荷包牡丹碱对家蝇GABA受体作用机理探究

[目的]探究荷包牡丹碱对杀虫剂重要靶标GABA受体抑制机理。[方法]基于家蝇Musca domestica GABA受体亚基基因MdRdl在第3外显子(a或b)和第6外显子(c或d)交替拼接产生ac、ad、bc和bd剪接体,采用双电极电压钳技术研究荷包牡丹碱对MdRdl 4个剪接体离子电流的抑制效果,鉴定其敏感性是否与外显子交替拼接有关。并采用分子对接技术分析荷包牡丹碱与家蝇GABA受体的可能结合位点。同时,采用共刺激法验证荷包牡丹碱和GABA受体变构抑制剂溴虫氟苯双酰胺是否存在互作效应。[结果]荷包牡丹碱对MdRdlac、MdRdlbc、MdRdlad和MdRdlbd4个剪接体的IC50分别为1.274、0.948、4.702和3.698 mmol/L;对I274F突变体的IC50分别为15.46、21.67、42.83和52.33 mmol/L;与野生型剪接体相比,4个突变体IC50分别增大约11、22、8和13倍。荷包牡丹碱和溴虫氟苯双酰胺与GABA受体外显子6编码的氨基酸残基存在互作效应。[结论]第274位异亮氨酸残基为荷包牡丹碱与家蝇GABA受体互作的关键靶点,且与外显子6编码的氨基酸残基一起,具有开发协同增效作用的昆虫GABA受体别构抑制剂的潜力。

侧脑室注射荷包牡丹碱、NMDA对依托咪酯所致遗忘作用的影响

目的观察依托咪酯(etomidate,Eto)所致遗忘作用与GABAA受体或NMDA受体的关系。方法小鼠腹腔注射Eto(3 mg.kg-1),建立遗忘模型,在跳台实验和避暗实验中分别观察不同剂量的荷包牡丹碱或NMDA侧脑室注射对遗忘小鼠错误次数(error times,ET)、跳台潜伏期(step down la-tency,SDL)、步入潜伏期(step through latency,STL)的影响。结果侧脑室注射荷包牡丹碱(2、4μg)可减少Eto所致遗忘小鼠的ET,延长SDL和STL。侧脑室注射NMDA对Eto所致遗忘小鼠的ET、SDL和STL均无影响。结论GABAA受体是依托咪酯所致遗忘作用的重要靶位,NMDA受体则不是其作用靶位。

荷包牡丹碱对人肺癌A549细胞生长及端粒酶活性的抑制作用

目的探讨荷包牡丹碱对人肺癌A549细胞生长的抑制作用及其作用机制。方法 A549细胞加入荷包牡丹碱0～200μmol.L-1分别作用24,48和72 h,MTT法测定A549细胞的生长抑制作用。荷包牡丹碱0～20μmol.L-1作用72 h,端粒重复序列扩增(TRAP)法测定端粒酶活性。变温紫外法检测荷包牡丹碱9μmol.L-1对端粒酶G-四链体的稳定作用。结果荷包牡丹碱25,50,100和200μmol.L-1作用细胞72 h后的抑制率分别为33.4%,88.2%,88.6%和89.4%,明显高于正常对照组细胞(P<0.05),并具有量效(r=0.906,P<0.05)和时效(r=0.949,P<0.05)性。与正常对照组相比,荷包牡丹碱5,10,15和25μmol.L-1可有效抑制A549细胞端粒酶的活性(P<0.05),相对TRAP端粒酶活性从正常对照组的1.471±0.102分别降低为1.093±0.054,1.013±0.016,0.554±0.034,0.365±0.081(P<0.05)。荷包牡丹碱9μmol.L-1使G-四链体的熔点值从正常对照组的48℃提高到54℃。结论荷包牡丹碱可以通过稳定G-四链体结构,抑制端粒酶活性,有效抑制人肺腺癌细胞A549的生长。

