莱鲍迪甙B通过线粒体凋亡途径对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的保护作用

目的探讨莱鲍迪甙B在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型中的保护作用及相关机制。方法培养BV2细胞,将细胞按完全随机法分为正常对照组、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)炎症细胞模型组、莱鲍迪甙B干预组。给予BV2细胞1μg/mL LPS培养24 h制备LPS炎症细胞模型。莱鲍迪甙B干预组于造模前给予10μmol/L莱鲍迪甙B干预4 h。利用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,采用免疫荧光法观察细胞形态学变化,采用Western blot检测细胞抗活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-3抗体(Caspase-3)、抗Bcl-2相关X蛋白抗体(Bax)和抗B细胞淋巴瘤因子-2抗体(Bcl-2)表达情况。选取6~8周龄雌性C57BL/6小鼠30只,随机分为正常对照组、EAE模型组、莱鲍迪甙B干预组,每组各10只。利用MOG_(35-55)多肽皮下注射法构建EAE动物模型。莱鲍迪甙B干预组小鼠于造模后第8天给予腹腔注射莱鲍迪甙B(按体重1 mg/kg),持续15 d。采用HE染色观察小鼠脊髓组织病理学变化,采用Western blot检测脊髓组织Caspase-3、Bax和Bcl-2表达情况,采用透射电镜观察小鼠脑组组织内凋亡小体。结果(1)细胞实验结果:与正常对照组相比,LPS炎症细胞模型组的细胞S期比例下降,细胞核染色质固缩明显,细胞凋亡率上升,Caspase-3表达水平增加,Bax/Bcl-2比值升高(均P<0.01)。与LPS炎症细胞模型组相比,莱鲍迪甙B干预组细胞S期比例上调,细胞核染色质固缩现象改善,细胞凋亡率下降,Caspase-3表达水平降低及Bax/Bcl-2比值降低(均P<0.01)。(2)动物实验结果:与正常对照组相比,EAE模型组小鼠脊髓组织炎症细胞浸润增多,Caspase-3表达水平增加及Bax/Bcl-2比值升高(均P<0.01),小鼠脑组织的细胞形态异常,出现凋亡小体。与EAE模型组小鼠相比,莱鲍迪甙B干预组小鼠脊髓组织Caspase-3表达水平下降及Bax/Bcl-2比值下降(均P<0.01),小鼠脑组织细胞形态基本正常。结论莱鲍迪甙B对EAE模型小鼠具有神经保护作用,其作用机制与莱鲍迪甙B抑制细胞凋亡途径有关。

含酮基吸附剂对莱鲍迪甙A的吸附选择性研究

合成了一系列具有不同骨架结构的中极性含酮基大孔吸附树脂，研究了树脂极性与骨架结构的关系，讨论了树脂对甜菊糖中两种主要糖甙甜菊甙及莱鲍迪甙Ａ的吸附能力和吸附选择性，并设计通过树脂柱的动态色层法从甜菊甙含量高的甜菊糖中成功地分离出高莱鲍迪甙Ａ糖产品．

莱鲍迪甙C高效转化细菌Paenarthrobacter ilicis CR5301全基因组测序及关键糖苷酶分析

为全面了解Paenarthrobacter ilicis CR5301的遗传背景,深入解析CR5301转化莱鲍迪甙C(rebaudioside C,RC)的关键酶,采用二代Illumina HiSeq和三代Nanopore相结合的测序方法,对CR5301进行全基因组测序和关键酶预测分析。结果显示,CR5301基因组为1个闭合环状染色体DNA分子,不含质粒,基因组序列全长4748281 bp,GC含量62.92%,共编码4458个基因,同时含有4个基因岛、1个前噬菌体和14个CRISPR-Cas编码序列。CR5301是P.ilicis物种第1个测定基因组完成图的菌株,也是Paenarthrobacter菌属已知基因组最大的菌株。基因组共线性分析和16S rRNA基因系统进化树分析结果一致表明,P.ilicis CR5301与P.aurescens具有更近的亲缘关系,而与P.ureafaciens的亲缘关系较远。7个蛋白质数据库综合注释分析发现,P.ilicis CR5301基因组共含有523个碳水化合物活性酶基因,其中18个糖苷酶基因可能是CR5301转化RC的关键酶基因。最后,通过ProtParam、SOPMA生物信息学软件,预测了18个糖苷酶的物化性质和二级结构。这些结果为CR5301的RC转化机制研究提供了清晰、完整的遗传信息,并且为P.ilicis物种广泛的生物学研究提供了完整、可靠的参考基因组序列,对今后P.ilicis物种生物学研究具有重要的参考价值和普遍的借鉴意义。

