莲子草假隔链格孢SF-193固体培养基组分的响应曲面法优化

为获得空心莲子草生防菌SF-193固体培养基的最佳配方,本研究采用响应曲面法(response surface methodology,RSM)优化空心莲子草生防菌SF-193固体培养基各组分的配比,探讨各组分(大米粉,大豆粉,胡萝卜粉)对菌丝生长的影响。结果表明,大豆粉和胡萝卜粉对生防菌SF-193菌丝生长的线性效应显著,大米粉分别与大豆粉、胡萝卜粉之间的交互作用显著。固体培养基的最佳配方为大米粉61.7 g/L,大豆粉9.0 g/L,胡萝卜粉1.1 g/L。

莲子草假隔链格孢SF-193固体发酵培养基的筛选及其对空心莲子草的控制效果

【背景】空心莲子草是一种源于南美洲且正在我国不断传播的外来入侵植物。莲子草假隔链格孢是空心莲子草的强致病菌,能引起空心莲子草茎叶发病,抑制空心莲子草生长。【方法】选择以麦麸、大米、玉米芯粉、玉米粉、稻秸秆粉为基料,棉籽壳、稻秕壳和大豆粉为辅料,按照一定质量比配制固体培养基,筛选适合莲子草假隔链格孢SF-193大量生产的有效组分;同时研究培养基含水量和6种金属离子对SF-193菌落生长的影响。【结果】在以大米和大豆粉质量比为3:1和5:1的培养基上SF-193菌落面积最大,其次为大米和棉籽壳质量比为5:1的培养基。在含水量为20%和30%的培养基上SF-193菌落面积显著大于其他培养基。Mg2+和Mn2+对SF-193菌落生长影响较小,Zn2+对SF-193菌落生长具有显著的抑制作用,而SF-193菌落在含Cu2+和Fe3+的培养基上不能生长。田间控草试验表明,固体发酵生产的菌粉对空心莲子草的致病性显著高于液体菌,用量为50g.m-2时,10d后空心莲子草的病情指数达86.1。【结论与意义】利用固体培养基发酵生产的莲子草假隔链格孢对空心莲子草的防除效果显著优于液体发酵。因此,莲子草假隔链格孢SF-193固体发酵菌粉可能在生物防治空心莲子草方面具有重要作用。

莲子草假隔链格孢SF-193的细胞壁降解酶研究

采用3,5-二硝基水杨酸法分析了莲子草假隔链格孢Nimbya alternantherae SF-193菌株在活体内外产生的羧甲基纤维素酶(Cx)、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和多聚半乳糖醛酸酶(PG)的活性。结果表明,SF-193可产生Cx、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和PG,且4种细胞壁降解酶在活体外和活体内的活性显著不同。其发酵滤液中以PG活性最高,其次为木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和Cx;在空心莲子草叶片内以Cx活性最高,其次为β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和PG。在活体内,4种酶活性随接种天数和温度的变化而不同。Cx和β-葡萄糖苷酶的活性在接种第3d达到最大,木聚糖酶和PG活性则分别在第2d和第5d达到最大;Cx、β-葡萄糖苷酶和PG活性在30℃时最高,而木聚糖酶活性在35℃时最高。

莲子草假隔链格孢SF-193菌株的复壮对其产孢量和致病性的影响

【背景】莲子草假隔链格孢是空心莲子草的重要生防菌,但长时间保存或继代培养会导致该菌株产孢量和致病性显著下降。【方法】通过对初始菌株回接、分离、纯化和鉴定相继获得复壮一代和二代菌株,分别在3、6、9d后对初始菌株、复壮一代和二代菌株进行产孢培养,比较其产孢量;同时比较分析了这3代菌株的液体发酵原液和1:10稀释液对空心莲子草的防除效果。【结果】获得了10株复壮一代和10株复壮二代菌株,20株菌对空心莲子草均有致病作用,且产生的分生孢子形态特征与初始菌株一致。与初始菌株相比,复壮菌株的产孢量显著提高且达到最大产孢量的时间显著短于初始菌株。其中,复壮二代菌株的孢子量是初始菌株的4.8倍,其次为复壮一代菌株,产孢量是初始菌株的4.1倍;复壮菌株达到最大产孢量的时间为3d,初始菌株为6d。复壮菌株一代和二代的原液对空心莲子草的致病性分别比初始菌株提高了4.65%和9.82%,1:10稀释液的致病性分别提高了25.79%和16.55%。【结论与意义】对长期保存或继代培养的空心莲子草生防菌复壮可显著提高其产孢量和致病性,对维持生防菌遗传性状的稳定性和提高对空心莲子草的防效具有重要意义。

