉴定鸡传染性支气管炎病毒,具有良好的应用前景。

荧光RT-PCR检测鱼类鲤春病毒血症病毒的研究

本研究根据鲤春病毒血症病毒的核酸保守区序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的检测鲤春病病毒的荧光RT-PCR检测技术。同时,又将该方法与一步法RT-PCR方法和细胞查毒方法进行了互相验证和对比研究,结果表明,荧光RT-PCR方法检测病毒悬液的灵敏度最高,病毒悬液10-6稀释仍然可以检出,而细胞分离病毒方法测得的TCID50为10-4。本文还对北京地区出口渔场送检样品、人工实验感染该病毒鱼的病料进行了组织脏器中病毒分布和病毒含量的研究。结果显示,北京地区出口渔场送检样品未见细胞病变,所有检测样品均为阴性;病毒致死鱼的肠道病毒含量最高,肠组织研磨稀释10-4倍仍然可以检出;其次是肾和鳃组织,检出极限为稀释10-3倍组织悬液;肉和脑组织中病毒含量较低,肉最高能检出10-2倍组织悬液,而脑组织只能检出10-1倍组织稀释液。

H9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速准确检测H9亚型禽流感病毒基因的检测方法,根据GenBank中H9亚型禽流感病毒血凝素编码基因进行荧光检测引物和探针设计,建立了一种针对H9亚型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测方法。利用该方法进行灵敏度和特异性检测,并用本方法和国家标准中的荧光RT-PCR检测方法,同时对临床样本进行检测。结果显示,仅H9亚型禽流感病毒出现了正常荧光检测曲线,而其他病毒及阴性对照均未出现;检测灵敏度为RNA终浓度10-4 ng/μL(1.30×104 copies/μL);临床样本检测结果与国标方法一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高,可用于H9亚型禽流感病毒检测。

贝类产品中诺沃克病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

诺沃克病毒是一种分布很广泛的肠道腹泻病毒 ,主要存在于牡蛎、文蛤等贝类中。本研究建立了从贝类中提取诺沃克病毒RNA的方法以及进行实时荧光RT -PCR检测的方法。

荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒方法的敏感性和特异性

用建立的荧光RT -PCR检测中强毒力新城疫病毒方法检测 10株不同稀释度的中强毒力新城疫病毒株感染尿囊液 ,并同时与鸡胚病毒分离比较表明 ,荧光RT -PCR检测鸡胚感染尿囊液的最高稀释度为 10 -7,最低为 10 -5,略低于鸡胚病毒分离。对 2 3株不同毒力的新城疫病毒用荧光RT-PCR进行了测定看出 ,本课题建立的荧光RT -PCR可以区分中强毒力新城疫病毒和疫苗弱毒。用建立的荧光RT -PCR检测中强毒力新城疫病毒株方法检测常见的禽类病毒 。

中强毒力新城疫病毒(NDV)荧光RT-PCR检测方法建立及体系优化

根据新城疫病毒F基因序列 ,选择能够反应裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针 ,从中筛选出最佳引物、探针配对 ,对引物、探针的浓度、Taq酶用量、逆转录酶、循环数、逆转录反应体积、样品RNA提取方法等进行了优化 ,建立了快速检测中强毒力新城疫病毒的方法-荧光RT -PCR。

荧光RT-PCR检测NDV人工感染肉鸡组织脏器的应用研究

用 6株新城疫病毒分离株人工感染 2 8日龄肉鸡 ,感染后 3天采集咽喉拭子和泄殖腔拭子 ,对死亡鸡进行病理剖检 ,取心、肝、脾、肺、肾、小肠、腿肌、胸肌等 ,制备组织脏器悬液 ,作倍比稀释 ,用建立的荧光RT -PCR方法检测并同鸡胚分离比较。试验表明 ,荧光RT -PCR检测组织脏器和拭子的敏感性同鸡胚分离的敏感性基本一致 ,荧光RT -PCR检测脏器的最低检测量为 5X10 -5,肌肉的最低检测量为5X10 -3,拭子的最低检测量为 10 -3。用不同的样品处理方法处理样品做荧光RT -PCR表明 ,裂解液处理样品方法优越 。

二重实时荧光RT-PCR检测法在口蹄疫病毒检测中的应用

为探究二重实时荧光RT-PCR检测法在口蹄疫病毒检测中的应用情况,依照口蹄疫病毒(FMDV)聚合酶3D基因序列,规划并组合成引物与探针,有针对性的优化部分反应条件,构建了FMDV通用型与A型二重实时荧光RT-PCR检测法。选择124份疑似感染的试样进行检测。结果显示,构建的荧光RT-PCR方法在101~107拷贝/uL模板范围中形成良好的线性关系,对pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒均呈现出阳性扩增信号,共计检测出FMDV-T阳性10份,FMDV-T/FMDV-A双阳性7份。可见,RT-PCR检测法能够定量分析及同时检测大量口蹄疫病毒样本。

