高效液相色谱法测定甜叶菊糖中的甜菊苷和莱鲍迪苷A

建立甜叶菊糖中甜菊苷（简称为XT）和莱鲍迪苷A（简称为RA）的HPLC定量分析方法。色谱分离采用Kromasil NH2柱（250mm×4．6mm i．d．，5μm），以V（乙腈）：V（水）=75：25为流动相，采用质谱检测器鉴定甜叶菊糖中主要的成分。sT和RA质量浓度分别为9．0～287．6mg／L和3．9—126．1mg／L时线性关系良好，两者平均回收率分别为98．61％和97．40％，RSD分别为2．3％和1．3％（n=5）。本实验还利用经典的Eschweiler-clark甲基化反应将氨基柱的伯胺转变为叔胺，发现上述溶质保留减小，同时分离选择性减小，说明氨基与糖苷类化合物的氢键作用和偶极-偶极作用对分离有重要贡献。

反相高效液相法测定甜叶菊中莱鲍迪苷A和甜菊糖苷的含量

目的建立反相高效液相色谱法（RP．HPLC）测定甜叶菊中莱鲍迪苷A（RA）和甜菊糖苷（ST）的含量。方法采用welchMaterials XB—C18柱（250mm×4．6mm，5μm），以乙腈．10mmol·L^-1磷酸酸钠缓冲液（pH=2．67，35：65，v～）为流动相，流速0．7mL·min^-1，检测波长210nm，柱温30℃，进样量5此。结果以外标法定量，RA和sT均在O．25～2．50mg·mL^-1与峰面积线性关系良好，r〉0．9995。RA回收率为100．3％，RSD为2．3％（n=6），ST回收率为101．0％，RSD为2．5％（n=6）。结论本方法快捷、准确、可靠，易操作，可用于甜叶菊及相关产品中RA和ST含量测定。

高效液相色谱-蒸发光散射测定甜菊糖中甜菊糖苷和莱鲍迪苷A的含量

建立了高效液相色谱-蒸发光散射分离与检测甜菊糖中甜菊糖苷和莱鲍迪苷A的实验方法。色谱分离使用Kromasil NH2 柱(250mm×4.6mm,i.d.,5μm),流动相为85%乙腈水溶液,柱流出物采用蒸发光散射检测器检测,漂移管温度为85℃,空气做载气,流速为2.4L/min。甜菊糖苷和莱鲍迪苷A的线性范围分别为0.05～3.0、0.05～3.7mg/mL,平均加标回收率分别为97.63%、99.25%,相对标准偏差分别为1.04%、1.27%。该方法简单、快速、准确、重现性好,适用于甜菊糖中甜菊糖苷和莱鲍迪苷A的定量分析。

新型天然高倍甜味剂—莱鲍迪苷A

综述了莱鲍迪苷A的物化性质、制备、检测方法和应用等方面的研究进展,并对莱鲍迪苷A在食品工业中的应用和前景进行了分析及阐述。

莱鲍迪苷A的甜味特性和改良及其在食品中应用进展

莱鲍迪A苷是甜菊糖苷混合物中的一种糖苷成分,与甜叶菊中其他糖苷相比,莱鲍迪A苷的甜度最高,也较稳定,并且口感也是最接近蔗糖的天然甜味剂,而且保持了原有甜菊糖的其他优点,可作为一种理想的天然甜味剂产品。莱鲍迪苷A具有甜度高,口感好,安全稳定的优点,符合当前食品添加剂和甜味剂安全、健康、高效的发展趋势,将在食品工业中得到广泛的应用。本文综述了莱鲍迪苷A的甜味特性及及其在食品中应用进展,对其甜味特性及其特性的几种改良方法进行了分别阐述。