假隔链格孢(Nimbya alternantherae)SF-193防除空心莲子草田间高效使用技术研究

假隔链格孢（Nimbya alternantherae）SF-193是空心莲子草的强致病菌，能引起空心莲子草快速发病，有效地抑制空心莲子草生长。本文通过田间试验研究了生防真菌SF193在田间的高效使用技术，结果表明，SF-193在田间防除空心莲子草的最适合浓度配比为1：5～1：10；3种喷雾器喷施SF-193对空心莲子草致病力无显著性差异；SF-193对新叶龄的防除效果好于对老叶龄的防除效果；与化学除草剂草甘膦、氯氟吡氧乙酸相比，SF-193原液7d后对空心莲子草的鲜重防效高于氯氟吡氧乙酸，但与草甘膦的防效没有显著性差异。

假隔链格孢SF-193的产孢特性及其分生孢子对空心莲子草的致病力

为了探明SF-193的产孢特性,选取了8种产孢培养基,研究分别在自然光、黑光灯和黑暗的条件下对SF-193产孢的影响程度。试验结果表明,在黑光灯连续照射11d后,SF-193在PCA、CA、SNA、Czapek和组织煎汁5种培养基上有少量分生孢子产生,而在其他3种琼脂培养基上不产生分生孢子。PCA培养基中马铃薯与胡萝卜比例为1：5时,SF-193在9d后产孢量最大,10×10倍显微观察约60个孢子/视野;当CA培养基中的胡萝卜含量提高至80%左右时, SF-193在3d后达到最大产孢量,10×10倍显微观察约300个孢子/视野。研究了黑光灯照度与胡萝卜含量对SF-193产孢的影响。结果表明,在黑光灯照度为195～210lx、胡萝卜含量约为0.8g/ml时,SF-193在25℃培养6d后产孢量最大,约为6.5×10^5个孢子/ml。SF-193的分生孢子在田间对空心莲子草的致病力测定结果表明,经孢子浓度10^4个孢子/ml处理后,空心莲子草的病情指数为67.7。

莲子草假隔链格孢菌除草活性产物研究初报

莲子草假隔链格孢 (Nimbyaalternantherae)可产生两类不同类型的致病毒素 (毒素A和毒素B) ,毒素A引致空心莲子草叶片水渍状死亡 ,毒素B引致局部坏死斑。病原菌在不同培养基中产生不同类型的毒素 ,在改良Fries基本培养基 3号中只产生毒素A ,在改良Czapek培养基和Richard培养基中只产生毒素B ,而在PS ,PD和改良Fries3号基本培养基中两类毒素均产生。 2 5～ 4 0℃ ,振荡 (12 0r/min)及pH 7～ 8较利于毒素A的产生。毒素A为一种分子质量在 10 0 0 0u以下的弱极性物质 ,具热不稳定性 ,煮沸

莲子草假隔链格孢毒素对空心莲子草叶片和根尖组织超微结构的影响

用不同质量浓度的莲子草假隔链格孢毒素处理空心莲子草叶片和根尖,研究毒素对组织超微结构的影响。结果表明:毒素处理后,叶片细胞质壁分离、质膜消解,叶绿体片层紊乱、膜消解,线粒体膜破裂、嵴消解;根尖细胞质壁分离、质膜消解,线粒体膜破裂、嵴消解,分生区和表皮细胞空泡化并萎缩。随毒素质量浓度的增加和处理时间的延长,对叶片和根尖细胞破坏作用逐渐增强。

莲子草假隔链格孢毒素的分离纯化与结构鉴定

Nimbya alternantherae is a leaf spot fungus isolated from Alternanthera philoxeroides.It could produce phytotoxin to Alternanthera philoxeroides in several kinds of liquid media,especially in modified Fries.The filtrate of the pathogen was chromatographed on a DM-130 colophony column eluting with methanol,and evaporation of the solvent gave a brown mush.The crude product was then extracted with ethyl acetate.The toxin could be purified as white needles by re-crystallizing from benzene and acetone（volume ratio is 1∶1） and silica gel chromatograph.The results of elemental analysis,MS,IR and NMR indicate that molecular weight of the toxin was 240,formula was C11H12O6,and its chemical name was 2-acetyl-3,4-dihydroxy-5-methoxyphenyl-acetic acid（Vulculic acid）.

