重组血管内皮受体F3肽-铜绿假单胞菌外毒素A蛋白抑制肿瘤生长的实验研究

检测融合表达的F3肽-铜绿假单胞菌外毒素A(F3-PE39KDEL)在抗肿瘤细胞及活体肿瘤抑制方面的作用效果。用MTT法检测F3-PE39KDEL对肿瘤细胞株的抑制活性。小鼠半致死剂量LD50检测毒理学性质,裸鼠成瘤实验检测F3-PE39KDEL对荷瘤裸鼠中肿瘤的生长抑制。结果表明,融合蛋白F3-PE39KDEL能很好抑制肿瘤细胞和人结肠癌的生长,同时具有较低的生物学毒性。说明F3-PE39KDEL具有抑制人结肠癌生长的潜在应用价值。

铜绿假单胞菌外毒素对淋巴细胞毒性作用

目的 探讨铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)对人外周血单核细胞 (PBMC)的毒性剂范围及抗PEA血清对PEA的中和作用。 方法 采集健康成年人的静脉血 ,密度梯度离心分离PBMC。不同浓度的PEA与PBMC37℃、5 %CO2 共同孵育 4 8h ,用台盼蓝染色排除法和四甲基偶氨唑蓝 (MTT)法检测细胞存活率。 结果 台盼蓝染色排除法和MTT法结果一致 ,PEA在 10 0 0ng/ml时PBMC的存活率显著下降 (P <0 0 1) ,PEA剂量在 0～80ng/ml时 ,对细胞存活率无明显影响 (P >0 0 5 )。而抗PEA抗体完全中和PEA的细胞毒作用。 结论 PEA在 10 0 0ng/ml时 ,对PBMC表现出细胞毒作用 ,而抗PEA血清可以中和PEA的毒性作用。

重组铜绿假单胞菌外毒素A工程菌的高密度发酵与表达

高密度培养表达大肠杆菌生产重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA)。用上海高机公司的30L自控发酵罐,采用分批补料培养技术,维持葡萄糖的浓度始终处于较低的水平,并分批补加氮源,同时溶氧控制在30%～40%,pH自动调控至7.0,培养至对数中期进行诱导。重组菌最终发酵液光密度(A600)未诱导时达到44,诱导时达到36,在上清液中表达的rEPA蛋白的含量占总蛋白的28.1%,在菌体中表达蛋白含量占总蛋白的4.7%。本实验为rE-PA的大规模生产奠定了基础。

铜绿假单胞菌外毒素A的调控基因

铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)外毒素A(PEA)为该菌最主要的致病物质,由toxA基因编码。本文综述PEA的调控基因,包括正调控基因regA、regB、lasR、ptxR、vfr和负调控基因fur、ptxS。regA是影响toxA转录的最主要基因。除lasR外,其余其因均在转录水平上通过regA调控PEA的产量。

表皮生长因子与假单胞菌外毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达研究

目的和方法：应用基因工程技术，将ＥＧＦｃＤＮＡ克隆到ｐＬＹ５／ＩＬ２－ＰＥ４０载体的ＥｃｏＲⅠ、ＳｍａⅠ位点之间ＩＬ２基因位置上，再将重组融合基因亚克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的ＥｃｏＲⅠ、ＰｓｔⅠ位点上，以探索ＥＧＦ－ＰＥ４０融合基因在大肠杆菌ＤＨ５ａ中的进行表达及其生理功能。结果：ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ表明：ＥＧＦ－ＰＥ４０融合蛋白获得表达，并且具有ＥＧＦ和ＰＥ４０的免疫学活性。

铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核表达载体构建及其鉴定

目的构建铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR方法扩增本实验所需要的PE38KDEL基因片段,再通过酶切及连接反应构建原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL,重组载体经过限制性内切酶酶切、PCR扩增鉴定及DNA序列测定证实插入片段正确后,转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳后及蛋白免疫印迹法分别测定其大小和特异性。结果经鉴定证实原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了PE38KDEL与GST的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被PE的特异性抗体所识别。结论PE38KDEL在大肠杆菌中获得了高效的融合表达,为下一步研究其功能奠定了基础。