重组酿酒酵母全细胞催化合成莱鲍迪苷A

用经密码子优化后合成的甜叶菊UDP糖基转移酶UGT76G1编码基因构建了表达该酶的重组酿酒酵母YPH499(pYES2-UGT)。建立了通过柠檬酸钠调节酿酒酵母细胞内由葡萄糖到尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的代谢通量,用于催化甜菊苷合成莱鲍迪苷A的全细胞催化方法。优化后的催化体系为:甜菊苷1 g/L,葡萄糖20g/L,普郎尼克F68 10 g/L,MgCl2 6 g/L,柠檬酸钠15 g/L,pH 7.2,细胞密度200 g湿细胞/L反应液,在37℃下经72 h后转化生成莱鲍迪苷A 267.89 mg/L。

莱鲍迪苷A复配甜味剂在蛋糕中的应用

通过感官评定的方法研究莱鲍迪苷A在蛋糕中替代蔗糖的应用效果。在此基础上研究莱鲍迪苷A复配甜味剂对蛋糕感官品质和质构的影响,确定复配甜味剂的最优配方。结果表明,莱鲍迪苷A在蛋糕中替代蔗糖的最大替代量为30%。莱鲍迪苷A复配甜味剂的加入对蛋糕的内聚性、粘度影响不大,对蛋糕硬度、弹性、胶着性、咀嚼性的影响显著。添加适当比例的复配甜味剂可以使蛋糕的弹性、胶着性有所增加,同时改善了蛋糕的咀嚼性,使蛋糕的口感更加绵软,甜味更加柔和,保湿性也得到明显改善。蛋糕的最优配方为:面粉100g,鸡蛋150g,色拉油20g,泡打粉2g,蔗糖10g,莱鲍迪苷A 0.1g,木糖醇45g,聚葡萄糖30g。

莱鲍迪苷A甜味剂在功能性酸奶中的应用研究

用莱鲍迪苷A替代蔗糖后,酸奶的色泽较对照组更白,凝乳状态基本没有发生变化,酸奶凝乳好,表面光滑。但酸奶的持水性能明显下降,在酸奶的表面均出现乳清析出。随着莱鲍迪苷A替代量的增加,酸奶的酸味评分先增加后下降,但普遍低于对照组。同时,酸奶的甜味、苦味和柔和感评分与对照组相比都有所下降。相反地,酸奶的乳香味评分有所上升。当莱鲍迪苷A替代蔗糖后酸奶的各项感官品质普遍下降,综合分析可知莱鲍迪苷A的最优替代量为50%。但是,当替代量为50%时,酸奶的乳清析出比较明显,而且酸甜不和谐,口感不够柔和,如果要用莱鲍迪苷A制作无糖酸奶还需要对其进行复配。在单因素试验的基础上以莱鲍迪苷A、赤藓糖醇、低聚异麦芽糖用量为自变量,酸奶感官、pH、硬度、稠度、黏附性、持水力为响应值,对酸奶复合甜味剂配方进行响应面优化。优化后无糖酸奶的最优配方为:复原乳100mL,莱鲍迪苷A 0.02 g,赤藓糖醇1.809 g,低聚异麦芽糖2.908 g,稳定剂0.1 g,CaCl20.02 g,接种量4 mL。用该配方制作的无糖酸奶色泽洁白,结构均匀细腻,酸甜适宜,口感柔和。

β-呋喃果糖苷酶的生产及对甜菊苷和莱鲍迪A苷的酶法改性研究

用Arthrobacter sp.10137生产一种β-呋喃果糖苷酶(FFase),SDS-PAGE检测纯化后的酶分子质量为48.7ku左右,酶的比活力为19.81U/mg。纯酶的最适pH值和温度分别为6.5和40℃,并在pH6～8及40℃以下稳定。纯酶对甜菊苷和莱鲍迪A苷改性的最适条件是:酶量为15U/mL,莱鲍迪A苷和甜菊苷与蔗糖的摩尔比分别为0.0005:1和0.0012:1,反应时间为15h。在最适条件下,莱鲍迪A苷和甜菊苷的最大转化率分别为69.4%和72.0%。