侧脑室注射蝇蕈醇和荷包牡丹碱对大鼠异氟烷最低麻醉浓度的影响

大鼠侧脑室置管后 2 d,观察 icv GABAA 受体激动剂蝇蕈醇和 (或 )其拮抗剂荷包牡丹碱对麻醉箱内异氟烷最低有效浓度 (反映最低肺泡有效浓度 )和翻正反射恢复时间的影响 .结果表明 icv5mmol· L-1蝇蕈醇 2 μL明显降低箱内异氟烷最低麻醉浓度 ,延长大鼠翻正反射恢复时间 ;icv0 .5mmol·L-1荷包牡丹碱 2μL对异氟烷的最低麻醉浓度和翻正反射恢复时间皆无影响 ,但可部分拮抗蝇蕈醇降低异氟烷最低麻醉浓度和延长翻正反射恢复时间的作用 .以上实验结果提示 ,蝇蕈醇和异氟烷间有协同作用 ,但脑内的 GABAA 受体可能不是异氟烷全麻作用的主要靶位 .

家兔延髓腹外侧区内注射荷包牡丹碱对安定降低心脏功能的影响

家兔48只,用乌拉坦(1g/kg)静脉麻醉,三碘季铵酚制动,在人工呼吸下进行实验。静脉注射安定(0.5mg/kg)以及侧脑室注射氟安定(2mg溶于50μl人工脑脊液中)或γ-氨基丁酸(GABA)(300μg溶于50μl人工脑脊液中)都可降低心室内压峰值(PLVP),减少心力环面积(ACFL)和心室内压最大上升速率(dp/dt_(max))。安定和氟安定对PLVP、ACFL和dp/dt_(max)的抑制作用可被预先在侧脑室注射GABA受体拮抗剂印防己毒素(15μg溶于50μl人工脑脊液中)或双侧延髓腹外侧头端区(γVLM)微量注射GABA受体拮抗剂荷包牡丹碱(3μg溶于0.5μl生理盐水)所阻断。而在延髓网状巨细胞核中间部、网状小细胞核、孤束核或面神经核内注射同样剂量的荷包牡丹碱则不能阻断。 这些结果提示:延髓腹侧部GABA受体的激活可抑制心脏功能,安定对心脏功能的抑制作用可能通过激活延髓腹侧区GABA受体而实现。

左旋荷包牡丹碱对猪冠状动脉条收缩效应的影响

目的观察左旋荷包牡丹碱(L_dicentrine ,L_D)对K +、5_HT、Hist、Ca2 +引起的猪冠状动脉条收缩效应的影响。方法利用猪冠状动脉条的离体实验法,观察对其收缩的影响。结果L_D对K +、5_HT、Hist、Ca2 +诱发的猪冠状动脉平滑肌的收缩有显著的拮抗作用,量效曲线显示:L_D呈现非竞争性拮抗方式。在无Ca2 +液中,L_D能抑制5_HT诱发的猪冠状动脉收缩,说明5_HT对猪冠状动脉依赖细胞内Ca2 +所致的收缩有明显的抑制作用,而对外Ca2 +所致的收缩无明显的影响。结论L_D具有松弛猪冠状动脉条的作用 ,同时也提示冠状动脉平滑肌可能存在5_HT受体。

N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)及荷包牡丹碱对不同年龄蝙蝠下丘神经元听反应的影响

分别对出生后第２周和第４周的中华鼠耳蝠（Ｍｙｏｔｉｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）中脑下丘中央核１２１个听神经元进行了考察，同时与成年动物进行比较。结果表明，微电泳ＮＭＤＡ对下丘中央核绝大部分听神经元（２周龄、４周龄和成年动物分别为９６％、９５％和９６％）具有易化性影响，表现为听反应脉冲发放率增加、反应阈值下降、频率调谐曲线增宽。ＮＭＤＡ的易化性效应部分地与动物的周龄相关，表现为对听反应阈值和听反应脉冲发放率的易化效应在出生后２－４周逐渐增强，但４周以后的易化效应趋缓；微电泳ＧＡＢＡＡ受体的特异性拮抗剂Ｂｉｃｕｃｕｌｉｎｅ，对神经元的听反应也呈现易化性影响，表现为听反应脉冲发放率增加，反应阈值降低和频率调谐曲线增宽等。实验结果还提示，ｂｉｃｕｃｕｌｉｎｅ对下丘神经元听反应的易化作用，在出生后早期呈持续增强趋势。ＮＭＤＡ和ｂｉｃｕｃｕｌｉｎｅ的效应与动物周龄之间的关系略有差异，是否提示着下丘中央核ＮＭＤＡ受体和ＧＡＢＡＡ受体在出生后的发育进程有所差别，尚待进一步探讨。