不同产地甜菊叶中莱鲍迪甙A含量比较研究

通过高效液相色谱测定了江苏、安徽等地所产甜菊叶中莱饱迪甙A和总甙的含量,结果显示,,江苏产地甜菊叶中莱饱迪甙A含量达到9%左右明显高于其他产地;不同产地甜菊叶中莱饱迪甙A含量差异性的原因,除品种不同外,还与当地的土壤条件及气候有着密切的关系。在河北和天津地区试种的结果显示,甜菊叶在这2个地区的推广有着非常广阔的前景。

乙醇-异丙醇-水体系中莱鲍迪甙A的溶解度与介稳区的测定

采用动态稳定法测定了莱鲍迪甙A(RA)在乙醇-异丙醇溶液中的溶解度和超溶解度曲线,探讨了溶剂组分变化等因素对莱鲍迪甙A在乙醇-异丙醇-水溶液中的溶解度影响,并利用多项式经验方程对溶解度及超溶解度与温度进行了关联。结果表明在0~60℃范围内莱鲍迪甙A在乙醇-异丙醇-水溶液中的溶解度随温度的升高而增加,并随着异丙醇用量的增加而减小,且随着水用量比例的增加而增加;介稳区宽度在4~7℃,介稳区宽度则随温度的升高而减小;多项式经验方程关联误差小,为乙醇-异丙醇-水体系重结晶分离莱鲍迪苷A提供了重要的基础数据。

多溶剂溶析冷却结晶法提纯莱鲍迪甙A的工艺研究

采用一步多溶剂溶析冷却结晶法提纯莱鲍迪甙A,考察了不同溶析剂及其组合对莱鲍迪甙A的结晶收率及纯度影响。结果表明,RA55在含有异丙醇与乙酸乙酯混合溶析剂的90%乙醇水溶液的一步溶析冷却结晶工艺中,制得的莱鲍迪甙A纯度达到99%以上,产品总收率达到73.5%,展现出良好的提纯效果和经济性。

高纯度莱鲍迪甙A的结晶制备工艺

针对现有结晶法制备甜菊糖中存在的结晶步骤复杂、回收率低、结晶周期长等问题,提出了二次结晶法从甜菊糖粗品中提取高纯度RA的新工艺。同时研究了提取溶剂、固液比、结晶温度、结晶时间等对结晶效果的影响,优化了现有结晶工艺,简化了结晶步骤。实验表明,结晶法制备高纯度RA的最佳工艺为：一次结晶提取溶剂为无水甲醇（质量分数〉99%）,固液比为1∶5 g/m L,溶解温度为50℃,结晶时间为2 h;二次结晶提取剂为86%~88%的乙醇溶液,固液比1∶4g/m L,溶解温度为50℃,结晶时间为16~24 h。两次结晶RA总得率为70.9%,通过本结晶工艺,可制得RA的质量分数为97.51%的甜菊糖产品。

溶析结晶法分离莱鲍迪甙A的工艺研究

采用溶析结晶法分离甜菊糖苷中的莱鲍迪甙A(RA),考察溶析剂及其含量、溶液浓度、结晶温度、结晶时间对结晶率和分离系数〔0.87×SRA/(Stotal-SRA)〕的影响。结果表明,在乙酸乙酯含量50%,溶液浓度20 g/L,结晶温度18℃,结晶时间8 h的条件下,结晶率为0.34,分离系数为3.8。

新型含吡啶基树脂对甜菊糖中莱鲍迪甙A的富集与分离

研究了含吡啶功能基大孔吸附树脂对甜菊糖的吸附量与吸附选择性作用 .分析了树脂极性及不同骨架结构对吸附选择性的影响 .并分别通过甲醇或乙醇的选择性洗脱及树脂动态吸附分离两种方法研究树脂对甜菊糖中莱鲍迪甙A的富集作用 .结果表明 ,树脂动态分离法可以有效地从高甜菊甙甜菊糖中分离富集出高莱鲍迪甙A产品 ,该方法具有一定的工业应用前景 .

