富硒荷叶离褶伞菌丝体中蛋白质提取工艺优化及氨基酸组成分析

以20 L生物发酵罐培养的富硒荷叶离褶伞菌丝体为原料,对菌丝体中蛋白提取工艺进行优化,并分析硒的富集对荷叶离褶伞菌丝体中氨基酸种类和含量的影响。利用单因素实验和Box-Benhnken中心组合响应面试验法,优化了荷叶离褶伞菌丝体中硒蛋白提取工艺,采用3,3'-二氨基联苯胺分光光度法测定蛋白质中硒的含量,并通过氨基酸测定仪分析测定富硒前后的菌丝体蛋白中氨基酸量的变化。结果表明,荷叶离褶伞菌丝体中硒蛋白的最适提取条件为:提取温度64℃、提取时间60 min、液料比200:1 mL/g、提取次数2次,经过验证性试验,测得蛋白提取率为75.13%,菌丝体中富硒量达到63.87μg/g。采用氨基酸测定仪分析氨基酸的组成,并通过氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)指标对富硒荷叶离褶伞菌丝体蛋白质进行初步营养价值评价。富硒荷叶离褶伞菌丝体中蛋白质中氨基酸种类齐全,人体必需氨基酸含量为17.20 g/100 g,较未富硒的高出19.75%,必需氨基酸/非必需氨基酸(EAA/NEAA)为0.51,接近WHO提出的推荐值,AAS和CS的值接近于模式蛋白。说明经过工艺优化可以提高蛋白质提取率,在富硒菌丝体蛋白质中含有硒,硒促进了氨基酸含量的增加,富硒菌丝体中蛋白质的营养价值较未富硒菌丝更高,富硒菌丝体具有潜在的食用和应用价值。

Box-Behnken响应面法优化荷叶离褶伞液体发酵培养基

为了优化菌丝培养基以期提高菌丝生物量和氨基酸产量,以荷叶离褶伞菌丝体为试验材料,以生物量和氨基酸含量为指标,利用Box-Behnken响应面法优化液体发酵培养基。试验结果表明:液体发酵最优培养基配方为马铃薯200 g/L、葡萄糖25 g/L、麸皮7.75 g/L、KH 2PO 41.5 g/L、MgSO 41.62 g/L;每100 mL液体培养基可得菌丝体生物量为1.096±0.025 g,菌球大小均匀、菌球浓密,且优化后的菌丝体总氨基酸含量提高了23.9%,子实体总氨基酸含量高达17.06%。优化培养基可用于荷叶离褶伞液体发酵工厂化生产。

荷叶离褶伞遗传差异性分析及菌丝形态鉴定

【目的】比较荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes,Lyd)外地引进菌株与本地栽培菌株的遗传差异性和菌丝形态特征,为荷叶离褶伞选育提供参考。【方法】以真菌18S rRNA(V4)和ITS(ITS1–ITS4)(18S rRNA-ITS)序列对外地引进和本地栽培的荷叶离褶伞进行序列同源性分析、多重序列比对和构建系统发育进化树,通过分析碱基序列突变和遗传距离远近明确荷叶离褶伞菌株间的亲缘关系,并通过菌丝体生长及形态变化确定荷叶离褶伞的遗传学差异。【结果】18S rRNA-ITS序列比对结果显示,外地荷叶离褶伞菌株(Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、LydLR15和Lyd-LR17)发生较高比例的碱基缺失和碱基替换突变,且ITS序列同源性下降至80.09%~89.72%;LydLR1和Lyd-LR6菌株的碱基突变比例高于Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17以及福建本地栽培菌株(Lyd-LRX和LydLRY)。进化树分析结果进一步显示,Lyd-LR1和Lyd-LR6与Lyd-LR10、 Lyd-LR15、 Lyd-LR17、 Lyd-LRX、 LydLRY以及NCBI已经登录的部分荷叶离褶伞或离褶伞(Lyophyllum,Ly)菌株有较远的遗传距离和亲缘关系。LydLR1梭子状菌丝生长较慢且不规则生长,菌丝体呈松散放射状;Lyd-LR6凹陷状菌丝生长较快且明显聚合生长,菌丝体呈平铺状且边缘厚度较高。Lyd-LR1和Lyd-LR6菌株的菌丝体生长速度和菌丝形态均不同于Lyd-LR10、LydLR15、Lyd-LR17、Lyd-LRX、Lyd-LRY菌株圆柱形饱满的菌丝和厚度高生长快的突起状菌丝体。而与Lyd-LR1菌株相比,Lyd-LR6菌株的碱基序列突变位置、碱基突变比例和菌丝形态发生的变化更明显。【结论】外地荷叶离褶伞菌株Lyd-LR6的基因序列碱基突变位置(碱基替换和碱基缺失)、18S rRNA-ITS序列同源性和种属亲缘关系明显区别于其他外地及本地的荷叶离褶伞菌株。高比例的基因序列碱基突变造成Lyd-LR6菌株的菌丝体生长速度和菌丝形态发生明显改变,可作为选育荷叶离褶伞新菌株的材料。