莲子草假隔链格孢毒素对空心莲子草根尖组织防御酶活性的影响

研究了莲子草假隔链格孢Nimbya alternantherae毒素2-乙酰基-3,4-二羟基-5-甲氧苯基-乙酸(Vulculic acid)对空心莲子草Alternanthera philoxeroides根尖组织防御酶活性的影响.结果表明:Vulculic acid能够引起空心莲子草根尖组织防御酶活性发生变化,在处理初期,细胞内过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性均低于对照,而苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性高于对照.

假隔链格孢SF-193菌丝的生长特性及其寄主选择性

室内条件下,研究了不同培养条件和营养条件对空心莲子草生防真菌假隔链格孢Nim- bya alternantherae菌株SF-193菌丝生长的影响,测定其对27科86种植物的安全性。结果表明,生防真菌SF-193菌株的最佳生长温度约为30℃,最适生长pH值为10～11,生长过程中需要适当的空气,光照条件对SF-193生长没有影响;以玉米粉、黄豆粉作为碳源,以蛋白胨、牛肉膏作为氮源的培养基成分最有利于SF-193菌株的生长。SF-193菌株对绝大多数非靶标植物、尤其是对大田主要农作物和蔬菜均不致病,安全性良好。

莲子草假隔链格孢毒素的基本性质与组分分析

莲子草假隔链格孢在改良Fries培养基中能够产生使空心莲子草致病的毒素，培养滤液经DM-130大孔树脂吸附-甲醇洗脱-蒸干-乙酸乙酯浸提，获得毒素粗提物。经HPLC分析，毒素粗提物由5个组分组成，其中最大的吸收峰是保留时间为9．520min的组分。基本性质研究结果表明，毒素为非蛋白类、相对分子质量在10000以下的小分子物质，在121℃和pH1～11的条件下能够稳定存在。

莲子草假隔链格孢毒素Vulculic Acid的合成

Vulculic acid是从莲子草假隔链格孢(Nimbya alternantherae)的代谢产物中分离得到的一种真菌毒素,它对空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)等多种杂草有致病活性,是一种潜在的除草活性物质.本文报道了Vulculic acid的化学合成.从可商业购买的3,4,5-三甲氧基苯乙酸出发,经甲酯化、傅克乙酰化、脱三甲基化、选择性上单甲基化以及水解等5步反应合成了目标产物,总产率为21%.生物活性测试结果表明,合成的Vulculic acid对空心莲子草有致病活性,所致症状与天然Vulculic acid一致.

莲子草假隔链格孢毒素的致病机理研究

就莲子草假隔链格孢（Nimbya alternantherae）毒素Vuculic acid对空心莲子草（Alligaror alternanthera）的致病机理进行了研究．分别用不同含量的毒素溶液处理空心莲子草离体叶片，测定其对叶片组织细胞膜透性、丙二醛（MDA）含量、细胞内Na^＋、K^＋渗漏量以及过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化氢酶（CAT）活性的影响．结果表明，空心莲子草叶片组织浸出液的相对电导率随毒素含量的增高和处理时间的增加而增大；Na^＋的渗漏量高于对照；叶片组织MDA的含量也高于对照；空心莲子草叶片组织内CAT和POD活性在处理前、中期（1～6h），均随时间的延长呈上升趋势，但酶活性都低于对照；APX活性高于对照．

莲子草假隔链格孢在不同条件下的生长和产孢能力

莲子草假隔链格孢(Nimbyaalternantherae)在PDA、PCA、NBA、CMA、MA、ZA、GA、OA、Czapek和“组织煎汁”等10种培养基上均能生长;在PCA上产孢最多,而在Czapek培养基上不能产孢病菌经回接后从病茎再分离,产孢能力可提高1倍多病菌在30℃下生长最快,25℃下产孢量最大,15℃下则不产孢全光照(3000lx)可促进菌丝生长。

