利用荧光mRNA差异显示技术克隆短芒大麦盐胁迫相关基因的ESTs

目的 :获取短芒大麦盐胁迫相关基因的 ESTs。 方法 :应用荧光 m RNA差异显示技术进行筛选 ,并利用反向 North-ern杂交方法对差异片段进行快速鉴定以排除假阳性。结果 :共获得 32个与盐胁迫相关的 c DNA序列 ,并获得 Gen Bank注册号。BL AST同源性分析结果表明 ,1 3个与已知基因序列有同源性 ,1 9个为未知 ESTs。其类型分别为 :诱导表达型 ,2 2个 ;增强表达型 ,7个 ;抑制表达型 ,3个。 结论 :通过荧光 m RNA差异显示技术获得了短芒大麦盐胁迫相关基因的 ESTs。

荧光mRNA差异显示方法的建立及条件优化

目的 建立荧光 m RNA差异显示方法 ,优化实验条件 ,为分离克隆基因差异表达片段奠定基础。方法 提取总 RNA,筛选随机引物和荧光锚定引物各 1条进行差异显示 ,割取差异条带进行重扩增。结果 总 RNA经DNase 处理后 ,展示条带减少明显 ,以未经处理为好 ;提高反转录的温度有利于长片段 c DNA的合成 ;荧光标记锚定引物、长引物设计和采用高分辨率的电泳系统有利于最大限度的减少 DD- PCR中的假阳性率偏高的问题。结论 DD- PCR方法简便、灵敏、高效 ,完全适用于一般性的基因差异表达研究。

荧光标记mRNA差异显示技术

目的 :应用荧光标记的mBNA差异显示技术。方法 :提取未经过 /经过IFN、LPS处理的三组人单核细胞系U937的总RNA并以此为模板 ,采用荧光标记的锚定引物 ,通过逆转录、差异显示PCR反应 ,经 5 .6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异条带 ,回收后将其再扩增。结果 :三组样本的DD PCR产物电泳显示长 30 0bp～ 2 0kb不等的扩增片段 ,条带清晰、明亮 ,背景低 ,各样本相互间的差异不仅呈有无的变化 ,亦表现出很多强弱改变 ;再扩增条带锐利、单一。结论 :在本试验室成功应用了荧光标记差异显示技术 ,可快速、敏感。

荧光标记mRNA差异显示法研究中药对肝星状细胞基因表达的影响

目的 :用荧光标记 m RNA差异显示方法研究抗纤维化中药作用于肝星状细胞过程中基因表达的变化。方法 :分离培养肝星状细胞 (HSC) ,分别由正常大鼠血清和中药大鼠血清处理 HSC,用荧光标记 m RNA差异显示方法分离中药血清抑制或者诱导 HSC表达的特异基因。结果 :用荧光标记 m RNA差异显示方法共分离得到 c DNA差异片段 4 5条。结论 :荧光标记 m RNA差异显示方法是一种快速、敏感。

利用mRNA荧光差异显示技术规模化筛选棉纤维特异表达基因

以陆地棉 (GossypiumhirsutumL .)品种TM 1开花后 9d、2 1d、2 7d三个不同发育时期的棉花纤维为材料 ,利用mRNA荧光差异显示 (FDD)技术 ,筛选到 10 9个差异显示的cDNA片段。在此基础上 ,结合两轮反Northern杂交筛选和Northern杂交分析 ,获得了多个仅在棉花纤维细胞中特异表达或在纤维中优先表达基因的cDNA片段 ,序列测定和数据库搜索分析表明 ,这些cDNA片段中的多数还未有报道。本工作为克隆上述基因的全长cDNA ,并进一步研究它们在棉纤维发育中的功能奠定了基础。

荧光标记mRNA差异显示技术在分离食管癌相关基因片段中的应用

目的 :以荧光标记的mRNA差异显示技术分离食管癌及其正常食管粘膜组织相关的差异基因片段。方法 :结合GenomyxLRTM DNA测序 /差异显示系统及GenomyxSCTM 荧光图象扫描系统 ,以及配套的FluoroDD和HI EROGLYPHmRNAProfileKit,采用荧光标记的mRNA差异显示技术进行检测。结果 :从人食管癌及正常食管粘膜组织间 ,同时直接分离出了相关的癌基因或抑癌基因片段 74条。结论 :该技术方便、快捷 。

荧光差异显示PCR分离果蝇七氟醚敏感性相关基因

吸入麻醉药是临床上常用的一类全身麻醉药 .为深入研究吸入麻醉药的作用机理 ,以本实验室创建的对七氟醚敏感的果蝇品系 (F PS1 )和耐药 (F PR1 )的果蝇品系为研究模型 ,以野生型黑腹果蝇 (Drosophilamelanogaster)为对照 ,应用荧光mRNA差异显示PCR (fluorescentdifferentialdisplayreversetranscriptional PCR ,fluoroDDRT PCR)方法 ,分离与吸入麻醉药七氟醚敏感性相关的候选基因(EST) .在分离到的 32个差异片段中 ,经Northern印迹杂交鉴定后 ,得到 1个阳性片段 (No .4 1 ) ,其在敏感品系果蝇中表达较高 .通过cDNA末端快速扩增技术 (rapidamplificationofcDNAends ,RACE)克隆和拼接获得了 1 75kb的全长cDNA ,该基因位于Chr2R 4 5F3区域内 ,为一已知序列的新基因 .实验结果与前期工作用遗传学定位方法所得结果一致 ,从而可推测决定七氟醚敏感性的相关基因可能位于果蝇第 2号染色体上 .