荷叶离褶伞生物学特性研究

荷叶离褶伞菌丝生长的温度范围是5—35℃，最适温度19℃；0—3℃的温差有利于子实体的分化，最适温度25℃；子实体分化的温度范围13—22℃，温差大于9℃子实体不能形成；孢子萌发的温度范围是10-25℃，最适温度20℃；菌丝能在pH4—11范围内生长，最适pH4—5；菌丝和孢子的致死温度分别是45℃30min和50℃15min。能利用淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、玉米粉、乳糖和甘露糖作碳源，但蔗糖和葡萄糖为碳源生长势强，果糖生长势弱；甘氨酸、蛋白胨、硫酸铵、黄豆粉、硝酸铵、谷氨酸和麦麸均可作为氮源，在麦麸上生长速度快，长势旺盛；硫酸铵、硝酸铵和谷氨酸虽能作为氮源，但长势很弱；能在C／N15／1-50／1的范围内生长，C／N为50／1时生长速度最快。在完全黑暗的条件下不能形成子实体，连续光照和12h光暗交替两种处理都可形成子实体，且两种处理间差异不显著。

荷叶离褶伞菌丝体深层发酵及胞内外多糖含量的变化

研究了发酵时间对荷叶离褶伞菌丝体深层发酵及胞内外多糖含量的动态变化。结果表明,在25℃恒温、连续发酵13d期间,荷叶离褶伞菌丝生物量和胞内多糖含量在前11d内均与发酵时间呈极显著(p<0.01)的正相关,并在第11d时分别达到最大值11.96mg/mL和1.58mg/mL,分别是发酵前的约7倍和12倍;胞外多糖和还原糖含量分别在前3d和12d内与培养时间呈极显著(p<0.01)的负相关,且分别在第3d和12d时下降到最低值0.046mg/mL和0.132mg/mL,分别是发酵前的约4%和16%。这些结果说明,11d的发酵时间对荷叶离褶伞菌丝体生长及胞内多糖积累最为合适。

荷叶离褶伞中试发酵条件与培养基优化研究

在荷叶离褶伞菌丝体摇瓶发酵条件研究结果的基础上,采用均匀设计,在200L发酵罐中,对荷叶离褶伞中试发酵条件与培养基配方进行了优化研究,结果表明荷叶离褶伞菌丝体中试发酵的最佳条件为搅拌转速160r/min、罐压0.2MPa、通气量80L/h、pH值为6.5、温度20℃、接种量10%;最佳培养基配方为玉米面5%、大豆0.5%、ZnSO4 0.025%、MgSO4 0.05%、KH2PO4 0.05%。发酵至第8d菌丝体生物量达到最大(10.578g/L),第9d胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)产量最大(1.212g/L)。

荷叶离褶伞可溶性多糖提取工艺研究

对荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes Sing)可溶性多糖的提取工艺进行了研究,通过正交设计和方差分析确定了多糖的最佳提取条件。结果表明:时间和温度对荷叶离褶伞多糖的提取影响较大,其最佳工艺为温度85℃、pH9.0、料液比1∶15、提取时间1.5h,用苯酚-硫酸法测定最佳提取工艺条件下固形物中多糖含量为65.52%。

荷叶离褶伞分离驯化研究

试验表明,PDA 培养基和金露梅葡萄糖琼脂培养基适宜对荷叶离褶伞进行组织分离和孢子分离;孢子分离获得的菌种之生长速度显著快于组织分离获得的菌种;在10～25℃的温度范围内两种分离方法都可获得成功,最适温度25℃;适宜原种与栽培种生长的配方为小麦89%、麦麸10%、葡萄糖0.5%、过磷酸钙0.5%;用棉籽壳75%、高粱12%、麦麸12%、白糖0.5%、过磷酸钙0.5%这一配方进行瓶栽,生物学效率为47.5%,显著高于其他配方和袋栽。

