一株产菊粉内切酶酵母Kluveromyces NSY5发酵条件优化

在单因素实验基础上,采用Plackett-Burman实验设计对影响KluveromycesNSY5发酵产菊粉内切酶的碳源、氮源、无机盐、发酵时间等8个选择因素进行筛选,结果显示,培养基的菊芋汁浓度、摇瓶装液量和发酵时间对菌株发酵产酶具有显著影响。根据实验结果和经验方法对显著影响因素的优化取值范围进行预估,并选择适当的水平设计,用Box-Behnken中心组合实验和响应面寻优分析找出显著影响因素的极优值,验证实验结果表明,采用优化的菊芋汁浓度3.5%、装液量50 mL/250 mL、发酵时间56 h,KluveromycesNSY5摇瓶发酵液中的菊粉内切酶I/S比值达到18.29,比初始发酵条件下的菊粉内切酶I/S比值12.4提高47.5%,优化预测值和实验验证值的相对误差为0.26%。

毕赤嗜甲醇酵母工程菌高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的研究

目的:对毕赤嗜甲醇酵母工程菌inu-26高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的条件进行优化,找出最佳的外源蛋白表达条件。方法:在摇瓶优化培养的基础上进行发酵罐高密度培养,优化最佳产酶条件。结果:以葡萄糖为碳源、微量元素添加量100～200mL/L、甲醇浓度1g/L、pH6.0～7.0、诱导时间96h时酶的表达量最高;摇瓶模拟高密度培养表明影响酵母生长的最主要因素葡萄糖和硫酸铵的最佳浓度分别为20～45和11.5g/L;利用培养基F1进行高密度培养优于其他培养基,工程菌生长符合指数生长曲线,细胞生长延迟期为1.36h,比生长速率μ为0.4846h-1。结论:以葡萄糖为碳源,采用葡萄糖-甲醇混合诱导和100%甲醇单一诱导相结合,在菌体鲜重约为280g/L时连续诱导96h,菌体生长良好,不会出现自溶,且酶的表达量最高,为摇瓶培养的3倍多,酶活最高可达540 U/mL。

菊粉内切酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质测定

为了实现菊粉内切酶在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高活性表达并对表达的菊粉内切酶酶学性质、水解菊粉的产物进行分析。通过下载无花果曲霉菊粉内切酶基因的编码序列,做了密码子优化后进行全基因合成,然后在毕赤酵母GS115中表达。对表达的菊粉内切酶的酶活、最适反应温度、最适pH值、热稳定性进行了分析,最后对酶水解菊粉的产物进行了高效液相色谱(HPLC)分析。摇瓶表达的酶活力为420 U/mL,酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为6.0。HPLC分析表明:表达的菊粉内切酶酶解底物菊粉的主要产物为低聚果糖,聚合度为3~5之间。构建的工程酵母可以高效表达菊粉内切酶,可以用于生产低聚果糖。

菊粉化学和微生物菊粉内切酶研究进展

菊糖作为多聚果糖类碳水化合物,其物理化学性质已较早地得到研究,之后菊糖分子结构得到深入的研究。近年以开发菊粉系列产品作为功能性食品成分为目标,关于微生物菊粉内切酶酶学性质、基因结构、工程菌株构建与生产应用方面的研究进展迅速,如已经成功地构建2种高表达内切菊粉酶的基因工程酵母。本世纪菊粉生物技术将大力推动菊粉产业的发展。

毛壳霉内切菊粉酶的纯化与性质

毛壳霉 (Chaetomiumsp .)C34发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE 纤维素 11离子交换层析、Q SepharoseFastFlow离子交换层析、SephacrylS 2 0 0凝胶过滤、PhenolSepharoseTM HP疏水层析 ,得到电泳纯的内切菊粉酶组分 ,纯化倍数为 30 8倍 ,活力回收率为 7 7%。用SDS PAGE测得该酶亚基的分子量为 6 6kD。菊粉酶的最适pH为 6 0 ,最适温度为 5 0～ 5 5℃。菊粉酶在 5 0℃以下 ,pH5 0～ 8 0时较稳定。Cu2 + 完全抑制酶的活性 ,Mn2 + 、Zn2 + 、Fe2 + 、EDTA以及NBS(N bromosuccinimide ,N 溴代丁二酰亚胺 )对该酶有很强的抑制作用。该酶对菊粉有较强底物专一性 ,产物主要为低聚果糖 ,也可作用于蔗糖 ,I S值为 2 0。以菊粉为底物时 ,Km 为 0 199mmol L ,Vmax为 115 μmol (mg·min)。