高效液相色谱法测定甜菊糖甙中莱鲍迪甙A

建立甜菊糖甙中莱鲍迪甙A（简称为R—A）的HPLC定量分析方法。参照国标GB8270—1999甜菊糖甙含量测定方法，色谱柱采用Kromasil NH2柱（250mm×4．6mmi．d．，5um），乙腈：水=80：20为流动相，采用紫外检测器和运用外标法测定甜菊糖甙中的R—A。其质量浓度在0．1～1．0mg/mL时线性关系良好，平均回收率在101．51％，RSD为1．22％。该法简便，快速，重线性好，适用于甜菊糖甙中R—A的定量分析。

莱鲍迪A甙制备及其安全性的研究

[目的]探讨超声波提取甜菊糖甙的最佳工艺条件。[方法]利用甜叶菊制取莱鲍迪A甙产品,并对该制备过程中的主要工序提取和重结晶工艺条件进行研究。[结果]结果表明,甜菊糖甙最佳的提取工艺条件为:提取温度68℃,超声功率60 W,提取时间32 m in。从甜菊糖甙混合物中利用重结晶法提纯获得莱鲍迪A甙,HPLC测定其纯度为94.7%。毒性试验可知莱鲍迪A甙是无毒的。[结论]该试验为莱鲍迪A甙的工业化生产提供了理论指导。

快速溶剂萃取法提取甜叶菊中三种主要甜菊糖甙

研究快速溶剂萃取对甜叶菊中的甜菊甙、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙C的提取效果,并与超声波提取法进行比较。通过单因素试验讨论萃取溶剂、萃取温度、静态时间及循环次数对于萃取效率的影响。结果表明,快速溶剂萃取的最佳提取条件:以水为溶剂,温度60℃,压力1.03×107 Pa,循环次数2次,静态萃取时间10min,最终萃取体积20mL。该条件下甜菊甙、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙C萃取总量分别达到7.7,5.5,52.7mg/g,分别是超声提取法的1.3,2.0,2.1倍,而且快速溶剂萃取具有快速、高效、方便等优点,更适于甜菊糖甙的提取。

改性大孔树脂分离纯化甜菊糖甙的研究

本文对D-101型大孔树脂进行改性得到两种新型大孔树脂D-101-DCCD和D-101-CCD；并应用得到的改性大孔树脂对两种甜菊糖——莱鲍迪甙A（RA）和斯替维甙（ST）进行了吸附／脱附实验，总结改性树脂对RA和ST的吸附分离规律：（1）D-101-DCCD对于RA具有特异性的吸附能力；（2）在对于RA和ST的脱附能力方面的显著差异，表明D-101-DCCD在RA的工业化纯化方面具有良好得应用前景。

大孔树脂D107和D108对甜菊糖中SS和RA的分离研究

通过静态吸附比较几种大孔树脂分离甜菊糖中RA和SS的能力,从中筛选了对莱鲍迪甙A(RA)和甜菊甙(SS)分离效果好和吸附性能高的D107和D108两种大孔树脂。实验结果表明,含72%莱鲍迪甙A(RA)的原糖液经D107树脂吸附处理后,能富集到RA占80%以上的糖液。经D108树脂吸附后,能富集到RA含量占90%以上的糖液。两种树脂的洗脱实验结果表明,50%的甲醇对于分离RA和SS的效果最好,与吸附前糖液成分相比,洗脱液中RA含量提高到78%￣85%。

高产环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌选育、产酶与酶学特性

选育了一株高产环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）的芽孢杆菌Sx菌株，经16SrRNA测序分析，结合菌体及菌落的形态特征，鉴定该茵株为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。对其产酶条件与酶学特性进行了研究。结果表明，以1g／dL玉米淀粉和2g／dL豆粕粉为碳氮源，pH6．5，30℃，220r／min，60h的条件下，菌株所产CGTase酶活性可达5596U／mL；该酶在30～50℃，pH5．5-9．0下保持稳定，在50℃，180r／min，PH6．5，CGTase酶活力为1107U／mL的条件下对20mg／mL甜菊甙转化48h，甜菊甙溶液中的莱鲍迪甙与甜菊甙的比值（RA／SS）从转化前的0．45上升到0．53。

