莱克多巴胺单克隆抗体非亲和层析法纯化研究

抗体纯化对免疫测定和生物偶联的灵敏度、重现性和稳定性具有重要影响。本文对硫酸铵沉淀法(Ammonium sulfate precipitation,AS)及AS分别与阴离子交换层析法(Anion exchange chromatography,AEC)、阳离子交换层析法(Cation exchange chromatography,CEC)、疏水作用层析法(Hydrophobic interaction chromatography,HIC)和陶瓷羟基磷灰石法(Ceramic hydroxyapatite,CHT)联合应用纯化腹水来源的莱克多巴胺单克隆抗体(Ractopamine monoclonal antibody,RAC-mAb)进行了研究。优化缓冲液pH、盐浓度及层析介质,分别采用Bradford法、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、间接竞争酶联免疫吸附试验(Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)和胶体金免疫层析技术(Colloidal gold immunochromatography,CGIC)对抗体纯化后回收率、纯度及生物学活性进行评估。结果显示,采用AS+AEC法纯化抗体回收率高、纯度和生物学活性好,抗体回收率为40.1%,纯度为75.1%,经icELISA平行测定3次所得灵敏度(IC_(50))最佳为1.73±0.22 ng/mL,CGIC测定其在PBS及猪尿样本添加cut-off值分别为5 ng/mL和60 ng/mL。本研究为单克隆抗体纯化提供了理论参考和必要的实验基础。

莱克多巴胺胶体金免疫层析试纸条的研制及性能测试

本实验用胶体金标记RAC单克隆抗体构建一种能够快速检测RAC的免疫层析试纸条,通过正交试验优化试纸条中标记pH、抗体的量、NC膜上RAC抗原及羊抗鼠抗体划线的浓度等因素得到最佳组合,并测定试纸条的特异性、稳定性、检测时间和检测限。结果表明:经过优化后得到的最佳组合为pH=6,标记抗体的量4μg,RAC抗原及羊抗鼠抗体的浓度分别为0.8 mg/mL和1.0 mg/mL;该试纸条可在5 min内特异性地检测RAC,检测限为2 ng/mL,在室温条件下能保存12个月。

气相色谱-质谱法测定肝脏组织中盐酸克伦特罗和盐酸莱克多巴胺

建立了同时测定动物肝组织中盐酸克伦特罗和盐酸莱克多巴胺残留量的固相萃取-气相色谱-质谱分析方法。动物肝组织样品在碱化的条件下用乙酸乙酯和异丙醇混合溶剂提取，提取液浓缩后用乙酸乙酯溶解，然后再用稀盐酸反萃取去除脂肪，调pH值后经SCX固相萃取（SPE）柱净化，洗脱液经氮气吹干后经双三甲基硅基三氟乙酰氨（BSTFA）衍生，采用选择离子模式（盐酸克伦特罗：86、212、262、277，盐酸莱克多巴胺：163、192、234、250）进行测定，外标法定量。盐酸克伦特罗和盐酸莱克多巴胺的检出限分别为0．30和1．00μg／kg。盐酸克伦特罗添加浓度在1．0～5．0μg／kg范围内，添加回收率为77．4％～88．3％；相对标准偏差（RSD）为3．1％～5．1％；盐酸莱克多巴胺添加浓度在4．0～20．0μg／kg，添加回收率为69．8％～82．1％；相对标准偏差（RSD）为3．5％～4．9％；衍生物的峰面积与被测物浓度分别在0．003～1．00mg／L和0．012～4．00mg／L范围内呈良好的线性关系，线性回归系数均大于0．999。

分子印迹固相萃取-高效液相色谱法测定饲料中莱克多巴胺

以莱克多巴胺为模板分子,丙烯酰胺为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,合成了对莱克多巴胺具有高选择性的分子印迹聚合物。考察了甲醇、乙腈、丙酮和氯仿-甲醇与三乙胺构成致孔剂合成的聚合物性能及其形貌特征。通过正交试验优化的聚合反应配方为:1.0 mmol莱克多巴胺,4.0 mmol丙烯酰胺,20.0 mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯,6.0 mL乙腈-三乙胺(30∶1,v/v),50.0 mg偶氮二异丁腈。建立的基于分子印迹固相萃取-高效液相色谱测定饲料试样中莱克多巴胺的方法,在0.50～100 mg/L质量浓度范围内有良好的线性关系(r=0.999 4);饲料试样中1.0、10及100 mg/kg 3个添加水平的莱克多巴胺平均回收率大于80%;批内、批间测定的相对标准偏差小于10%;检出限(信噪比为3)达到0.1 mg/kg。该方法灵敏、可靠,用于饲料等复杂基质中莱克多巴胺检测的效果优于相关标准分析方法。