荧光RT-PCR检测与ELISA检测在戊肝临床诊断效果的比较分析

目的探讨和比较荧光RT-PCR检测与ELISA检测在戊肝临床诊断的效果。方法从我院健康体检中心2013年1月至2016年1月的50500血清标本中随机选择100份作为研究标本。通过采用酶联免疫法对戊肝抗体的检测,然后再通过荧光RT-PCR检测法进行确诊,观察和比较两组检测方法的检查结果。结果阳性一致率为55%,阴性一致率为100%,总一致率为75%,Kappa值为0.59(0.4<Kappa≤0.75),表示两者一致性一般。ELISA阳性检出率为30%,PCR阳性检出率为50%,PCR阳性检出率明显高于ELISA,数据比较差异具有统计学意义,P=0.000<0.005。结论荧光RTPCR检测和ELISA检测在戊肝的诊断中都具有一定的检查准确度,同时荧光RT-PCR检测的阳性检出率明显高于ELISA检测。由于ELISA检测容易受到各方面因素的影响而发生漏诊的情况,因此建议对于ELISA检测出现可疑的标本,使用RT-PCR进行确诊,使更具可靠性。

实时荧光RT-PCR检测冷冻草莓中诺如病毒

目的建立冷冻草莓中的GI、GII型诺如病毒实时荧光RT-PCR检测方法,并应用于实际样品的检测。方法对草莓样品进行前处理、病毒富集、病毒RNA的提取和纯化,然后采用实时荧光RT-PCR进行检测。结果核酸提取方法能够有效地去除抑制因子,同时对104份送检样品进行检测,结果均为阴性。结论所建立的核酸提取与实时荧光RT-PCR结合的检测体系适合于草莓样品中诺如病毒GI、GII型的检测。

亚欧型及南非型口蹄疫一步法多重荧光RT-PCR检测方法建立

【目的】口蹄疫是一种严重的"政治经济病",世界各国面临的口岸疫情防控形势均十分严峻。针对南非型(SATⅠ,SATⅡ,SATⅢ型)潜在入侵中国的严峻态势,为了防止疫情跨境传播,迫切需要建立有效甄别亚欧型(A、O、C及亚洲Ⅰ型)与南非型口蹄疫的检测方法,以进一步提高防控工作的准确性。【方法】选择口蹄疫病毒(FMDV)基因组保守的5'非翻译区(5'UTR)基因为靶序列,分别设计亚欧型及南非型FMDV特异的荧光PCR引物及Taqman探针,通过对反应体系和反应条件的优化,以插入扩增目的片段的阳性克隆质粒为模板,建立多重荧光PCR检测体系;进一步以体外转录cRNA作为阳性质控品,建立亚欧型及南非型FMDV一步法多重荧光RT-PCR鉴别方法,并进行敏感性、特异性确定及田间样本检测。【结果】本研究建立的FMDV多重荧光PCR检测方法,对亚欧型及南非型FMDV阳性质粒的扩增效率均在90%以上;以倍比稀释的体外转录cRNA作为模板,进行敏感性测试表明,本方法最低可检测至7.6×10-9ng南非型cRNA和6.3×10-8ng亚欧型cRNA;特异性试验结果显示本方法可以有效甄别亚欧型与南非型FMDV;田间样本检测结果与样品实际感染情况一致。【结论】本研究建立的FMDV一步法多重荧光RT-PCR检测方法敏感、特异而且快速,为亚欧型与南非型口蹄疫的鉴别诊断及流行病学调查提供了新的方法。

鱼类神经坏死病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光RT-PCR反应条件进行优化,建立了用于检测鱼类神经坏死病毒的实时荧光RT-PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其他多种常见的水生动物RNA病毒,结果只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.2pg/μL的总RNA。与RT-PCR的灵敏度对比试验表明,其敏感度比RT-PCR高100倍。对同一样品进行检测,在组内及组间的变异系数分别为0.9%以及1.5%,证实其重复性极好,并且从抽提核酸到得出结果仅需4h。对临床500份样品进行鱼类神经坏死病毒检测,结果发现有40份阳性样品。这些结果表明,本研究所建立的实时荧光RT-PCR能对鱼类神经坏死病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高的优点,是开展鱼类神经坏死病的临床检测和疫情监测工作的有力工具。

