强致腐性猪肉源莓实假单胞菌的分离与大蒜精油对其抑菌机制

为探究莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)对猪肉的致腐作用及大蒜精油抑菌作用机制,通过分离有氧贮藏条件下冷鲜猪肉中的莓实假单胞菌并测定其致腐能力,选择致腐能力强的莓实假单胞菌作为实验菌株;通过测定最小抑菌浓度和生长曲线评价大蒜精油的抑菌活性;通过扫描电子显微镜观察、细胞膜通透性、菌体运动能力和细胞代谢活力探究大蒜精油的抑菌机制。结果表明:莓实假单胞菌是导致猪肉腐败的微生物之一;大蒜精油对猪肉源莓实假单胞菌有较好的抑制作用,最小抑菌浓度为0.125μL/m L;大蒜精油能破坏莓实假单胞菌正常菌体结构形态,增加细胞膜通透性、抑制代谢活力和菌体运动能力。研究结果为大蒜精油作为天然食品防腐剂应用提供了理论依据。

草莓酸对莓实假单胞菌群体感应的抑制作用

目的:利用报告菌株紫色杆菌探究草莓酸的群体感应抑制性及其对莓实假单胞菌的群体感应作用。方法:利用细菌凋亡率、气相色谱-质谱分析、生物膜的抑制效果、胞外聚合物生成量以及观察细菌的群集和泳动等参数,来研究草莓酸对莓实假单胞菌群体感应的抑制效果。结果:草莓酸的最小抑菌浓度(MIC)为0.5 mg/mL,亚抑菌浓度下草莓酸虽然降低了菌株CV026产生紫色素的能力,但对细胞凋亡没有任何影响。通过气相色谱-质谱定量检测发现莓实假单胞菌所产的群体感应信号分子是C8-HSL和C10-HSL,草莓酸对信号分子的分泌产生抑制效果。在亚抑菌浓度下草莓酸对莓实假单胞菌的生物被膜形成量为21.06%,细菌的群集和泳动的抑制率分别降低34.06%和75.02%,且呈现质量浓度依赖性。结论:草莓酸具有较好的群体感应抑制性,可以作为水产保鲜中的群体感应抑制剂。

冷藏条件下肉源莓实假单胞菌nuoB对其生物被膜形成和细胞代谢的影响

【目的】研究nuoB对莓实假单胞菌生物被膜形成和细胞代谢的影响,进一步揭示nuoB对莓实假单胞菌介导的冷鲜肉腐败的调控机制,为优化冷鲜肉保鲜体系提供理论基础。【方法】以莓实假单胞菌NMC25野生株和nuoB突变株作为研究对象,利用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察生物被膜空间结构的差异;通过菌落细胞计数、胞外聚合物的表征解析生物被膜组分变化;基于超高效液相色谱联合质谱的非靶向代谢组学方法探寻与nuoB相关的代谢产物水平变化。【结果】CLSM显示,原位条件下野生株生物被膜细胞呈现密集排列、垂直化定殖的状态,而ΔnuoB生物被膜显示为相对无序、松散的结构。菌落中细胞计数结果显示,不同生长环境下的野生型菌株和突变型菌株的生物被膜细胞数量均无显著性差异,表明突变株在TSA或肉表面上以生物被膜形式生长的能力没有发生大的变化。与野生株相比,原位培养时突变株的蛋白质(P<0.01)和总糖(P<0.05)含量都显著升高,表明nuoB影响了莓实假单胞菌胞外聚合物的分泌。代谢组结果显示,野生组与突变组在正交偏最小二乘法判别分析模型中有明显的分离(R^(2)X=0.481,R^(2)Y=0.977,Q2=0.909),说明原位培养时突变株的代谢产物发生了明显变化。模型中组间差异显著的代谢物包括2-羟基肉桂酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、DL-色氨酸、17-羟基-二十碳四烯酸、5-OxoETE等。这些代谢物经过通路分析后发现,它们主要与脂肪酸的生物合成、不饱和脂肪酸的生物合成、核黄素代谢、2-氧代羧酸代谢、嘌呤代谢、氰基氨基酸代谢、苯丙氨酸代谢等有关。【结论】nuoB的破坏会导致莓实假单胞菌原位培养时生物被膜空间结构发生变化,促进胞外聚合物的生物合成,影响细胞内碳代谢、核苷酸代谢、脂质代谢和氨基酸代谢。