多壁碳纳米管和分子印迹膜修饰电极检测猪尿液中莱克多巴胺

采用原位热聚合技术,分别以多壁碳纳米管(MWCNs)和分子印迹膜(MIM)修饰丝网印刷电极(SPE),与多壁碳纳米管和非分子印迹膜(NIM)修饰的丝网印刷电极组合在一起,并将其组合的丝网印刷电极通过电极插口与便携式电导仪相连接,组装成检测莱克多巴胺残留的电导型传感器,优化检测条件,并建立了检测莱克多巴胺的标准曲线,测试了实际猪尿样中莱克多巴胺的含量。通过扫描电镜分析了该分子印迹膜的表征结构。结果表明,在莱克多巴胺分子印迹膜表面形成了大量印迹微孔。本传感器装置检测莱克多巴胺具有很高的灵敏度和特异性,检出限为0.033 mg/L,线性范围为0.33～8.0 mg/L,基于猪尿样的检测回收率达到91%～98%,可实现现场快速检测。

克伦特罗和莱克多巴胺多残留胶体金免疫层析试纸条的研制

本试验旨在研制同时检测克伦特罗(CL)和莱克多巴胺(RAC)的多残留胶体金免疫层析试纸条(Multi-strip)。用细胞融合技术筛选CL和RAC杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,金标抗体竞争性膜层析技术研制Multi-strip。该试纸条由样品垫、偶联垫、双检测线和质控线标记的NC膜、吸收垫等几部分构成,其中偶联垫上灌注有CL和RAC两种金标单克隆抗体,双检测线由检测抗原CL-OVA和RAC-BSA喷膜构成,间距2mm。结果表明:多残留试纸条的CL和RAC目测检测限分别为1和2ng·mL-1,检测时间5～8min。基质呈阳性的真实样品用单残留试纸条、ELISA和GC-MS检测,结果一致,无假阳性或假阴性案例。该试纸条具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合于现场检测和筛选。

表面等离子体共振生物传感器连续检测莱克多巴胺

利用表面等离子体共振生物传感器对莱克多巴胺抗体与固定在芯片表面的莱克多巴胺衍生物的相互作用进行了分析,解离常数为2.56×10-6s-1。根据一定范围内相对响应值和时间近似呈线性关系的动力学特性,建立了连续检测的方法,从而简化了实验步骤,有利于提高芯片的使用寿命。检测莱克多巴胺采用抑制法,将莱克多巴胺衍生物固定在芯片的表面,莱克多巴胺抗体与样品混合后流过芯片的表面,所得相对响应值与样品中莱克多巴胺的浓度成反比。单个样品的检测时间设定为15min,对应的检出限小于4μg/L。

猪肾脏等组织中盐酸莱克多巴胺的HPLC检测方法及其残留消除

本研究建立了猪肝脏、肾脏、肌肉和脂肪中盐酸莱克多巴胺的高效液相色谱检测方法。方法的检测限为1ng/g,定量限为2 ng/g,肝脏的平均回收率在73.4%～83.2%,变异系数在2.1%～6.6%;肾脏的平均回收率在73.1%～95.5%,变异系数在3.8%～4.0%;肌肉的平均回收率在80.7%～82.5%,变异系数在4.9%～9.1%;脂肪的平均回收率在73.3%～78.8%,变异系数在2.9%～6.7%。对60头健康猪以18 mg/kg的剂量混饲给药28d,停药饲喂14 d。在给药7、142、8 d和停药1、2、3、7、9、14 d分别屠宰6头猪,取各组织进行残留量测定。结果显示:肾脏中残留量最高,肝脏其次,残留量在停药期间较给药期间显著降低。其中肾脏和肝脏中的残留量分别在停药14 d、停药9 d后降至定量限以下;肌肉和脂肪中的残留量显著低于肾脏和肝脏,给药28 d时,残留基本低于定量限;停药1 d时均低至检测限以下。

