H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

旨在提高对禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)检测效率,及时发现疫病。本研究通过分析M基因以及H5、H7和H9亚型的HA基因序列保守区域,设计并合成了相关探针和引物,建立了禽流感病毒(AIV)四重荧光RT-PCR检测方法,该方法可在检测禽流感病毒(AIV)的同时,确定病原是否为H5、H7和H9亚型。结果显示,该检测方法耗时短、特异性好、检测下限达到10^-5 ng·μL^-1。采用该方法检测临床采集的13个活禽交易市场的384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品,经检测,其中有60份样品为流感病毒阳性,且全部是H9亚型,该结果与行业标准方法(NY/T 772-2013)检测结果一致,κ值为1(P<0.001)。本方法能实现对禽流感病毒及H5、H7和H9亚型的高通量快速检测,将在AIV快速检测中发挥重要作用。

鱼类神经坏死病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光RT-PCR反应条件进行优化,建立了用于检测鱼类神经坏死病毒的实时荧光RT-PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其他多种常见的水生动物RNA病毒,结果只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.2pg/μL的总RNA。与RT-PCR的灵敏度对比试验表明,其敏感度比RT-PCR高100倍。对同一样品进行检测,在组内及组间的变异系数分别为0.9%以及1.5%,证实其重复性极好,并且从抽提核酸到得出结果仅需4h。对临床500份样品进行鱼类神经坏死病毒检测,结果发现有40份阳性样品。这些结果表明,本研究所建立的实时荧光RT-PCR能对鱼类神经坏死病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高的优点,是开展鱼类神经坏死病的临床检测和疫情监测工作的有力工具。

亚欧型及南非型口蹄疫一步法多重荧光RT-PCR检测方法建立

【目的】口蹄疫是一种严重的"政治经济病",世界各国面临的口岸疫情防控形势均十分严峻。针对南非型(SATⅠ,SATⅡ,SATⅢ型)潜在入侵中国的严峻态势,为了防止疫情跨境传播,迫切需要建立有效甄别亚欧型(A、O、C及亚洲Ⅰ型)与南非型口蹄疫的检测方法,以进一步提高防控工作的准确性。【方法】选择口蹄疫病毒(FMDV)基因组保守的5'非翻译区(5'UTR)基因为靶序列,分别设计亚欧型及南非型FMDV特异的荧光PCR引物及Taqman探针,通过对反应体系和反应条件的优化,以插入扩增目的片段的阳性克隆质粒为模板,建立多重荧光PCR检测体系;进一步以体外转录cRNA作为阳性质控品,建立亚欧型及南非型FMDV一步法多重荧光RT-PCR鉴别方法,并进行敏感性、特异性确定及田间样本检测。【结果】本研究建立的FMDV多重荧光PCR检测方法,对亚欧型及南非型FMDV阳性质粒的扩增效率均在90%以上;以倍比稀释的体外转录cRNA作为模板,进行敏感性测试表明,本方法最低可检测至7.6×10-9ng南非型cRNA和6.3×10-8ng亚欧型cRNA;特异性试验结果显示本方法可以有效甄别亚欧型与南非型FMDV;田间样本检测结果与样品实际感染情况一致。【结论】本研究建立的FMDV一步法多重荧光RT-PCR检测方法敏感、特异而且快速,为亚欧型与南非型口蹄疫的鉴别诊断及流行病学调查提供了新的方法。

鸡传染性支气管炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速准确检测鸡传染性支气管炎病毒的方法,根据鸡传染性支气管炎病毒的核衣壳蛋白基因进行引物和探针设计,建立了一种能够检测鸡传染性支气管炎病毒的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法进行特异性和灵敏度检测,同时与国家标准检测方法进行对比。结果显示,本检测方法特异性好,不与其他相关病毒发生交叉反应,灵敏度可达到10-4 ng/μL,与国标检测方法的符合率达100%。结果表明,本研究建立的检测方法可以准确鉴定鸡传染性支气管炎病毒,具有良好的应用前景。

番茄不孕病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究

番茄不孕病毒(tomato aspermy virus,TAV)是危害我国菊花生产的主要病毒之一。本研究根据该病毒外壳蛋白北京分离物的基因,设计特异性引物与荧光探针,建立了基于TaqMan探针的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法与DAS-ELIAS相比,检测灵敏度提高了约1 000倍,重复性试验表明批内与批间变异系数均在5%以内,整个检测过程仅需2 h,是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、快速有效的TAV检测方法。

新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为满足新城疫病毒高通量快速检测的需要,针对新城疫病毒M基因序列,通过基因比对分析保守区域,经同源性分析后,设计合成多条引物和探针并对其筛选,建立了一种能够快速检测新城疫病毒的实时荧光RTPCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性进行了评估。结果显示,该方法检测耗时短、特异性好,检测下限达10-4 ng/μL。利用该方法,对480份临床采集的各类家禽咽拭子样品进行检测,共检测出25份阳性,与常规RT-PCR检测方法结果一致,κ值为1(P<0.001)。结果表明,该方法快速、准确,可用于新城疫病毒的快速检测。

欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法的建立

根据欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计E1和E6 2套PCR引物和TaqMan荧光探针,建立E1和E6荧光RT-PCR方法,用于检测PRRSV。反应条件优化后,用10倍倍比稀释的质粒DNA、cDNA进行PCR扩增以检测其灵敏度,同时对猪瘟(CSFV)、猪伪狂犬(PRV)等7种病毒进行特异性检测。结果显示,建立的E1和E6荧光RT-PCR可以检出欧洲型PRRSV,敏感性依次为616和216个拷贝的PRRSV重组质粒DNA,而CSFV等非PRRSV均为阴性。建立的E1、E6荧光RT-PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可作为检测欧洲型PRRSV的技术储备。

甲型H1N1(2009)流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价

自甲型H1N1(2009)流感病毒于2009年在世界多个国家暴发流行后,许多国家的猪群中检测到该病毒的存在,因此建立快速准确的甲型H1N1流感病毒的检测方法成为迫切需求。本研究针对甲型H1N1(2009)流感病毒NA基因设计特异性引物和探针,建立甲型H1N1(2009)流感病毒特异性实时荧光RT-PCR快速检测方法。并将该方法与WHO推荐美国CDC建立的检测方法和美国农业部推荐的检测方法进行比较。通过田间试验验证该方法在实际应用中的效果。结果表明:本研究建立的方法对检测甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的灵敏度达到10-6,与WHO推荐的A型流感病毒实时荧光PCR检测方法的灵敏度一致,并且高于美国农业部推荐方法的检测灵敏度(10-5);该方法特异性强,与经典型H1N1和其他亚型流感病毒株无任何交叉反应。与香港兽医化验所进行了检测比对,检测灵敏度和特异性完全一致。近3 800份的田间试验表明,所建立的方法准确可靠。本研究所建立检测方法快速灵敏,检测结果准确可靠,适合用于甲型H1N1(2009)流感病毒的分子生物学检测和监测。

口蹄疫病毒通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感、特异的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)分型鉴别诊断实时荧光RT-PCR(Fluorescence quantitative,FQ-PCR)检测方法,根据O、A、AsiaⅠ三种血清型FMDV保守基因序列,设计能够检测到FMDV的特异性通用检测引物和A型检测引物,以及不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法,对123份疑似FMDV感染的临床样品进行了检测。结果显示,建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法在10~1～10~7拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线;自123份疑似FMDV感染样品中,检出10份FMDV-T阳性,6份FMDV-T/FMDV-A双阳性并且与基因测序结果一致。结果表明,本研究建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法重复性好、敏感性高、特异性强,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,可用于FMDV的快速分型检测,为FMDV的早期检测及临床诊断提供了新方法。

禽流感病毒通用型及H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法研究

将套式PCR与荧光RT-PCR技术相结合,叠加这两种技术在敏感性和特异性方面的优势,建立敏感性高于常规荧光RT-PCR的套式荧光RT-PCR检测方法。从GenBank下载禽流感病毒NP基因和HA基因序列,通过比对选取较为保守的片段,设计AIV通用型及H5亚型套式荧光RT-PCR引物和TaqMan探针;利用体外转录技术制备阳性对照,构建目的片段重组质粒;经反应体系和反应条件的优化,建立套式荧光RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法可特异性地检测禽流感病毒及H5亚型AIV,在30份鱼类养殖水样中检测到19份阳性样品,具有较高的敏感性和良好的特异性;具有高通量、快速的特点,可对大批量样品同时进行检测,试验耗时仅需5h,是自然环境样品中极微量禽流感病毒检测的好方法。

H9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速准确检测H9亚型禽流感病毒基因的检测方法,根据GenBank中H9亚型禽流感病毒血凝素编码基因进行荧光检测引物和探针设计,建立了一种针对H9亚型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测方法。利用该方法进行灵敏度和特异性检测,并用本方法和国家标准中的荧光RT-PCR检测方法,同时对临床样本进行检测。结果显示,仅H9亚型禽流感病毒出现了正常荧光检测曲线,而其他病毒及阴性对照均未出现;检测灵敏度为RNA终浓度10-4 ng/μL(1.30×104 copies/μL);临床样本检测结果与国标方法一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高,可用于H9亚型禽流感病毒检测。