鱼源莓实假单胞菌生长动力学与碳源利用分析

以鱼源莓实假单胞菌为研究对象,利用BIOLOG获得15、25、33℃下其GEN III板中碳源生长数据,采用修正的Gompertz模型,结合孔平均颜色变化率及利用面积,分析其碳源利用效果,并对3个温度下pH值、NaCl和乳酸钠(NaL)的抑菌效应和生长动力学进行研究。结果表明,25℃时莓实假单胞菌总体碳源利用能力和活性最强,15℃时次之,33℃时最弱。在15~33℃内,碳源利用以糖类、羧酸类和氨基酸类为主。糖类中利用较好的有α-D-葡萄糖、L-岩藻糖等;氨基酸类中利用较好的有L-焦谷氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸;羧酸类中利用较好的有奎宁酸、D-葡糖酸、糖质酸等。15~25℃下4%~8%NaCl及33℃下1%~8%NaCl对莓实假单胞菌皆有抑制作用。33℃时pH值对莓实假单胞菌生长起抑制作用,1%的NaL对其具有促进作用。通过对莓实假单胞菌抑菌效应和碳源利用分析,可为优化产品配方和保障产品质量提供理论依据。

芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌活性及机制

食品在生产、运输和贮藏过程中易受致病菌污染而引起食源性疾病。芳樟醇具有抗菌作用,但其作用机制尚不明确。研究芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌活性及作用机制,可为其作为天然食品防腐剂的开发提供理论依据。通过测定最小抑菌浓度、绘制细菌生长曲线评价芳樟醇的抑菌活性;通过扫描电子显微镜观察、结晶紫染色实验、二乙酸荧光素染色实验以及测定电导率、核酸泄漏、呼吸代谢活力和呼吸链脱氢酶活性的变化探究芳樟醇的抑菌机制。结果表明:芳樟醇对莓实假单胞菌具有较强的抑制作用,最小抑菌浓度为1.5 mL/L;芳樟醇能破坏莓实假单胞菌细胞的结构形态和细胞膜的完整性,增加细胞膜的通透性,导致胞内物质泄漏、膜外电导率升高;能抑制呼吸代谢活力和呼吸链脱氢酶活性,破坏呼吸链,导致胞内代谢紊乱。研究认为,芳樟醇可通过破坏莓实假单胞菌的细胞结构和抑制其呼吸代谢而发挥抑菌作用,有望作为天然防腐剂应用于食品的防腐保鲜。

冷鲜鸡肉中莓实假单胞菌NMC25的全基因组测序及分析

通过PacBio RS Ⅱ测序平台,对在腐败冷鲜鸡肉中分离到的1株莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi NMC25)进行基因组完成图测序,并对测序数据进行组装、基因预测和功能注释。同时与已公布全基因组序列的铜绿假单胞菌PAO1(P. aeruginosa PAO1)、恶臭假单胞菌KT2440(P. putida KT2440)和荧光假单胞菌F113(P. fluorescens F113)及另外2株莓实假单胞菌分离株(P121和NRRLB-727)进行初步比较基因组分析。结果显示NMC25菌株基因组大小为5.152 13 Mb,GC含量为59.21%,包含1个染色体和3个质粒。通过对COG、GO、KEGG和CAZy数据库的比对分析发现基因组中包含大量致腐相关基因。比较基因组结果表明莓实假单胞菌NMC25与其他3种假单胞菌的共线性序列比例较小,而同种之间与P. fragi P121的共线性比例也不足70%,说明不同环境来源的莓实假单胞菌分离株基因组存在较大差异。本研究结果从基因水平上证明了莓实假单胞菌NMC25确实有较强的致腐潜力,有助于深入了解莓实假单胞菌的代谢特征,为今后阐明其对冷鲜鸡肉的致腐机制提供理论支撑。

莓实假单胞菌产低温胆固醇酯酶发酵条件优化

为了提高莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)Q-06产低温胆固醇酯酶的能力,在单因素试验基础上,结合Plackett-Burman设计和最陡爬坡试验确定影响酶活的3个显著影响因子为葡萄糖添加量、摇瓶装液量、培养温度,确定最优发酵培养基配方为葡萄糖3.0%,酵母粉1.3%,(NH4)2SO40.010%,MgSO4·7H2O 0.050%,KH2PO40.400%,运用Design-Expert软件Box-Behnken试验设计对P.fragi Q-06发酵产生甾醇酯酶的培养基条件和发酵条件进行优化。结果表明,最适发酵条件为温度28℃,转速180 r/min,接种量4%,初始pH 7.5,装液量80 mL/250 mL。在此最佳条件下,甾醇酯酶酶活由优化前360.00 U/L提高至479.64 U/L,是优化前的1.33倍。海洋微生物发酵甾醇酯酶工业化生产有望创造可观的经济效益,具有潜在的研究开发价值。