高效液相色谱-串联质谱法测定加工肉制品中莱克多巴胺及克伦特罗的含量

建立了高效液相色谱串联质谱测定加工肉制品中莱克多巴胺和克伦特罗的方法。采用阳离子交换色谱柱(SCX)分离目标化合物,改进了前处理方法,采用PXC固相萃取柱净化,并对洗脱溶液和高效液相色谱串联质谱的各参数进行优化。高效液相色谱流动相流速为0.4 mL/min,进样量为10μL,柱温为40℃。样品均质后加入30μLβ-盐酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶,并经0.02 mol/L乙酸铵溶液(pH 5.2)提取,离心,过固相萃取柱净化。两种目标化合物在0.1～100μg/L范围内线性关系良好,检出限和定量下限分别不超过0.04μg/kg和0.15μg/kg。样品平均加标回收率为72%～98%,RSD低于8.5%。结果表明,此方法适于加工肉制品中莱克多巴胺和克伦特罗的测定。

气相色谱-质谱法同时测定动物尿样中莱克多巴胺和克伦特罗

建立了固相萃取-气相色谱-质谱法（SPE-GC／MS）同时测定动物尿样中的莱克多巴胺和克伦特罗的方法。试样中的药物经乙酸乙酯提取后，经SLH固相萃取柱净化，氮吹至干，衍生化后进行气相色谱一质谱测定。两种药物的检出限均为0．3μg／L，定量限均为1．0μg／L，线性范围为0．02～1．0μg／L。加标浓度在4．0～20．0μg／L范围内．莱克多巴胺加标回收率为78．6％～101．2％，批内相对标准偏差≤7．0％；克伦特罗加标回收率为92．3％～112．2％．批内相对标准偏差≤6．9％。

莱克多巴胺荧光胶乳颗粒免疫层析检测法的建立

基于免疫竞争层析法原理,建立了莱克多巴胺(RAC)的荧光胶乳颗粒免疫层析快速检测技术,用于猪肉组织中莱克多巴胺残留的检测。应用自制的抗RAC单抗,标记胶乳荧光颗粒,将标记好的复合物喷涂于结合垫上。羊抗鼠IgG与人工合成的RAC-BSA检测抗原包被在NC膜表面,分别作为质控线(C线)与检测线(T线)。检测过程中RAC-BSA与待测样品中RAC竞争结合有限的胶乳荧光颗粒标记的抗RAC单抗,样品中的RAC越多则其结合的荧光抗体越多,结合到T线的荧光抗体越少,则T线的紫外荧光强度越低,因此荧光强度可直观显示检测的半定量结果。该试纸条检测猪肉组织的最低检出限为0.5μg/L,且与克伦特罗、沙丁胺醇等类似物无交叉反应。所建立的方法操作便捷、稳定可靠、灵敏度高,可用于猪肉组织中莱克多巴胺残留的现场检测和监控。

荧光免疫及磁免疫层析法检测莱克多巴胺的研究

分别将量子点和超顺纳米磁珠作为荧光探针和磁信号探针应用于免疫反应中,构建了检测莱克多巴胺的荧光免疫和磁免疫层析的分析方法,并成功应用于尿液中莱克多巴胺的检测。两种方法均基于免疫竞争模式,在荧光免疫分析方法中,量子点偶联上识别莱克多巴胺的抗体,样品中莱克多巴胺和包被在ELISA板上莱克多巴胺的完全抗原竞争结合量子点,样品中莱克多巴胺的浓度越高,ELISA板上吸附的量子点越少,所测荧光强度值越低,该方法的检出限为1ng·mL-1,检测时间为4h。在磁免疫层析方法中,检测线上特异性捕获的纳米磁珠颜色的深浅和尿液中莱克多巴胺浓度成反比例关系,即莱克多巴胺的浓度越高,检测线的颜色越浅,该方法的定性检出限为10ng·mL-1,检测时间为15min。两种方法各有优缺点,基于量子点的荧光免疫分析法在痕量检测和定量分析方面具有优势,而磁免疫层析法更适合于现场快速检测。

固相萃取气相色谱-质谱联用法测定动物组织中的莱克多巴胺

通过液液分配和固相萃取提取、净化动物组织中添加的莱克多巴胺,TMS衍生化试剂BSTFA(N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺)衍生化,气相色谱-质谱联用(选择离子模式,选择离子为m/z163、m/z192、m/z234、m/z250)对衍生物检测分析,确定了动物组织中莱克多巴胺的定性、定量分析方法,该法检出限为0.5μg/L,衍生物的峰面积与样品浓度在1～1000μg/L范围内呈良好的线性关系,线性回归系数为0.9998。不同组织中不同莱克多巴胺加入量的加标回收率分别为:肝脏70.2%～75.4%,脂肪71.2%～84.7%,肾脏72.8%～80.9%,肌肉75.2%～86.4%;相对标准偏差为1.8%～5.6%。