莱鲍迪苷A在甲醇-水体系中溶解度与超溶解度的测定

测定了莱鲍迪苷A在甲醇溶液中的溶解度和超溶解度曲线,并用数学模型进行了拟合,同时还测定了温度、降温速率、搅拌速率对甲醇溶液中莱鲍迪苷A介稳区宽度的影响。结果表明,莱鲍迪苷A在甲醇溶液中的溶解度随着温度的升高而增加,而介稳区宽度随着温度的升高而减小,随着降温速率的增加而增大,随着搅拌速率的增加先减小后增大。

高效液相色谱法测定新疆地区甜叶菊中甜菊苷和莱鲍迪苷A的含量

目的建立测定新疆地区甜叶菊中甜菊苷和莱鲍迪苷A含量的方法。方法采用高效液相色谱法,色谱柱为Agilent·Zorbax·SB-C_（18）（4.6 mm×250 mm,5μm）,流动相为乙腈-磷酸钠缓冲液（32∶68 v/v.p H=2.60）,流速为1.0 m L/min;检测波长为210 nm。结果甜菊苷和莱鲍迪苷A进样量分别在0.426～2.130μg、1.816～5.448μg范围内与峰面积积分分值呈良好线性关系（r=0.999 9）,二者精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤1.50%,平均加样回收率分别为99.98%、100.06%,RSD分别为0.86%、1.16%,测得甜叶菊中甜菊苷的含量为5.74 mg/g,莱鲍迪苷A的含量为10.80 mg/g。结论高效液相色谱法简便、准确、重复性好,可用于新疆地区甜叶菊中甜菊苷和莱鲍迪苷A的含量测定。

莱鲍迪苷A的制备色谱法分离纯化研究

本文从制备色谱填料入手,探讨采用中压制备色谱法一次分离得到高纯度莱鲍迪苷A(RA)的可行性。以羧酸改性15μm单分散PS-DVB基球填料为分离介质,装填入规格为12.6×2.66cm的flash色谱柱中,以RA单体的纯度、产率、回收率为考察指标,研究了不同的流动相比例、上样浓度、上样体积以及流动相流速对分离纯化过程的影响。建立了合适的操作条件:流动相为乙腈/水=80/20(v/v),上样浓度为280mg/mL,上样体积为0.4mL,流速为4mL/min。在最佳的操作条件下,分离得到的RA单体纯度为90.22%,回收率79%。该方法具有分离效率高,产品质量好,生产周期短,操作方便等特点,为从低含量甜菊糖结晶母液中纯化RA单体的工业化生产提供了一种有效的途径。

莱鲍迪苷M及其复配甜味剂在无糖酸奶中的应用

应用不同比例的莱鲍迪苷M替代酸奶中的蔗糖,结果表明当替代蔗糖量60%时酸奶的感官得分最高。将莱鲍迪苷M、三氯蔗糖及罗汉果甜苷单独添加到酸奶中,结果表明,每100 mL牛奶中三者的较适添加量分别为24、9、40 mg。在单因素实验基础上,采用响应面分析法,优化莱鲍迪苷M、三氯蔗糖及罗汉果甜苷复配比例。经Design-Expert软件对结果分析,确定无糖酸奶生产的较优工艺参数为每100 mL牛奶中添加莱鲍迪苷M 7.91 mg、三氯蔗糖3.03 mg、罗汉果甜苷13.62 mg。在此条件下,验证实验中无糖酸奶的感官评分是92.00,与理论值的相对偏差是0.53%,此时感官品质最佳,比酸奶中仅使用单一甜味剂在口感上更接近添加蔗糖的酸奶。