3种诱饵材料对C型肉毒梭菌外毒素灭鼠效果的研究

为了提高C型肉毒梭菌外毒素燕麦毒饵的采食率和灭鼠效果,对韭菜、葱和白菜3种诱饵材料的添加效果进行研究。结果表明:3种诱饵材料均在一定程度上起到了提高毒饵采食率的效果,其中韭菜的诱导效果最佳,采食率和灭洞率较对照分别提高了34.7%和12.5%,较白菜分别提高了29.4%和5.4%,较葱分别提高了17.0%和5.5%。

动态浊度法检测细菌内毒素含量在重组铜绿假单胞菌外毒素A制备中的应用

目的:应用动态浊度法监测重组铜绿假单胞菌外毒素A(r EPA)制备各阶段料液中的细菌内毒素含量,为其工艺优化和质量控制提供依据。方法:参考应用《中华人民共和国药典》2015年版三部载录的动态浊度法测定细菌内毒素含量,对该方法的专属性、精密度、重现性、准确性和标准曲线的可靠性进行了验证,并将该方法应用于r EPA制备各阶段料液中细菌内毒素含量的测定及细菌内毒素去除效果的评价。结果:该方法具有较好的专属性、精密度、重现性、准确性。结论:经方法验证显示该方法的专属性、精密度、重现性、准确性等技术参数达到了相关验证要求,结果稳定可靠。现有r EPA制备工艺能稳定、有效地去除细菌内毒素,纯化后r EPA中细菌内毒素含量较低。本研究为r EPA制备过程中细菌内毒素去除效果的评价提供了准确的参考数据。

铜绿假单胞菌外毒素A在生物制药中应用的研究进展

铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)是该菌分泌的外毒素之一,通过催化细胞延伸因子2(elongation factor-2,EF-2)的ADP核糖基化,抑制蛋白合成,从而导致细胞死亡,在铜绿假单胞菌导致的感染性疾病中发挥重要作用。PEA强烈的细胞毒性特点使得该毒素成为免疫毒素的重要成分之一,已广泛应用于肿瘤的靶向治疗中。此外,由于PEA可与抗原提呈细胞表面的α2巨球蛋白受体结合,通过胞饮作用进入胞内,辅助抗原的处理和提呈,可作为分子佐剂应用于各种疫苗的研发。本文对PEA在免疫毒素及疫苗佐剂方面应用的研究进展作一综述。

铜绿假单胞菌外毒素A的抗原性及其与辅助细胞的关系

目的 研究铜绿假单胞菌外毒素A(PE)的某些抗原性及其与辅助细胞的关系。方法用MTT法观察PE在有无辅助细胞参与条件下对鼠脾淋巴细胞的刺激作用 ,并用鼠细胞毒性T细胞株CTLL进行证实。结果 PE在 0 0 1～ 10 0ng/ml浓度范围能刺激鼠脾淋巴细胞增殖 ,PE的丝裂原作用无需粘附细胞的辅助 ,但粘附细胞及其粘附细胞的PE刺激上清能协同PE对鼠脾淋巴细胞的刺激作用。PE在丝裂原作用范围内能刺激CTLL细胞生长 ,并与IL 2有协同作用。PE在体内能使小鼠脾淋巴细胞自发淋转率增高 ,对ConA刺激的增殖反应增强 ,但对淋巴细胞自发分泌IL 2和ConA诱导IL 2的产生水平无影响。