一叶秋碱和荷包牡丹碱催醒作用的实验研究

目的 分析静脉麻醉药硫喷妥钠、羟丁酸钠、依托咪酯、异丙酚和氯胺酮全麻效应与GABAA 受体的关系。方法 给小鼠分别腹腔注射麻醉剂量的上述药物 ,待小鼠翻正反射消失后 1min ,静脉注射一叶秋碱 5mg kg(0 .1ml 10g)或侧脑室注射荷包牡丹碱 0 .3μg(10 μl) ,对照组分别注射同等剂量的生理盐水或人工脑脊液 ,观察并记录各组的翻正反射消失持续时间。结果 一叶秋碱使依托咪酯的翻正反射消失持续时间由 (12 .8± 7.1)min缩短为 (6 .5± 2 .8)min(P<0 .0 5 ) ,却不能缩短硫喷妥钠、羟丁酸钠、异丙酚和氯胺酮麻醉小鼠的翻正反射消失持续时间 ;而荷包牡丹碱对于上述 5种静脉麻醉药均不能缩短其翻正反射消失持续时间。结论 一叶秋碱对依托咪酯的全麻效应有一定的非特异性拮抗作用 ,但不能拮抗硫喷妥钠、羟丁酸钠和异丙酚的全麻效应 ;荷包牡丹碱对于这 5种静脉麻醉药的全麻效应均无拮抗作用。结果提示 :GABAA 受体GABA位点并非硫喷妥钠、羟丁酸钠、依托咪酯。

L-荷包牡丹碱对大鼠胃底肌条收缩效应的影响

目的 :研究L 荷包牡丹碱 (L D)对 5 HT ,Histamine,K+ ,Ca2 + 引起的大鼠胃底肌条收缩效应的影响。方法 :采用大鼠胃底肌条的离体实验法 ,观察L D对其收缩效应的影响。结果 :L D及罂粟碱 (pap)对 5 HT ,His tamine ,K+ 及Ca2 + 诱发的大鼠胃底肌条的收缩均有显著的对抗作用。呈现非竞争性拮抗。在无Ca2 + 液中两药均能抑制 5 HT诱发的收缩 ,提示两药对胃底肌条依赖细胞内Ca2 + 所致收缩均有显著的抑制 ,当恢复细胞外Ca2 + 浓度后 ,L D对胃底肌条依赖细胞外Ca2 + 的收缩有抑制作用 ,而 pap无影响。 结论 :L D具有松弛胃底肌条的作用。

我校新开教学实验“荷包牡丹碱的分离纯化”的设计

天然药物化学是药学专业的重要的专业必修课程,其配套实验课程设计对于该课程的教学非常重要。云南大学化学科学与工程学院新开了一个天然药物化学教学实验——荷包牡丹碱的分离纯化。本实验通过甲醇超声提取、硅胶柱层析划段和甲醇重结晶三个步骤,即可从云南传统中药地不容中获得纯度较高的荷包牡丹碱。本实验简便、高效且易于操作,适合用于制药工程专业本科生的实验教学。

荷包牡丹碱对受低强度训练的小鸡的记忆形成的影响

在小鸡一次性被动回避行为中，低强度训练的动物其长时记忆保持不良，而训练前１０或２０分钟注射γ－氨基丁酸能颉颃剂荷包牡丹碱，可明显提高长时记忆的保持水平，这一作用可被激动剂蝇蕈碱反转。记忆保持曲线进一步显示，受低强度训练的动物其记忆仅能保持至训练后２０分钟，而注射荷包牡丹碱可使记忆至少延长至训练后１２０分钟。上述结果提示：小鸡的记忆形成受γ－氨基丁酸能系统的调节；γ－氨基丁酸能系统虽然直接参与中时记忆，但对长时记忆的形成似乎也是必需的。