单个植入前胚胎mRNA差异显示方法的建立

在已有的研究基础上 ,优化和建立了单个植入前胚胎的mRNA差异显示 (singlepreimplantationembryodifferentialdisplaypolymerasechainraction ,SPEDDRT PCR) .以小鼠单个成熟的卵母细胞和单个的 2细胞期胚胎作为起始材料 ,比较二者之间基因的表达差异 .选择在卵母细胞中不表达而在 2细胞期表达的差异片段 .进行GenBank检索和表达序列标签 (EST)库电子克隆 .与多胚研究方法一样 ,由线粒体编码的和 2细胞特异表达的NADH脱氢酶亚单位 2和ATPase 6证实了SPEDDRT PCR方法是可行而且可靠的 ,是一种需要材料极少。

降低mRNA差异显示技术假阳性率的一种方法

为了探讨降低mRNA差异显示技术假阳性率的方法 ,进一步提高此技术的可靠性 ,提取了手术切除肝癌及非癌肝组织成对标本的总RNA ,逆转录获得cDNA片段 ,以mRNA差异显示方法筛选差异表达基因 ,选取较明显的一条差异表达条带 ,行进一步PCR扩增 .分别对PCR产物及其经TA克隆后随机挑选的 6个单克隆质粒DNA进行序列分析 ,并通过GenBank BLAST数据库进行序列的同源性比较 ,以Northern杂交予以来源确认 .自 72 0余条扩增条带中共选出 2 8条差异条带 .序列分析及同源性比较表明 ,所选择条带的PCR产物为一可能的新基因片段 ;而随机选择的 6个TA克隆质粒DNA中 ,有 4个为同一已知基因片段 ,一个为另一已知基因片段 ,一个为一可能的新基因片段 .同源性比较表明 ,PCR产物直接测序所得序列与TA克隆质粒DNA的 6个片段不具同源性 .结果表明 ,mRNA差异显示条带可能由 1条以上分子量相似的片段构成 ,直接对PCR产物行序列分析并以其为探针进行Northern杂交 ,是导致出现假阳性片段的原因之一 .将PCR产物进行TA克隆 ,对单克隆质粒DNA进行序列分析并以其为探针进行Northern杂交 ,可能是解决此问题的一种较好方法 .

mRNA差异显示技术中差异条带的回收与再扩增

目的：对来源于两种或两种以上组织的ＲＮＡ经反转录和ＰＣＲ后进行比较。方法：采用ｍＲＮＡ差异显示过程中差异条带的回收与再扩增的方法。结果：直接将切下的凝胶条简单洗涤和碾碎后制备的再扩增模板比传统的糖原沉淀法简单有效。结论：再扩增过程中将３０循环的低退火温度的ＤＤＰＣＲ和２０循环的严格条件的ＰＣＲ结合，能获得较高的再扩增效率。

利用荧光差异显示技术分离的家蚕抗NPV相关基因s3a

通过荧光差异显示技术,分析了家蚕Bombyxmori对BmNPV抗性品系NB、感性品系306和近等基因系306NNZZ添毒和未添毒处理区的基因表达的差异。根据差异显示的结果克隆了一条702bp长度的cDNA片段,并用Northernblot进行了验证。该序列经过NCBIEST库的同源性比较获得了电子延伸。延伸后的序列用特异引物进行RT_PCR扩增获得了一条782bp的序列,拼接后基因cDNA序列全长为827bp,推导的氨基酸序列与草地夜蛾SpodopterafrugiperdaS3A同源性最高达97.7%;其次是烟芽夜蛾HeliothisvirescensS3A,同源性为94.0%;与黑腹果蝇DrosophilamelanogasterS3A同源性为75.3%。比较结果显示这是一个新的家蚕基因,定名为家蚕s3a基因。本实验获得的s3a基因在家蚕感性和抗性品系以及添毒处理和未添毒处理中都具有差异表达,其中在抗性品系和近等基因系中的表达高于感性品系,在添毒处理中的表达高于未添毒组。因此推测它是一个与家蚕抗BmNPV相关的新基因。