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法的建立

参照美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M基因序列,设计引物和探针,并建立其荧光RT-PCR检测方法,以检测严重危害我国养猪业的此型PRRSV。该法能检测到1 TCID50的PRRSV。用此法检测猪瘟病毒、乙脑病毒、伪狂犬病毒、马动脉炎病毒、圆环病毒Ⅱ型和MARC145细胞的RNA,结果均为阴性。对126份临床样品进行检测应用,检测结果(7份阳性,119份阴性)与病毒分离完全符合。此法中的阳性对照为体外转录的dsRNA,具有高度的稳定性,解决了此类检测方法所用的RNA阳性对照所普遍存在的易于降解的难题。

TaqMan探针荧光RT-PCR检测狂犬病病毒

根据GenBank已公布的狂犬病病毒(rabies virus,RV)核蛋白(N)基因序列设计并合成一对特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的荧光RT-PCR检测狂犬病病毒方法。对狂犬病疫苗提取核酸后进行RT-PCR扩增,将目的条带切胶回收,克隆测序,重组质粒作为标准阳性对照。对建立的TaqMan探针荧光RT-PCR方法做灵敏度、特异性、重复性及稳定性试验。结果显示,该方法可以达到10拷贝/μL的灵敏度,可以将狂犬病病毒与犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒和犬副流感病毒分开,方法重复性好,稳定可靠。

番茄不孕病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究

番茄不孕病毒(tomato aspermy virus,TAV)是危害我国菊花生产的主要病毒之一。本研究根据该病毒外壳蛋白北京分离物的基因,设计特异性引物与荧光探针,建立了基于TaqMan探针的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法与DAS-ELIAS相比,检测灵敏度提高了约1 000倍,重复性试验表明批内与批间变异系数均在5%以内,整个检测过程仅需2 h,是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、快速有效的TAV检测方法。

荧光RT-PCR检测活禽和禽产品中新城疫病毒中强毒株的研究

本研究中，采用TaqMan方法，根据新城疫病毒F基因核苷酸序列，设计合成多对引物，在上游引物和下游引物之间设计多条探针，通过对引物、探针的筛选，反应条件的选择和优化，建立了检测活禽和禽产品中中强毒力新城疫病毒的荧光RT-PCR方法。经对10株倍比稀释的中强毒力新城疫病毒的尿囊液进行检测后，表明所建立的荧光RT-PCR方法的检测极限在10^-5～10^-7”之间，略低于鸡胚病毒分离方法（10^-8～10^-9）；对收集到的所有新城疫病毒株和常见禽类病毒（包括禽流感病毒H5、H9亚型、IBDV、IBV、KIBV、CAAV、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒）进行检测，结果表明建立的方法不能检出其他的常见禽类病毒，特异性良好。进一步用建立的荧光RT-PCR检测人工感染SPF肉鸡的组织脏器、咽喉及泄殖腔拭子及临床样品中的中强毒力的新城疫病毒，并同鸡胚分离结果比较，结果表明荧光RT-PCR的敏感性同鸡胚分离试验基本一致。由于荧光RT-PCR方法快速，从处理样品开始到出结果只需不到4小时，而且检测样品量大，这就充分显示了其快速、敏感、特异的优势。在强调口岸快速通关的今天，该方法的建立无疑为活禽或禽产品的快速检验检疫提供了有效的手段。

禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏性试验

为了确定深圳出入境检验检疫局和深圳太太基因工程有限公司联合研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型禽流感的灵敏度,通过测定已知鸡胚半数致死量(ELD50)的标准毒株的进行了定量。利用9～11日龄SPF鸡胚,对深圳出入境检验检疫局保存的H5和H9亚型标准禽流感毒株进行了鸡胚半数致死量(ELD50)的测定,结果为H5亚型禽流感毒株的半数致死量为10-7.75/0.2mL,H9亚型禽流感毒株的半数致死量为10-8.5/0.2mL。用所研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型标准禽流感毒株原液进行10倍连续稀释,进行实时荧光RT-PCR灵敏度的测定,结果发现:试剂盒检测H5亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10-5倍稀释液,该稀释液含有281ELD50病毒量;检测H9亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10-8倍稀释液,该稀释液含有15.8ELD50病毒量。同时检测H5和H9时,试剂盒的灵敏度要比单独检测一个亚型时的灵敏度增加一个数量级。本灵敏度已经能够检测到感染鸡的喉拭子和(或)泄殖腔拭子所采集的病毒量,能够满足检验检疫的实际需要。