荷叶离褶伞菌株的ITS鉴定及生物学特性研究

为更好地开发利用荷叶离褶伞,以1株离褶伞属野生菌为研究对象,通过分子生物学鉴定及测定菌丝生长速度、菌丝干重和生长势等指标,研究其生物学特性。结果表明该菌经鉴定为荷叶离褶伞,其菌丝生长的最适碳源为麦芽糖,最适氮源为大豆蛋白胨,最适碳氮比为30/1,最适生长因子为维生素B6,最适生长温度为20℃,最适pH为6.0。研究结果可为荷叶离褶伞生产栽培提供一定的理论依据。

荷叶离褶伞菌丝体富硒条件的研究

为获得荷叶离褶伞富硒菌丝体,以菌丝体干重和富硒率为评价指标,研究灭菌条件、培养时间、硒添加量和硒添加时间对荷叶离褶伞菌丝体生长及其富硒效果的影响。采用L9(34)正交实验优化荷叶离褶伞菌丝体富硒条件,结果表明当灭菌条件为115℃、20min,于发酵至第5d在发酵液中加入4μg/mLNa2SeO3,待发酵至13d时,菌丝体干重量和富硒量分别为0.8232g/100mL和0.7040mg/g,由此确定上述条件为荷叶离褶伞菌丝体的最优富硒发酵条件。

富硒荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖提取工艺的优化及红外光谱分析

以20 L生物罐发酵培养的富硒荷叶离褶伞菌丝体为原料,优化菌丝体中硒多糖的提取工艺并通过红外光谱对水溶性硒多糖的结构进行分析。通过单因素试验和Box-Behnken试验设计方法得到硒多糖的最佳提取工艺条件:提取时间为50 min、提取温度83℃、料液比1∶130(g∶m L)、提取次数2次。测得多糖提取率为44.62%,较预测值增加0.02%,此时多糖中硒含量达到31.9μg/g。将纯化后的硒多糖进行红外光谱分析,富硒未改变水溶性硒多糖的主体结构,但吡喃环的吸收峰发生了改变,说明在荷叶离褶伞菌丝体富硒培养过程中,硒参与了硒多糖的合成。

荷叶离褶伞液体发酵及生物酶法提取菌丝体多糖的研究

首次利用10 L发酵罐研究了荷叶离褶伞菌丝生长、胞内和胞外多糖产量,以及6种酶对发酵菌丝体多糖的提取效果。结果表明,在25℃、120 r/min,空气流量为200 L/h的条件下发酵,8 d时胞内多糖含量(63.1 mg/g干菌丝体)和胞外多糖产量(3.54 g/L)达最高,9 d时菌丝体产量(17.86 g/L)及胞内多糖产量(1.11 g/L)达最高,与摇瓶发酵相比,其产量均显著提高。参试的6种酶中,溶壁酶酶解处理菌丝体获得的多糖产量最高,而中性蛋白酶是最经济适宜的酶类,与不加酶的水提法相比,多糖提取率分别提高了459.29%和376.11%,中性蛋白酶酶解制备菌丝体多糖的适宜条件为:在1%酶用量下,30℃酶解2 h后,95℃提取2次,每次2 h。

诱变选育高产多糖荷叶离褶伞新菌株

以荷叶离褶伞ZY48-1为出发菌株,通过原生质体紫外诱变,筛选高产多糖菌株。结果表明,原生质体制备再生的最佳条件为:0.6mol/L蔗糖稳渗剂、1%溶壁酶+0.5%蜗牛酶混合酶液、菌龄72h、30℃酶解2.5h,原生质体得率为5.76×105个/mg,原生质体再生率为7.81%;筛选到突变菌株ZY481-1,多糖含量643.1961mg/g,较出发菌株高出31.05%。经10次传代,多糖含量保持稳定。

荷叶离褶伞高产漆酶菌株选育及其漆酶酶学特性

应用原生质体紫外诱变,对一株产漆酶荷叶离褶伞（Lyophyllum decastes）菌株紫外诱变,用愈创木酚马铃薯葡萄糖固体平板变色法初筛,然后用ABTS[2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐]测定漆酶活性进行复筛,获得1株漆酶高产诱变菌株HY1022-01;对HY1022-01所产漆酶粗酶液酶学特性进行研究,结果表明,HY1022-01所产漆酶最大酶活力比出发菌株提高30.32%,最适条件下酶活达991.67 U/mL,且产酶稳定;HY1022-1所产漆酶最适作用温度为35℃,在30∽35℃较为稳定;最适反应pH值为3.0,pH在2.2∽3.8较为稳定,ABTS的漆酶动力学常数为72.622μM。