应用荧光差异显示法对胃癌及癌前病变相关基因的研究

背景与目的:一般认为胃癌是由癌前病变(慢性萎缩性胃炎、肠化生和不典型增生)逐步发展形成的。mRNA差异显示法是筛选肿瘤发生、发展中差异表达基因的有用方法。在胃癌、癌前病变中寻找差异表达的基因将有助于确定胃癌发生前的胃粘膜组织的分子变化。方法:应用荧光mRNA差异显示技术分析胃癌(2例)、癌前病变(2例)和正常胃粘膜(2例)组织,鉴别并分离差异表达的基因片段,进行PCR再扩增。将扩增cDNA片段克隆后进行测序,测序结果提交GenBank,经BLAST软件检索以进行同源性分析。RT-PCR检测血影蛋白基因在胃癌(7例)、癌前病变(7例)和正常胃粘膜(7例)的表达。结果:发现4个差异表达的cDNA片段,其中3个cDNA片段在胃癌中高表达,1个cDNA片段在正常组织和癌前病变组织中高表达。1个在胃癌组织中高表达的cDNA片段与血影蛋白基因(SPTAN1)同源,RT-PCR检测也发现血影蛋白基因在胃癌组织中高表达。另外3个与GenBank中已知的基因序列同源,但其功能目前尚不清楚。结论:所发现的4个差异表达的基因有3个在胃癌组织中高表达,其中SPTAN1基因在胃癌组织的表达比正常胃粘膜及胃异型增生组织表达明显高。

用mRNA差异显示技术分离盐胁迫下小麦耐盐相关cDNA

目的用mRNA差异显示技术分离小麦盐胁迫应答cDNA,为进一步研究小麦耐盐机理奠定基础。方法将小麦(Triticum aesticum L.)耐盐品系宝丰7228r种子分别置于含NaC l 0‰和12‰的Hoagland培养液中生长,7d后分别取叶片,提取总RNA并分离出其中的mRNA,通过锚锭引物O ligo dT10GC反转录和9个10核苷酸随机引物进行PCR扩增。结果DDRT-PCR结果显示,有4个差异DNA片段只在盐胁迫的小麦耐盐品系基因组中表达,而在对照中没有出现。这4个差异cDNA片段分别命名为ts01(260 bp),ts02(330 bp),ts03(420 bp),ts04(600 bp)。4个差异cD-NA片段的RNA杂交结果显示,只有ts04存在明显差异,在盐胁迫条件下有杂交斑点而在对照中没有杂交斑点,其余3个cDNA片段在盐胁迫和对照中都没有杂交斑点。进一步将ts04克隆并进行DNA序列测定及同源性分析。结论ts04可能是耐盐相关cDNA片段,该片段核酸序列与麦属抗性相关的肌动蛋白基因有23%同源。

银染mRNA差异显示方法的条件优化

ｍＲＮＡ差异显示技术是分离差异表达基因的强有力工具。本工作旨在优化无同位素的银染差异显示方法。以总ＲＮＡ为模板，用锚定引物与随机引物的组合进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，ＰＣＲ扩增产物在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。用银染方法显示电泳ｃＤＡＮ条带，其结果是：（１）ＲＮＡ加入量为１～３μｇ，ＲＴ－ＰＣＲ反应能扩增出较多的ｃＤＮＡ条带，而低于０．５μｇ时扩增条带数目较少；（２）在３６～４２℃的范围内，随着温度的增加，扩增的条带减少；而４２℃时扩增的条带数目锐减，特别是当ＲＮＡ加入量小于１μｇ时几乎无条带显示；３６℃扩增的条带过多而趋于ｓｍｅａｒ；（３）优化了银染液程序，染色液和显色液中３７％甲醛的量分别为０．０３％～０．０５％和０．０７５％～０．１％，显色温度４～１２℃时，显示出清晰的条带；（４）用此方法获得数条电针镇痛有效与无效大鼠表达差异的ｃＤＮＡ条带。总之，通过改变参数条件，优化了快速简便的银染ｍＲＮＡ差异显示方法。

用mRNA差异显示技术分析中华绒螯蟹早期发育的基因表达

用中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)未受精卵、受精卵、二细胞胚、囊胚、原肠胚为材料 ,提取总RNA ,分别用OligodT12GA、GC、AC3种锚定引物合成以上5种材料的cDNA第一链 ,然后以此cDNA为模板用30种随机引物进行PCR扩增 ,琼脂糖凝胶电泳分析。得到了5个早期发育的特异表达片段。结果表明 ,未受精卵、受精卵、二细胞胚之间的差异不大 ,都表现为母型调控 ,囊胚期有新mRNA的转录 ,开始进入合子型调控。

萝卜总RNA提取与mRNA差异显示技术

以萝卜幼小花药与叶片为材料,初步建立了mRNA差异显示技术体系.4种提取总RNA方法中,改进的SDS/酸酚法比CTAB/酸酚法和SDS/碱酚法更合适;改进的热硼酸法(HB)提取的RNA质量也较高,但所需时间较长,成本较高.以改进的SDS/酸酚法获得的RNA进行纯化后,其OD260/OD280在2.0～2.2之间,表明RNA样品杂质较少;总RNA进行反转录与差异显示分析表明,高分辨力的cDNA片段在100～380 bp之间.

mRNA差异显示阳性cDNA克隆的快速筛选与鉴定

建立了一种快速筛选差异显示阳性ｃＤＮＡ 克隆的方法， 该方法利用两轮Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 杂交，结合质粒酶切图谱分析，从３０个ＤＤＲＴ差异ｃＤＮＡ片段中筛选鉴定出两个阳性ｃＤＮＡ克隆， 对其中一个克隆进行的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 分析证实了筛选方法的可靠性。