nuoB对莓实假单胞菌生理特性及在冷鲜鸡肉中致腐能力的影响

【目的】研究nuoB对莓实假单胞菌菌体特性及其对冷鲜鸡肉致腐能力的影响,为揭示nuoB介导的冷鲜鸡肉腐败机制,开发新型保鲜技术提供理论依据。【方法】通过构建nuoB插入失活突变株,对比野生株和突变株在体外培养条件下的生长曲线、聚集性、泳动性和生物被膜形成能力;以及原位培养条件对冷鲜鸡肉的致腐特征,包括菌落总数、挥发性盐基氮(TVBN)含量、pH和感官评分,探讨nuoB对莓实假单胞菌生理特性和致腐作用的影响。【结果】体外培养条件下,nuoB并未影响莓实假单胞菌的生长能力、聚集性和swarming泳动性,但突变株的swimming泳动性和生物被膜形成能力在培养过程中显著下降。原位条件下,对冷鲜鸡肉致腐能力的评估发现两组样品菌落总数差异不显著,均达到了10 lg CFU·g^(-1);突变株组在冷鲜鸡肉储藏期间TVBN均显著低于野生株组,在第4天时才超过国家标准限量15 mg/100 g,培养末期的最大值约为野生株组的1/2;培养前2 d所有样品的pH均处于正常范围内,突变株组的pH从培养第5天开始显著低于野生株组;感官评价结果显示培养第4天时的两组样品均出现了黏液和异味,被判定为腐败,但突变株组样品稍弱于野生株组。【结论】nuoB的破坏没有影响莓实假单胞菌的生长能力,但抑制了菌株的泳动性、生物被膜形成和对冷鲜鸡肉的致腐能力。

芳樟醇对三文鱼源莓实假单胞菌的抑菌机理

本研究应用高通量测序技术分析不同贮藏期三文鱼的菌相变化,并分离、纯化、鉴定出1株4℃贮藏环境下三文鱼的优势腐败菌--莓实假单胞菌MS 02(Pseudomonas fragi MS 02)。再以分离出的莓实假单胞菌MS 02为靶标菌,深入探究芳樟醇对其抑菌性能及其抑菌机理。结果表明:4℃贮藏三文鱼的菌相呈现动态变化的趋势,其中发光杆菌属、假单胞菌属、青枯菌属和不动杆菌属细菌在三文鱼贮藏中占主要地位。随着贮藏时间的延长,假单胞菌属的相对丰度逐渐增大,而莓实假单胞菌是三文鱼在贮藏期间增长速率最快的菌种。以分离鉴定出的莓实假单胞菌MS 02为研究对象,发现芳樟醇对其具有良好的抑菌效果,扫描电子显微镜观察结果表明芳樟醇能使细菌细胞膜产生凹陷褶皱,而电导率、OD_(260 nm)、二乙酸荧光素荧光强度和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)、钠钾ATP酶活力测定结果证明芳樟醇能破坏莓实假单胞菌的细胞膜和细胞壁的通透性和完整性,进而影响细菌细胞正常能量代谢,最终导致菌体死亡。

冷冻鸡肉中耐冷菌的分布及对优势菌的控制

本项目以市售的冷冻鸡腿、冷冻鸡翅和冷冻鸡爪为研究对象,评价冷冻鸡肉的微生物污染,分析其中耐冷细菌分布的多样性。结果表明,冷冻鸡爪的微生物污染最严重,可达10~5 CFU/g。从三种鸡肉样品中共分离得到100株耐冷细菌,其中假单胞菌属(Pseudomonas sp.)占49%,嗜冷杆菌属(Psychrobacter sp.)和沙雷氏菌属(Serratia sp.)分别占13%和12%。在假单胞菌属中,莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)达到了61%。对冷冻鸡爪中分离得到的30株细菌,通过构建系统发育树,确定分类地位。进一步选择了一株莓实假单胞菌(P.fragi 30-1),研究其生长特性,并对其进行抑菌试验。结果证明P.fragi 30-1具有较强的耐冷性,最大能耐受2.5%NaCl,适宜在p H 6~8的环境中生长。氯霉素、罗红霉素以及茶多酚对P.fragi 30-1均有较好的抑菌作用,最小抑菌浓度(MIC)分别为0.31 mg/mL,0.62 mg/mL和0.62 mg/mL。本研究为了解冷冻鸡肉的安全性提供基础,也为P.fragi的污染控制提供方向。

耐低温菌株的鉴定、低温生长特征及耐低温机理初步研究

该研究以分离自长白山常年积雪覆盖的苔原带土样的耐低温菌株7a-3为研究对象,采用形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并对其生长特性及耐低温机制进行初步研究。结果表明,菌株7a-3被鉴定为莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi),其生长温度范围为4~33℃,最适生长温度为30℃,表面活性剂不能促进该菌株在37℃条件下生长,但其自身低温发酵代谢物可促进该菌在37℃条件下生长。相对于30℃,4℃条件下,菌株7a-3细胞膜的脂肪酸种类由长链脂肪酸向短链脂肪酸转化,不饱和脂肪酸的相对含量增加,且单不饱和脂肪酸相对含量的变化较大,细胞膜较为粗糙,初步推测其耐低温能力与细胞膜不饱和脂肪酸含量增加导致细胞膜流动性增强相关。