荷包牡丹碱对抗GABA对大鼠束旁核痛兴奋神经元电活动的影响

目的:在64只大鼠上,观察了侧脑室(icv)注射γ-氨基丁酸(GABA)后对束旁核(PF)痛兴奋神经元(PEN)电活动的影响。方法:采用电生理学方法,以电脉冲刺激右侧坐骨神经作为伤害性刺激,用玻璃微电极细胞外记录PF内PEN放电。结果:(1)伤害性刺激可使PF内PEN痛诱发放电频率增加;(2)icv注射GABA(500μg/10μl)抑制PEN的电活动,使PEN诱发放电频率减少,潜伏期延长;(3)这种作用可被icv注射GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱(B ic,10μg/10μl)所阻断。结论:icv注射GABA可使大鼠PF内PEN对伤害性刺激的反应减弱,GABAA受体参与介导这种镇痛作用。

L-荷包牡丹碱对实验性急性心肌缺血缺氧性损伤的保护作用

静脉注射脑垂体后叶素（ＰＰＨ）诱发３０只豚鼠急性心肌缺血及夹闭小鼠气管后引起心肌缺氧，结果：实验组及阳性对照组与对照组比较，各项指标Ｐ值均＜０．０１．结果提示：Ｌ－荷包牡丹碱１０ｍｇ／ｋｇｉｖ和２５ｍｇ／ｋｇｉｐ有较强的抗心肌缺血缺氧效应．

维拉帕米与1－荷包牡丹碱合用对体外KB细胞增殖的影响

低剂量１－荷包牡丹碱和无毒剂量的维拉帕米合用对细胞增殖的抑制作用比单用１－荷包牡丹碱时增强，其半抑制浓度ＩＣ５０值下降到单独应用１－荷包牡丹碱的１／８。联合用药后的细胞集落形成率比单独用１－荷包牡丹碱下降１／３～２０。结果提示维拉帕米能增强荷包牡丹碱对体外ＫＢ细胞的抗癌活性。

大鼠腹腔注射荷包牡丹碱和阿托品对电针镇痛效应及其脑内去甲肾上腺素含量变化的影响

我们以前的研究发现,针刺镇痛时大鼠脑内去甲肾上腺素(NA)含量发生明显变化,而且它与针刺镇痛有密切的关系。许多研究资料也支持中枢 r-氨基丁酸(GABA)和乙酰胆碱(ACh)参与针刺镇痛过程。由于脑内各种神经介质在代谢和功能上存在密切的联系和动态平衡。在本工作中。

腹腔注射蝇蕈醇和荷包牡丹碱对异丙酚小鼠翻正反射的影响

目的 观察腹腔注射γ -氨基丁酸A(GABAA)受体激动剂蝇蕈醇和 (或 )其拮抗剂荷包牡丹碱对异丙酚致小鼠翻正反射消失持续时间及ED50 的影响。方法 ① 40只小鼠随机分为 4组 ,每组 10只 ,分别腹腔注射生理盐水 10ml/kg、蝇蕈醇 0 .5mg/kg、荷包牡丹碱 4mg/kg、蝇蕈醇 0 .5mg/kg +荷包牡丹碱 4mg/kg,15min后静注 2 0mg/kg异丙酚 ,记录小鼠翻正反射消失持续时间。② 5 7只小鼠随机分为 4组 ,如上腹腔注射药物后 ,测定异丙酚使小鼠翻正反射消失的ED50 值。结果 腹腔注射 0 .5mg/kg蝇蕈醇明显延长异丙酚致小鼠翻正反射消失的时间(P <0 .0 5 ) ,并降低ED50 值 (P <0 .0 5 ) ;4mg/kg荷包牡丹碱对异丙酚致小鼠翻正反射消失的持续时间和ED50 值皆无明显影响 ,但可部分拮抗蝇蕈醇对异丙酚麻醉的增强作用。结论 GABAA 受体可能不是异丙酚全麻作用的主要靶位。