莱鲍迪苷A溶解度的测定与关联

采用激光动态监测法测定了273.15～318.15 K莱鲍迪苷A在丙酮、无水乙醇、95%乙醇和90%乙醇4种溶剂中的溶解度,并用Apelblat方程、理想溶液方程和多项式经验方程对实验数据进行了关联。结果表明,莱鲍迪苷A在4种溶剂中的溶解度均随温度的升高而增大,且在不同溶剂中莱鲍迪苷A的溶解度有较大差异,大小顺序为:90%乙醇>95%乙醇>无水乙醇>丙酮;莱鲍迪苷A的溶解度实验数据用Apelblat方程、理想溶液方程和多项式经验方程关联的最大平均相对误差分别为1.75%,3.85%,0.96%。上述结果可以为莱鲍迪苷A的结晶分离过程提供基础热力学数据。

甜味剂莱鲍迪苷D的高效生物催化合成

采用来自水稻的UDP-糖基转移酶EUGT11并结合染色体改造构建了大肠杆菌工程菌,用于全细胞催化莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)生产莱鲍迪苷D(Rebaudioside D,RD)。为了增加宿主细胞内源性糖配体葡萄糖尿苷二磷酸(uridine diphosphate glucose,UDPG)的供给以满足糖基化反应需要,以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌对UDPG代谢通径进行改造,获得了一系列改造菌株SG1、SG2、SG3和SG4。其中以SG4为宿主过表达可高效催化RA合成RD的糖基转移酶EUGT11进行全细胞催化,RD产量高。随后以此工程菌为对象,对可能影响RD催化合成的条件进行了研究,结果表明50 m L培养菌液离心所收集新鲜菌体可在100 mmol/L pH 8.0磷酸钠缓冲液、80 mmol/L柠檬酸钠、体积分数0.1%Triton X100、500 g/L蔗糖、5 mmol/L Zn Cl2、42℃转化1 d的条件下催化1 mmol/L RA底物生成1112.21 mg/L RD,转化率可达98.5%。

莱鲍迪苷A溶解度与介稳区宽度的测定及其结晶过程研究

莱鲍迪苷A是极为重要的新型甜味剂,由于缺乏合理的溶解度数据且其成核机理不明确,导致现存的结晶工艺得到的结晶产品存在细晶多、粒度分布不均等问题。为此,首先利用激光动态法测定了莱鲍迪苷A在甲醇-水、乙醇-水、正丙醇-水、丙酮-水中的溶解度及在甲醇-水中的介稳区宽度,并利用Wilson方程对溶解度进行模型验证;研究了溶剂组成、饱和温度、搅拌速率与冷却速率对介稳区宽度的影响,研究表明,莱鲍迪苷A的介稳区宽度随溶剂中甲醇含量与冷却速率的增加而变宽,随饱和温度与搅拌速率的增加而变窄;基于经典成核理论与相关模型,计算了莱鲍迪苷A的固液界面能γ与临界Gibbs自由能ΔGcrit等成核参数;根据表观成核级数m分析可知,初始温度高于318.15 K时,连续成核是莱鲍迪苷A主导的成核方式;基于上述研究优化了莱鲍迪苷A冷却结晶过程,得到了粒度分布均一的结晶产品。

毕赤酵母全细胞催化合成新型高倍甜味剂莱鲍迪苷A

本研究构建经密码子优化后的UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶AtSUS基因的重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9KUGT/p PICZA-At SUS,实现双酶在毕赤酵母中的胞内共表达。利用共表达菌株作为全细胞催化剂在体外进行催化反应,可成功将ST转化为RA,并在此基础上对其最适反应温度、反应p H、底物UDP浓度与底物蔗糖浓度条件进行优化。重组菌株经甲醇诱导,对不同发酵时间菌体的催化能力进行探究,确定发酵120 h菌体催化能力最佳,RA产量为0.58 mg/mL。对共表达菌株催化体系中全细胞催化条件进行优化,优化后的催化体系为:反应pH 7.0,UDP浓度1 mM,蔗糖浓度70 mM,MgCl2浓度3 mM,ST浓度10 mg/mL,将OD600为30的细胞与上述体系混合后在最适温度45℃下,200 r/min反应15 h,重组菌可将10 mg/mL ST转化为7.46 mg/mL RA,为RA酶法生物合成及其产业化应用提供技术支持。