小反刍兽疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立小反刍兽疫病毒(PPRV)快速荧光RT-PCR检测方法,应用DNAstar软件对来自NCBI上的PPRVN基因序列进行比对分析,在保守区设置引物和探针,经条件优化,建立PPRV荧光RT-PCR检测方法。结果显示,该方法灵敏度高、特异性好、稳定性强,阳性结果与商用试剂盒的检测结果一致。结果表明该方法可用于PPRV的实验室检测。

贝类产品中诺沃克病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

诺沃克病毒是一种分布很广泛的肠道腹泻病毒 ,主要存在于牡蛎、文蛤等贝类中。本研究建立了从贝类中提取诺沃克病毒RNA的方法以及进行实时荧光RT -PCR检测的方法。

中强毒力新城疫病毒(NDV)荧光RT-PCR检测方法建立及体系优化

根据新城疫病毒F基因序列 ,选择能够反应裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针 ,从中筛选出最佳引物、探针配对 ,对引物、探针的浓度、Taq酶用量、逆转录酶、循环数、逆转录反应体积、样品RNA提取方法等进行了优化 ,建立了快速检测中强毒力新城疫病毒的方法-荧光RT -PCR。

一种鉴别尼帕病毒和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感和特异地鉴别尼帕病毒（NiV）和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的检测方法,本试验以NiV M基因和HP-PRRSVnsp2基因为靶序列,通过优化反应条件建立了一种二重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、定量线性范围、敏感性和重复性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因和HP-PRRSVnsp2基因的RNA标准对照（NiV-M-RNA和HP-PRRSV-nsp2-RNA）,线性范围分别为4.6×101-4.6×107和4.1×101-4.1×108拷贝/μL;最低检出限分别为46和4.1拷贝;该方法组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示出良好的可重复性;该方法仅对NiV和HP-PRRSV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪流感病毒（SIV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪圆环病毒2型（PCV2）发生交叉反应。用该方法对236份猪实际样品进行NiV和HP-PRRSV核酸检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,8份样本的HP-PRRSV检测结果为阳性。本研究建立的方法为猪实际样本中NiV和HP-PRRSV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

基因Ⅵ型新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

鸽新城疫是严重危害鸽业健康发展的主要疫病之一,近年来流行呈上升趋势。为满足开展基因Ⅵ型鸽源新城疫病毒快速检测的迫切需求,针对国内流行的基因Ⅵ型新城疫病毒F基因保守区域设计特异性引物和探针,建立了一种可特异检测基因Ⅵ型新城疫病毒的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性进行了评估。结果显示,该方法与其他基因型新城疫病毒和常见禽病病毒无交叉反应,检测下限为5 copies/μL。利用该方法对临床采集的120份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测,检测结果与病毒分离结果完全一致。结果表明,本研究建立的实时荧光RT-PCR方法特异性强、敏感性高、准确性好,可用于基因Ⅵ型新城疫病毒的快速检测。

H5N8亚型流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价

流感病毒变异迅速,为研究和建立一种针对H5 N8亚型流感病毒核酸准确灵敏的检测方法,分别选择H5 N8亚型流感毒株序列相对保守的HA基因和NA基因作为H5 N8亚型流感病毒检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,选择两种不同的荧光标记,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5 N8亚型禽流感病毒检测方法。实验结果表明,所建立的H5 N8亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10-5,NA基因检测的灵敏度为10-5,重复性好,特异性佳。结果表明:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5 N8亚型流感病毒,耗时短,可很快作出判定结果,适用于H5 N8流感病毒的分子生物学检测和监测。对于控制流感流行,减少经济损失,最大限度保护社会人群健康具有很大意义。

猪δ冠状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),根据PDCoVM基因保守区域设计引物和探针,建立了一种PDCoV实时荧光RT-PCR检测方法,并评价了该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,该方法的拷贝数对数值与Ct值在1.3×10^(3)-1.3×10^(7) copies/μL拷贝数浓度范围内呈现良好的线性关系,R^(2)=0.994;最低检出限为13 copies/μL,且无非特异性扩增;批内和批间重复性试验变异系数(CV)为0.24%~2.15%,均小于3%。利用该方法和普通RT-PCR对42份临床样品同时进行检测,发现本方法比普通RT-PCR灵敏性更高,二者符合率为95.2%。以上结果表明,本试验建立的实时荧光RT-PCR方法灵敏、特异、可靠,可用于PDCoV的临床检测和流行病学调查。

BVDV荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)毒株序列,选择5’NTR保守区域设计1对特异性引物和1条Taqman探针,通过矩阵法筛选引物探针的最佳浓度,建立了检测BVDV的荧光RT-PCR方法。结果显示,用1.5μL上下游引物混合液(10μmol/L)和0.5μL探针溶液(10μmol/L)对BVDV进行检测,可获得较小Ct值、较高吸光值,并可降低检测成本。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好。将该方法应用在疫苗生产中,可快速准确地筛选出合格的原辅材料和半成品,为生产提供及时准确可靠的数据。