左旋荷包牡丹碱对豚鼠胆囊和胆道口括约肌的解痉作用

在豚鼠离体胆囊和胆道口括约肌标本上，左旋荷包牡丹碱（Ｌ－Ｄ）明显拮抗组织胺、Ｃａ２＋、Ｋ＋引起的收缩，呈现非竞争性拮抗．在无Ｃａ２＋液中，Ｌ－Ｄ与罂粟碱相似，能抑制组织胺诱发的收缩，提示两药对胆囊、胆道口括约肌依赖细胞内Ｃａ２＋所致的收缩均有影响．当恢复细胞外Ｃａ２＋后，两药对细胞外Ｃａ２＋所致的收缩无影响．对离体胆道口括约肌，Ｌ－Ｄ对节律性的自发收缩及Ｋ＋引起的两相收缩均能对抗。

荷包牡丹碱对垂体前叶组织块释放促肾上腺皮质激素的刺激效应

本实验利用垂体组织块离体灌流技术，观察到－氨基丁酸Ａ受体拮抗剂荷包牡丹碱对切除双侧肾上腺９６ｈ后的大鼠垂体前叶ＡＣＴＨ的分泌具有强烈的刺激作用。但同样浓度的荷包牡丹碱对分离的垂体前叶细胞的ＡＣＴＨ分泌无影响。提示肾上腺切除后，－氨基丁酸在垂体前叶直接或通过间接途径抑制ＡＣＴＨ分泌。

荷包牡丹碱对抗γ-氨基丁酸对伏核痛反应神经元电活动的影响

目的:探讨γ-氨基丁酸、荷包牡丹碱对正常大鼠伏核内痛反应神经元电活动的影响。方法:实验于2004-05/2005-05在哈尔滨医科大学神经痛觉电生理研究室完成。选用健康、成年Wistar系大鼠50只。随机分γ-氨基丁酸组(20只)和生理盐水对照组(5只);γ-氨基丁酸+荷包牡丹碱组(20只)和生理盐水对照组(5只)。大鼠麻醉后,实施常规手术。将不锈钢套管插入侧脑室供注药用。①γ-氨基丁酸组内匀速注入γ-氨基丁酸(50g/L,10μL);②γ-氨基丁酸+荷包牡丹碱组在注入γ-氨基丁酸后2min,向侧脑室内再注入荷包牡丹碱(1g/L,10μL),用等体积生理盐水作为对照实验。实验采用电生理学的方法,以电脉冲刺激坐骨神经作为伤害性痛刺激。用玻璃微电极记录痛反应神经元放电的变化,并连续观察和记录痛反应神经元的电变化30min。结果:Wistar大鼠50只在实验过程中无脱失值,全部进入结果分析。侧脑室注入γ-氨基丁酸能使正常大鼠伏核中痛兴奋神经元痛诱发放电频率的净增值由注药前的(8.59±1.17)Hz减少至(-1.38±0.51)Hz、潜伏期由(0.17±0.04)s延长至(0.69±0.08)s,而痛抑制神经元的净增值由注药前的(-4.34±0.37)Hz增加至(5.12±1.58)Hz、完全抑制时程由(0.72±0.08)s缩短至(0.27±0.03)s。②侧脑室注入γ-氨基丁酸A受体拮抗剂荷包牡丹碱可对抗γ-氨基丁酸的作用,即痛兴奋神经元的净增值增加到(6.61±1.23)Hz,潜伏期缩短至(0.18±0.08)s;痛抑制神经元的净增值减少为(-1.33±0.21)Hz,抑制时程延长至(0.69±0.06)s。痛兴奋神经元和痛抑制神经元两者相互配合活动。结论:①外源性γ-氨基丁酸可使正常大鼠伏核中痛兴奋神经元和痛抑制神经元对伤害性刺激的反应均减弱,表现出镇痛效应。②γ-氨基丁酸的镇痛作用主要是通过γ-氨基丁酸A受体介导的。γ-氨基丁酸和伏核在痛觉调制中具有重要的作用。③荷包牡丹碱可对抗γ-氨基丁酸的作用。