重组大肠杆菌全细胞催化合成莱鲍迪苷D

莱鲍迪苷D(Rebaudioside D,RD)是一种稀有具有高甜度的甜菊糖苷类化合物。本文实现了重组大肠杆菌全细胞催化莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)合成RD。以水稻c DNA为模板,扩增得到葡萄糖基转移酶基因eugt11,构建了重组菌株E.coli BL21(p ETDuet-eugt11),并成功表达了重组蛋白6His-EUGT11。通过Ni柱亲和层析纯化并在体外酶催化反应表征了其催化活性。将重组菌BL21(p ETDuet-eugt11)应用于催化合成RD研究。探讨了反应体系pH、温度、柠檬酸钠浓度、菌体密度、二价金属离子、二甲苯体积分数、UDPG添加浓度对反应效率的影响。单因素考察结果显示,在菌体密度0.16 g湿细胞/m L反应液,底物RA浓度为1.0 mmol/L,pH 8.0,60 mmol/L柠檬酸钠,1%二甲苯,0.1 mmol/L Zn Cl2,12.0 mmol/L UDPG,反应温度42℃,反应时间24 h的条件下,RD产量为123.6 mg/L(约0.1 mmol/L)。

体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶高效催化合成莱鲍迪苷A

本研究构建了UDP-糖基转移酶UGT76G1基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-UGT76G1和绿豆来源的蔗糖合成酶(mbSUS)基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K/pPICZA-mbSUS。通过甲醇诱导产酶,制备UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶,并构建生物催化级联反应体系,生物催化甜菊糖苷(Stevioside,ST)合成莱鲍迪苷A(rebaudioside A,RA),有效实现了级联反应体系中尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的循环利用。本研究通过反应条件优化,发现级联反应中的限速酶是糖基转移酶UGT76G1,添加酶活比例为U_((UGT76G1)):U_((mbSUS))=6:1为合成莱鲍迪苷A的最佳酶活比例,在pH7.0,UDP浓度1mM,蔗糖浓度50mM,MgCl_2浓度3 mM的反应条件下,10 mM ST转化合成8.20±0.11 mM RA,RA的产率达到82.91%,与在大肠杆菌表达系统中相比,极大缩短了催化反应时间。利用体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶催化合成RA为酶法高效生物合成RA及其产业化应用提供技术支持。

构建高效糖配体再生重组菌生物催化合成莱鲍迪苷D

利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)蔗糖合酶AtSUS3构建活化糖配体尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDPG)再生体系,与高效催化莱鲍迪苷D(rebaudioside D,RD)合成的糖基转移酶协同偶联完成RD的高效生物催化。从拟南芥cDNA克隆获得AtSUS3基因,将其装配至pET28a获得表达质粒pLW105,随后pLW105与携带糖基转移酶EUGT11基因的质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3)构建双酶共表达工程菌。在不添加UDPG或者尿核苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)的条件下,以上述双酶共表达工程菌全细胞催化莱鲍迪苷A(RA)获得的底物摩尔转化率大于80%,RD产量达到930 mg/L。随后构建双酶基因串连质粒pLW108及双酶共表达大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。用串连质粒构建的工程菌催化效果与双质粒共转化相同。采用共表达双酶工程菌的发酵破碎粗酶进行催化,结果显示以粗酶催化可简化催化体系,并可将细胞催化体系所需高质量浓度蔗糖用量降至质量浓度5 g/100 mL,同时在不添加外源UDPG的条件下实现RD的高效生物催化,RA底物摩尔转化率达到93%,RD产量约为1 051 mg/L。