莲子草假隔链格菌粗毒素生物活性研究

利用种子生测法,研究了莲子草假隔链格菌(Nimbya altermantherae)粗毒素对农田12种杂草的生物活性及6种作物的安全性。结果表明,该粗毒素对12种田间常见杂草种子萌发及根长、芽长均有抑制作用,且随粗毒素溶液浓度的提高抑制作用相应增强。在浓度为50μg/ml时,粗毒素对光头稗(Echinochloa colonum)、荠菜(Capsella bursa-pastoris)、升马唐(Digitaria ciliaris)的萌发表现出一定的抑制作用,在粗毒素浓度为400μg/ml时,对荠菜,千金子(Leptochloa chinensis)的萌发具有强烈的抑制作用,萌发率为0。在粗毒素浓度为50μg/ml时,对鳢肠(Eclipta prostrata)、光头稗Echinochloa colonum)、升马唐(Digitaria ciliaris)、菵草(Beckmannia syzigachne)、看麦娘(Alopecurus aequalis)等杂草的根长、芽长也表现出一定的抑制作用。粗毒素对不同作物萌发的影响也有差异,对花生(Arachis hypogaea)、大豆(Glycine max)的萌发及根长的生长无抑制作用,其中对花生的根长还有一定的促进作用。粗毒素浓度小于或等于400μg/ml时,对油菜(Brassia campestris)的萌发及根长、芽长的生长无抑制作用。粗毒素对小麦(Triticum aestivum)不安全。

空心莲子草病原真菌的分离筛选及其菌株SF-193种的鉴定

在空心莲子草上分离获得真菌295株,其中有191株对空心莲子草具有致病能力,有12株致病力较强(病级5级以上)。经过复筛发现菌株SF-193对空心莲子草的致病能力最强。在田间自然条件下人工接种200株空心莲子草,SF-193菌株能够导致发病程度为6级的可达到80%以上。采用18S rDNA和ITS核酸序列同源比对,对菌株SF-193进行形态学鉴定和分子鉴定,两种鉴定结果都为莲子草假隔链格孢。

莲子草假隔链格孢聚酮合成酶基因的筛选、克隆及生物信息学分析

通过对莲子草假隔链格孢转录组测序中聚酮合成酶基因的表达分析,发现编号为Unigene0007998的基因在莲子草假隔链格孢中的表达量远高于其他聚酮合成酶,推测该基因与莲子草假隔链格孢的致病力相关。为进一步了解该基因的功能,本研究克隆了该基因并对其编码的蛋白进行了生物信息学分析。结果表明Unigene0007998编码的蛋白由2089个氨基酸组成,是一种稳定的、亲水性分泌蛋白,不存在跨膜结构。

莲子草假隔链格孢对空心莲子草活性氧代谢的影响

为了明确活性氧(ROS)在莲子草假隔链格孢Nimbya alternantherae侵染空心莲子草过程中的作用,采用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化学还原法、二氨基联苯胺(DAB)组织染色法和分光光度法测定了莲子草假隔链格孢SF-193侵染空心莲子草后超氧阴离子(O2﹒-)产生速率、过氧化氢(H2O2)含量、抗氧化酶体系(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD))活性和丙二醛(MDA)含量。结果显示,接种莲子草假隔链格孢SF-193的叶片经NBT和DAB染色后检测到ROS的大量累积。叶片内的O2﹒-产生速率和H2O2含量随接种时间显著升高,接种后48 h均达到峰值,分别为2.33 nmol.min-1.g-1FW和11.78μmol.g-1FW,是对照的2.1倍和2.5倍;SOD、CAT和POD活性均在接种后8 h达到峰值,分别为277.75、23.47和444.92 U.min-1.g-1FW,之后逐渐下降;MDA含量随接种时间持续上升,72 h时达到峰值,为5.20μmol.g-1FW。表明莲子草假隔链格孢侵染空心莲子草打破了ROS产生与清除之间的平衡,导致植物细胞内的ROS迅速上升,对叶片细胞造成严重破坏。