决明不同组织莽草酸激酶基因的表达模式与蒽醌含量分析

分析莽草酸激酶基因在决明(Cassia obtusifolia L.)不同组织中的表达模式,同时测定不同组织中总蒽醌的含量,为研究莽草酸激酶在决明蒽醌生物合成中的作用提供理论依据。提取决明种子、愈伤组织与成熟叶等10个不同组织的总RNA,反转录合成c DNA,采用荧光定量PCR检测莽草酸激酶基因在不同组织的表达情况。同时,采用超声波强化法提取决明不同组织的总蒽醌,通过分光光度法测定其含量。莽草酸激酶基因在决明的根、愈伤组织与子叶中的表达量较高,在种子、果荚与茎中表达量较低。决明的种子、果荚、花及根中蒽醌类化合物含量较高,而成熟叶和胚轴则不含。决明中蒽醌的生物合成涉及多个组织,其生物合成的早期阶段(包括莽草酸激酶催化的反应)主要发生在根与子叶等组织,形成的中间产物运输到种子等组织中,完成生物合成的后期阶段并积累蒽醌终产物,为合理利用决明不同药用部位提供理论依据。

葡萄莽草酸激酶基因(VvSK)的克隆与表达分析

以"赤霞珠"葡萄(Vitis vinifera)果实为实验材料,采用电子克隆和分子克隆相结合的方法,克隆到莽草酸激酶基因,命名为VvSK。VvSK的cDNA编码区全长906bp,编码301个氨基酸残基。预测该蛋白质相对分子质量为33.2×103,等电点为8.6,VvSK的DNA全长4309bp,包含10个外显子和9个内含子,定位于7号染色体上。VvSK编码的蛋白与其他植物中同类酶在氨基酸水平上的同源性最高达64.52%。系统进化树分析显示VvSK与毛果杨SK基因亲缘关系较近。荧光实时定量PCR分析结果表明,VvSK在葡萄果实、茎、叶和叶柄组织中均有表达,在不同发育期果实的果皮、果肉和种子中相对表达量存在差异,与UV-A和UV-B照射处理相比,UV-C照射对VvSK基因表达的诱导效应较明显。

以莽草酸激酶为靶点的新型抗结核先导化合物的发现

莽草酸激酶是莽草酸途径中的关键蛋白,对结核分枝杆菌的生存至关重要。本研究首先建立了结核分枝杆菌莽草酸激酶(Mycobacterium tuberculosis shikimate kinase,Mt SK)抑制剂筛选模型,然后与耻垢分枝杆菌表型筛选方法联用,对12万个化合物进行筛选,最终发现了1个对Mt SK蛋白有抑制作用且同时抑制耻垢分枝杆菌生长的化合物—IMB-T5297[(E)-3-(3-(3-氯-5-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基氧基)苯基)丙烯酰基)-6-甲基-2H-吡喃-2,4(3H)-二酮]。体外酶促反应抑制实验表明,化合物IMB-T5297对Mt SK的半数抑菌浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为1.745μg·mL^(-1)。表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)实验结果显示化合物IMB-T5297与Mt SK蛋白的亲和力KD值为2.151×10-5 mol·L-1。通过计算机软件模拟化合物与蛋白的分子对接模型,初步分析了化合物IMB-T5297与Mt SK的作用位点,并对其中预测的5个关键氨基酸位点进行了突变研究。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]实验表明,化合物IMB-T5297对哺乳动物细胞的毒性很低。体外抗结核活性实验表明,化合物IMB-T5297对结核分枝杆菌标准株H37Rv最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为49.723μg·mL^(-1)。综上所述,虽然化合物IMB-T5297的抗结核活性较弱,但对Mt SK抑制作用较强,通过结构改造可能成为新的抗结核先导化合物。

大肠杆菌生产莽草酸的基因工程菌构建

莽草酸是芳香族氨基酸合成中的重要中间代谢物,可用于多种药物的化学合成.在代谢工程理论的指导下,构建积累莽草酸的高产菌株.通过构建敲除编码莽草酸激酶的基因aroL与aroK的菌株阻断莽草酸的代谢;通过构建敲除编码奎尼酸/莽草酸脱氢酶的基因ydiB的菌株减少副产物的合成;同时通过构建人工操纵子过表达编码DAHP合酶、莽草酸脱氢酶、脱氢奎尼酸脱水酶和三脱氢奎尼酸合酶的基因aroG,aroE,aroD和aroB以强化莽草酸合成途径.最终得到E.coli SHIKΔaroLΔydiB菌株,摇瓶发酵能够积累莽草酸5.5g/L.

用Red重组系统快速敲除大肠杆菌aroL和aroK基因

目的:利用Red重组系统构建aroL和aroK缺失的大肠杆菌工程菌株。方法:本研究应用PCR扩增两翼与目的基因上下游同源的、含有氯霉素抗性基因片段,电击转化大肠杆菌BW25113。在阿拉伯糖诱导下,含有质粒pKD46的菌株DH5α表达λ噬菌体的3个重组蛋白,利用含同源臂的氯霉素抗性片段分别替换目的基因aroK和aroL,并进一步利用FTP位点专一性重组将氯霉素抗性基因删除。结果:成功地敲除了aroK和aroL基因。结论:莽草酸是一种具有极高价值的精细化工产品和医药中间体,具有广泛的医药、化工应用价值。莽草酸是莽草酸途径中的重要中间产物,它在莽草酸激酶(aroK和aroL)的作用下流向3-磷酸莽草酸,阻碍了莽草酸在大肠杆菌体内的堆积。敲除上述基因将为使用大肠杆菌发酵生产莽草酸奠定基础。