甜叶菊糖基转移酶UGT76G1的克隆表达及其性质研究

目的:利用甜叶菊糖基转移酶UGT76G1特异性催化甜菊糖中含量高并且具有较强后苦味的甜菊甙生成高甜度的莱鲍迪甙A。方法:将合成的UGT76G1编码基因插入pYES2载体的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,成功构建了pYES2-UGT重组质粒。重组质粒导入表达宿主酿酒酵母YPH499中,利用2%半乳糖对重组菌进行诱导表达。结果:确定了最佳诱导时机为菌体培养后48h,诱导表达时间为12h。并对重组酶粗酶液性质进行了初步研究,确定其最适反应pH为8.0,最适反应温度为40℃,最佳反应时间为36h。结论:为建立经济高效的生物催化法对甜菊糖口味改质奠定了基础。

大孔树脂对甜菊糖的纯化

通过静态吸附比较三种大孔树脂对甜菊糖中莱鲍迪甙A(RA)和甜菊甙(ST)的吸附和解吸能力,利用高效液相色谱对结果进行检测,从中筛选出对RA和ST吸附效果最佳的LX-68M树脂。纯化工艺为30℃下,LX-68M树脂对RA和ST在6h后达到吸附饱和,吸附量分别为干树脂RA 85.00mg/g和ST 121.50mg/g。动态洗脱结果表明:以55%的乙醇为洗脱液,在2BV/h的洗脱速度下,经LX-68M树脂处理后的甜菊糖溶液纯度由75.5%提高到77.8%。表明LX-68M树脂对于甜叶菊糖苷工业生产的应用前景较好。

酿酒酵母组成型表达甜叶菊糖基转移酶UGT76G1及相关性质研究

本研究将酿酒酵母穿梭质粒p ESC-Leu的诱导型启动子GAL1和GAL10分别替换为PGK1和TEF1启动子,构建了组成型双启动子表达载体p ESCD,再将甜叶菊糖基转移酶UGT76G1的编码基因亚克隆到p ESCD的Sal I和Xho I酶切位点之间,构建了组成型表达UGT76G1的重组质粒p ESCD-UGT。将p ESCD-UGT转化到酿酒酵母YPH499中进行表达,结果确定该重组酵母在SD-L液体培养基培养24h达到稳定期,菌体培养8h蛋白表达量高,选用1%的甲苯作为重组菌全细胞催化的通透剂时,催化15h产生288mg/L的莱鲍迪甙A,其产量是对照组的5倍。

一株快速转化甜菊苷的细菌鉴定、产酶及转化特性

【目的】本研究鉴定了一株筛选的甜菊苷特异降解菌、优化了该菌产β-葡萄糖苷酶的条件以及研究了该菌对甜菊苷的转化特性。【方法】经16SrRNA基因序列测序和系统发育学分析,结合形态学特征确定该菌株的系统发育地位。用单因素及多因素分析探讨了其对甜菊苷的降解,通过液质联用检测了降解产物。【结果】菌株-J2与巨大芽孢杆菌的16SrRNA基因序列相似性达到100%,结合形态学特征,鉴定该菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。在玉米淀粉4%、豆粕粉1%、硫酸镁0.04%、pH7.0、37℃、220r/min、接种量10%、培养36h的条件下,该菌产β-葡萄糖苷酶活力为779.68U/mL。甜菊苷转化的结果表明:3d可将10mg/mL甜菊糖溶液中甜菊苷转化74%,使莱鲍迪甙A和甜菊苷的比例(RA/SS)由转化前的0.38上升至0.99,RA的相对量增加160.5%,5d时转化完全。转化产物经液质联用鉴定为甜菊双糖甙。【结论】确定菌株-J2为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),该菌对甜菊苷具有高效、特异的转化能力,为首次报道的新型、安全菌株。