Aspergillus ficuum内切菊粉酶的酶解条件优化及酶解动力学研究

采用Aspergillus ficuum内切型菊粉酶Endo-Ⅰ酶解商品菊粉制备低聚果糖,经正交试验确定其最适酶解条件为:pH5.0、温度45℃、底物浓度50g/L、加酶量10U/g,在此酶解条件下,低聚果糖得率可达70.37%,酶解产物以DP3和DP4为主,同时含有一定量的DP2、DP5、DP6、DP7、DP8;在此条件下酶解自制菊芋干粉时,低聚果糖得率为41.72%,酶解产物以DP3～DP6的低聚果糖为主,DP2含量很少,同时酶解液中还含有大量的果糖;在此条件下酶解自制菊芋提取液时,低聚果糖得率高达79.80%,酶解产物中除DP6含量较低外,其他各聚合度的低聚糖分布比较平均。在此相同酶解条件下酶解72h时,3种底物中,以菊芋提取液酶解后的低聚果糖得率最高。因此,应用Aspergillus ficuum内切型菊粉酶Endo-Ⅰ酶解菊芋制备低聚果糖宜选择菊芋提取液作底物。

一株产内切菊粉酶菌株培养条件的响应面优化

从新疆石河子盐碱地菊芋生长根际土壤中,分离筛选得到10株具有内切菊粉酶活力的菌株,复筛得到1株高产内切菊粉酶活力菌株,将其命名为G-60。在单因素实验的基础上,采用Plackett-Burman实验法对8个因素进行了显著因素的筛选,结果表明,菊粉浓度、蛋白胨浓度和装液量对内切菊粉酶酶活影响显著;通过最陡爬坡实验及Central Composite Design设计进一步优化,得到最佳发酵产酶条件为:菊粉浓度66.5g/L、蛋白胨浓度29.1g/L、装液量49.38mL,内切菊粉酶活力达24.62U/mL,与优化前相比提高了1.55倍。

Aspergillus ficuum内切菊粉酶基因在大肠杆菌中表达

研究内切菊粉酶基因在大肠杆菌中表达,利用基因工程的原理和方法,将来源于Asper-gillus ficuum JNSP5-06的内切菊粉酶基因(endoI)克隆到pET-28a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组菌经IPTG诱导后对表达产物进行酶活检测和酶水解产物分析。结果表明已成功构建表达载体pET28a-endoI,表达后的粗酶活为35 U/mL发酵液;重组酶水解菊粉的产物经TLC分析证实酶液具有内切菊粉酶活性,水解产物主要为低聚二糖、三糖和四糖。为其应用和工业化生产奠定基础。

利用原生质体再生技术选育内切型菊粉酶高产菌株

利用原生质体制备与再生技术选育内切型菊粉酶高产菌株,以I200913作为出发菌株(酶活为0.413 u/m L),研究了在不同酶配比酶解液、不同酶解温度、不同酶解时间的条件下,对原生质体制备、再生以及内切型菊粉酶酶活的影响。研究结果表明,在酶配比为:纤维素酶0.7%+蜗牛酶0.2%+溶菌酶0.1%=1%,酶解温度为30℃,酶解时间为2.5h条件下,原生质体形成率最高,为22.32%。在酶配比为:纤维素酶0.7%+蜗牛酶0.2%+溶菌酶0.1%=1%,酶解温度为30℃,酶解时间为2.5h条件下,原生质体再生率最高,为16.02%。在酶配比为:纤维素酶0.7%+蜗牛酶0.2%+溶菌酶0.1%=1%,酶解温度为30℃,酶解时间为2.5h条件下,原生质体再生菌株内切型菊粉酶酶活最高为0.598 u/m L,比出发菌株提高了28%。