量子点标记免疫层析试纸条快速检测莱克多巴胺的研究

本实验通过莱克多巴胺抗原抗体的制备、量子点的制备、试纸条的组装和测试等步骤研究一种将量子点应用于莱克多巴胺免疫层析试纸条的新方法。结果表明,莱克多巴胺快速检测试纸条的检测限为3ng/ml,检测时间为10min。本法使用方便、经济,适合于莱克多巴胺现场快速检测。

莱克多巴胺单克隆抗体的研制及阻断ELISA检测方法的建立

用混合酸酐法将莱克多巴胺（RAC）偶联于牛血清白蛋白（BSA）,合成免疫原BSA-RAC,并用紫外和凝胶电泳鉴定;用BSA-RAC免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立抗RAC单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备RAC mAb。应用RAC mAb研制RAC残留快速检测阻断ELISA试剂盒（RAC-Kit）,并测定其性能。结果表明,BSA-RAC偶联成功,分子结合比为1∶24.5;筛选出3株杂交瘤细胞,其中最好的4D8株的亲和常数Ka为1.65×1010L/mol。RAC-Kit的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,线性范围为1~170μg/L,灵敏度为0.52μg/L,检测限为1μg/L,饲料样、猪尿样的平均添加回收率分别为91.1%和89.2%,平均批内和批间变异系数〈15%,与多巴酚丁胺的交叉反应率为22.3%,与其他化合物无交叉反应,RAC-Kit在4℃可保存180d。

莱克多巴胺抗体的制备与评价

本文以RAC-linker-BSA为免疫抗原获得了莱克多巴胺的多克隆抗体,用混合酸酐法合成包被抗原,建立了莱克多巴胺的间接竞争酶联免疫检测方法(ELISA),并对抗体性质进行了评价。结果表明,制备出的莱克多巴胺抗体具有较高的灵敏度,IC_(50)为0.9ng/mL,检出限(IC_(15))为0.1 ng/mL,低于同类文献的报道结果;除了与多巴酚丁胺的交叉反应为7.5%外,与克伦特罗、沙丁胺醇、特步他林、异丙肾上腺素和异奎胍均无交叉现象,说明抗体特异性较高;此外,抗体具有很好的稳定性,可在4℃冰箱中储存半年以上。为建立酶联免疫快速检测方法,实现对莱克多巴胺的有效监控奠定了良好的基础。

莱克多巴胺荧光微球免疫层析检测方法的建立

以荧光微球作为新型标记物,采用EDC法进行偶联,制备莱克多巴胺抗体荧光微球复合物,复合物粒度均一、性质稳定,并以之为探针建立莱克多巴胺荧光微球免疫层析检测方法,检测限为2.5ng/mL,且特异性强、检测范围宽。与胶体金免疫层析方法相比,荧光微球免疫层析方法的灵敏度更高,新型的荧光微球可以提高免疫层析方法的灵敏度。

基于APTLD的猪肉中莱克多巴胺残留含量的三维同步荧光光谱快速测定

应用三维同步荧光光谱法结合交替惩罚三线性分解(APTLD)来建立猪肉中莱克多巴胺残留含量的定量测定模型,以实现猪肉中莱克多巴胺残留含量的快速测定。首先分析了莱克多巴胺的荧光光谱产生机理和样本的三维同步荧光光谱;其次对猪肉提取液中的莱克多巴胺荧光的浓度猝灭现象进行了分析;然后应用核一致诊断法确定了APTLD的三线性分解组分数为2,并建立了猪肉提取液中莱克多巴胺的相对荧光峰值强度与训练样本中莱克多巴胺的相对荧光峰值强度之间的标定曲线,用于待测样本中的相对荧光峰值强度的校正;最后,建立了基于APTLD的猪肉中莱克多巴胺残留含量的三维同步荧光光谱预测模型。试验结果表明,该方法可以较好的解决猪肉样本中莱克多巴胺与背景之间的同步荧光光谱严重重叠的问题,省去了一些烦琐的"化学分离"过程,模型预测集的决定系数(R^2)和均方根误差(RMSEP)分别为0.986 3和0.496 6 mg·L^(-1),达到了猪肉中莱克多巴胺残留含量快速定量测定目的。