祁连山荷叶离褶伞菌丝体LML的分离纯化及其凝血活性检测

以荷叶离褶伞茵丝体为材料，利DEAE—Sepharose F．F．色谱和sephadexG-100色谱技术，分离获得新的LMLLML。根据凝胶过滤色谱和SDS—PAGE电泳结果，确定LML是中性糖含量为10．36％、分子量约为48．2ku单亚基糖蛋白。凝血活性检测结果表明，LML对兔血红细胞具有凝聚活性，这种活性在LML浓度为500μg/mL、温度为20～70℃、pH3～10的条件下稳定；其凝血活性可被葡萄糖（最小浓度为25mmol／L）和麦芽糖（最小浓度为12．5mmol／L）所抑制；当LML浓度≥250μg／mL时，其凝血活性不受Ca^2＋、Mg^2＋和Zn^2＋的影响。

荷叶离褶伞发酵液制作保健饮料的工艺研究

为降低生产成本、提高荷叶离褶伞产品的附加值,以黄豆、玉米粉为主要原料,分别经中性蛋白酶与α-淀粉酶液化,然后将荷叶离褶伞菌接种于以豆浆、玉米汁为天然培养基的原料发酵培养,得到荷叶离褶伞豆浆玉米汁发酵液。以此发酵液为主要配料进行保健饮料研制,优化得到荷叶离褶伞饮料配方为发酵液40%、柠檬酸0.12%、羧甲基纤维素钠0.02%、白砂糖4%,在饮料中添加1%蜂蜜可增加饮料香气。各组合之间的感官质量得分差异显著,不同组合间有明显的交互作用。

原生质体诱变选育高产多糖荷叶离褶伞菌株

研究了菌龄、渗透压稳定剂、酶系统、酶解时间等条件对荷叶离褶伞原生质体制备的影响,通过紫外线诱变技术筛选得到1株高产多糖的菌株。结果表明,原生质体制备最适菌龄为4 d,渗透压稳定剂为0.6 mol/L甘露醇,使用1%溶壁酶+1%蜗牛酶组合在30℃酶解2.5 h,原生质体产量可达1.38×107个/m L,再生率为1.27%。经诱变、筛选和遗传稳定性分析,获得1株多糖含量较出发菌株提高34.49%的突变菌株。

硒对荷叶离褶伞菌丝体胞外粗多糖的影响及发酵条件优化

以亚硒酸钠为无机硒源,研究硒的加入对荷叶离褶伞菌丝体胞外粗多糖的影响并优化其发酵条件,选择培养基灭菌条件、添加硒浓度、发酵时间和初始pH值作为优化因素,研究硒在各因素不同水平下对荷叶离褶伞胞外粗多糖含量的影响。通过单因素试验和响应曲面法得到最佳发酵条件:在121℃,20 min对培养基进行灭菌,发酵液中添加2μg/m L Na_2SeO_3,发酵244 h,培养基初始pH值为7.0的条件下,发酵产生的胞外粗多糖含量为0.760 g/100 m L,较未加入硒(0.218 g/100 m L)和加硒未优化前的含量(0.755 g/100 m L)有所提高。研究结果表明,响应曲面法优化富硒荷叶离褶伞发酵条件可使胞外粗多糖含量大幅度提高。

荷叶离褶伞菌丝体多糖的提取及还原力的研究

荷叶离褶伞是一种具有药用功能的名贵珍稀食用菌。本试验以液体深层发酵法培养荷叶离褶伞,采用热水浸提法从菌丝体中提取多糖,用硫酸-苯酚法显色,在540 nm处运用分光光度计测其吸光度值,计算多糖提取率;利用单因素和正交试验对离褶伞菌丝体多糖的提取工艺进行研究,并对其还原能力进行了研究。结果表明,影响荷叶离褶伞菌丝体多糖提取率因素的主次关系是浸提温度>浸提时间>料液比>乙醇体积分数。荷叶离褶伞菌丝体多糖提取最优工艺条件是粉碎度100目、浸提温度90℃、料水比1∶80(g.mL-)1、浸提时间2 h、添加3倍95%乙醇醇沉。苯酚-硫酸法测定此最佳提取工艺条件下粗多糖得率可达4.23%。多糖的还原能力均随着多糖质量浓度的提高而提高,与抗坏血酸Vc相比,荷叶离褶伞多糖的还原力较弱。

荷叶离褶伞摇瓶发酵条件研究

采用摇瓶发酵法对荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)发酵条件进行研究.结果表明:荷叶离褶伞菌丝体生长的最适碳源为玉米面;最适氮源为麸皮;最适碳氮比为16:1;最佳培养基配方为玉米面200g/L,蔗糖15g/L,麸皮35g/L,酵母膏1.5 g/L;最适发酵条件:pH值7.0,温度26℃,接种量10%,转速160r/min;稳定生长期为接菌后6-8d.