低能离子束诱变选育高产内切型菊粉酶菌株

从18株黑曲霉菌株中,筛选得到产内切型菊粉酶酶活最高的一株菌株,编号为08013,酶活为3.01U/mL。用低能离子束N^+对选育出的黑曲霉菌株进行诱变研究,当N^+注入能量为10Kev,注入靶室的真空度为10^(-3)Pa,脉冲剂量为10^(14) N^+/cm^2s,N^+注入剂量为60×2.6×10^(13)N^+/cm^2时,筛选出一株内切型菊粉酶酶活最高的菌株,编号为08-DT-60-09,酶活为4.20 U/mL,比出发菌株的酶活提高了39.53%。

酵母产内切型菊粉酶水解菊芋生产饲用低聚果糖的研究

利用酵母所产内切型菊粉酶水解廉价菊芋 30min后，其饲用低聚果糖的最高含量达 42％，应用于饲料工业具有广阔的生产前景。

内切型菊粉酶生产菌株的筛选及诱变选育

采用透明圈法筛选得到了产菊粉酶的多株菌株，并得到了１株产内切型菊粉酶较高的隐球酵母属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）菌株Ｌ１，以Ｌ１作为出发菌株经Ｃｏ６０诱变后，得到１株产内切型菊粉酶最好菌株Ｃ１０，其诱变后低聚果糖得率比诱变前提高了５２．６％，酶活力提高了５１．９％。

分子对接和定点突变提高内切菊粉酶的催化活力

内切菊粉酶可以有效地水解菊粉得到低聚果糖(inulooligosaccharides,IOS)。低聚果糖是一种强效益生元,对人体健康有益,具有广泛应用价值。前期研究获得了Lipomyces starkeyi NRRL Y-11557来源的内切菊粉基因inu3B,并在大肠杆菌中进行了克隆表达。为进一步提高该酶催化活力,利用同源建模预测INU3B的三维结构,结合分子对接技术确定底物结合口袋附近的氨基酸,将筛选的关键氨基酸分别突变成丙氨酸,获得突变体M46A,比酶活力达到2611.40 U/mg,是原始酶的1.26倍。这可能是由于该位点的改变减小了结合口袋的外表面积、体积和深度,增强了酶与底物结合,从而增加了酶活力。M46A突变株具有工业生产低聚果糖的应用前景,也为定点突变技术改造酶活性提供了新思路。

黑曲霉中内切菊粉酶基因及其全合成基因在解脂耶氏酵母中表达的比较

利用酵母密码子偏爱性将黑曲霉(Aspergillus niger)中的内切菊粉酶(Endoinu linase)基因通过基因全合成的方式合成为酵母密码子偏爱性的内切菊粉酶基因。然后将原始和全合成的内切菊粉酶基因克隆到解脂耶氏酵母表达载体PINA1296上,得重组解脂耶氏酵母表达载体pHBM2020、pHBM2021,将两种质粒分别转化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)CLIB725,筛选得到重组解脂耶氏酵母CLIB725(pHBM2020)、CLIB725(pHBM2021),将两种重组酵母摇瓶培养,经SDS-PAGE、测酶活检测表明两种基因在解脂耶氏酵母中都有表达,全合成菊粉酶比原始菊粉酶酶活要高。

内切菊粉酶在大肠杆菌中的高效表达

内切菊粉酶可以有效地水解菊粉得到低聚果糖(IOS),低聚果糖是一种水溶性膳食纤维,应用广泛。为了实现内切菊粉酶的高效表达,通过无花果曲霉中的inu2基因,成功在大肠杆菌中重组表达。为提高表达水平,通过使用pel B和omp C代替本身的信号肽序列,来研究不同的信号肽对菊粉内切酶表达的影响。此外,还通过正交试验的方法优化了IOS的催化条件。研究结果表明,用pel B代替本身的信号肽的E.coli INU2-A3的酶活最高,达到75.22 U/mg。在菊粉为150 g/L,纯化的菊粉内切酶为5 U/g菊粉,55℃,p H 4.6,反应24 h时,低聚果糖的收率达到了94.41%,主要的水解产物为DP3-DP7。

产内切菊粉酶的海洋放线菌菌株的筛选与鉴定

获得高活性内切菊粉酶微生物菌株是以菊粉生产低聚果糖的基础。本研究采用以菊粉为唯一碳源的选择培养基从鸭绿江滨海湿地海泥样品中筛选获得14株产菊粉酶菌株。通过摇瓶复筛,获得3株产较高活力内切菊粉酶的放线菌菌株,其酶活力分别为14.13、18.24、28.52U/m L。通过16S rRNA测序分析和形态观察确定该3株菌分别为孔雀石褐链霉菌(Streptomyces malachitofuscus)、棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)、锂链霉菌(Streptomyces carpaticu)。其产酶活性均高于目前已报道产内切菊粉酶放线菌菌株,为内切菊粉酶工业化生产提供了依据。

内切型菊粉酶酶学性质的研究

以食品与生物工程实验中心酶工程实验室保藏的黑曲霉菌种作为菌源,利用黑曲霉细胞深层发酵法生产内切型菊粉酶。通过测定发酵液酶活,从20株黑曲霉菌株中筛选得到产菊粉酶活力最高的编号为E133131的一株黑曲霉菌株,酶活为0.66U/mL。对黑曲霉E133131号菌株所产内切型菊粉酶进行了酶学性质的研究,得到以下结论：最适pH为4.5;最适温度为60℃;最佳底物浓度为4mmol/L;米氏常数（Km）为1.434mmol/L;Ca^2＋对内切型菊粉酶有激活作用,当加入浓度为1.5mmol/L的Ca^2＋时,使酶活从0.66U/mL提高到1.09U/mL;Mn2＋、Cu^2＋和Mg2＋对内切型菊粉酶有抑制作用,其中Cu^2＋的抑制作用最大,使酶活从0.66U/mL降低到0.095U/mL;Na^＋、K＋、Zn2＋、Fe2＋、Mg2＋对内切型菊粉酶的酶活影响不大;pH在4.5-8.0范围内,温度在50-60℃之间,内切型菊粉酶的酶活力较稳定。

黑曲霉内切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达及应用研究

利用PCR方法从黑曲霉(Aspergillus niger)基因组DNA中扩增内切菊粉酶(endo I)全长基因(1551 bp),经序列分析后将其连接到表达载体p PIC9K上,得到重组表达载体p PIC9K-endo I。重组质粒经Sac I线性化并电转化到毕赤酵母GS115,阳性转化子进行发酵产酶后考察其酶学性质。酶学性质研究表明,重组酶的最适p H和最适温度分别为5和60℃,重组酶在55℃下保温9 h后,重组菊粉内切酶仍残余83.2%的活性,表现出极高的热稳定性,Cu^(2+)、Ag^+对重组酶有明显的抑制作用。对内切菊粉酶水解菊粉的过程研究表明,重组内切菊粉酶能在8 h内将4%(w/v)菊粉水解为3~6个聚合度的低聚果糖,水解11 h后,低聚果糖得率达到63.5%,本研究为进一步开发以菊粉为原料生产低聚果糖的应用奠定了基础。

内切酶法制取菊苣低聚果糖工艺条件的研究

目的:利用毕赤嗜甲醇酵母表达的重组黑曲霉菊粉内切酶,从菊苣菊粉中制取低聚果糖。方法:用重组黑曲霉菊粉内切酶酶解水提菊粉,用薄层色谱、离子色谱分析酶解产物,研究酶解条件,分析产物组成。结果与结论:菊粉浓度为20～160g/L、酶浓度为12U/g菊粉时,低聚果糖的最大产率逐渐升高然后下降;在接近最大溶解度200g/L时,菊粉寡糖最大产率为62.0%,最大产率与酶的用量无关,但提高酶的浓度可以缩短达到最大产率的时间。pH5.5、50℃、菊粉浓度为40g/L、酶用量为12U/g菊粉时,可达到最大产率64.6%;酶解的产物主要为GF2到GF10的菊粉寡糖。

Aspergillus ficuum菊粉酶的分离纯化及其酶解菊粉制备低聚果糖

采用硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、DEAE-Cellulose离子交换色谱等分离纯化技术，从Aspergillus ficuum菌株混合酶系中分离得到4种菊粉酶组分，应用薄层层析法分离各组分水解菊粉的产物，发现其中3种组分主要含外切菊粉酶，一种主要含有内切菊粉酶。进一步对所得到的内切菊粉酶组分酶解菊粉制备低聚果糖进行了研究，研究了底物浓度、加酶量、反应温度和反应pH对低聚果糖制备的影响，确定其最适反应条件为：底物浓度50g／L、加酶量10U／g底物，反应温度45℃，反应PH6．0。在此条件下反应72h，菊粉酶解率达74％，低聚果糖得率可达50％以上，酶解产物以DP2～DP4为主。