铜绿假单胞菌外毒素A诱导MLE-12细胞氧化应激损伤并激活自噬

目的观察铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)对MLE-12细胞的氧化应激损伤及其自噬活动的影响。方法体外培养MLE-12细胞至对数生长期,分别采用PEA 0、200、400、800和1 000ng/mL处理细胞1h和2h,之后进一步采用PEA 1 000ng/mL处理细胞15min、30min、1h、2h和3h,应用过氧化氢试剂盒检测H2O2的生成量,Western-blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达,分析LC3II与β-actin之间的比值变化。结果与对照组细胞相比较,随着PEA浓度的增高,细胞的H2O2检出量逐渐增加,PEA处理2h后,各组细胞H2O2检出量分别是对照组的1.73、2.09、3.82和5.06倍(P<0.01)。与此同时,细胞中自噬标记物LC3II的表达量显著增加。此外,高浓度PEA(1 000ng/mL)处理细胞后,随着时间的延长,H2O2检出量明显升高,同时伴随着细胞自噬活动的增强。结论 PEA可以诱导MLE-12细胞产生氧化应激损伤,并激活细胞的自噬活动。

重组F3肽-铜绿假单胞菌外毒素A抑制肿瘤生长

为检测重组的F3肽-铜绿假单胞菌外毒素A(F3-PE39KDEL)的抗肿瘤作用,采用MTT法检测F3-PE39KDEL对人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549、人卵巢癌细胞SKOV3和人肝癌细胞HepG2的生长抑制活性。采用半数致死剂量法观察F3-PE39KDEL对小鼠的毒性反应。以接种人肺癌细胞的裸鼠为模型,观察F3-PE39KDEL的抗肿瘤作用。结果显示,培养72、120 h时,F3-PE39KDEL对于人肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MCF-7具有显著的抑制活性,IC50分别为0.41、0.42μg/mL,4.95、2.53μg/mL。毒性试验结果显示,静脉注射给予F3-PE39KDEL后小鼠的半数致死量为1.1782 mg/kg,动物出现自发运动减少,死亡集中在给药后1 d内,死亡动物及实验结束存活动物剖检未见异常。F3-PE39KDEL对荷瘤裸鼠具有较强的抗肿瘤活性,剂量分别为0.1、0.2、0.4 mg/kg,其抑制率分别达到37.0%、43.2%、53.1%,显示出良好的量效关系。F3-PE39KDEL在靶向治疗肿瘤方面具有较好的应用前景。

高效液相色谱串联三重四级杆质谱法检测重组铜绿假单胞菌外毒素A蛋白质原液中氨苄西林残余量

目的建立高效液相色谱串联三重四级杆质谱法检测重组铜绿假单胞菌外毒素A（recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,r EPA）蛋白原液中氨苄西林残余量。方法用乙腈沉淀蛋白质,离心后收集上清,采用高效液相色谱串联三重四级杆质谱法上样分析,色谱条件：色谱柱Zorbax SB-C18 Rapid Resolution HT,1.8 Micron2.1 mm×100 mm,流动相30%乙腈,流速0.1 ml/min;质谱检测条件：多重反应监测（multiple reaction monitoring,MRM）,正离子模式,ESI电压3 500 V,碎裂电压110 V,碰撞能10,气体流速8 L/min,母离子的质荷比（mass to charge ratio,m/z）=350.1,定量子离子m/z=105.8,定性子离子m/z=159.9。对建立的方法进行系统适用性、专属性、精密度、稳定性验证,确定该方法的线性范围及最低检出限、定量限,并进行基质效应试验。结果该方法试验参数符合检测要求,对氨苄西林的检测专属性强,当氨苄西林浓度在10~100 ng/ml范围内,r2〉0.999 00,最低检出限为5 ng/ml,最低定量限为10 ng/ml。氨苄西林加标试验的回收率在98%~110%之间,重复性及日间精密度RSD均小于5.5%;冻融稳定性、样品前处理后的稳定性、短期稳定性试验中,样品回收率均在95%~120%之间;以超纯水5倍稀释的r EPA蛋白原液作为溶剂配制的3个不同浓度的氨苄西林对照品溶液的回收率均接近120%,RSD值在3%~5%之间,准确度和精密度良好。结论该方法系统适用性好,灵敏度高,专属性强,准确度和精密度好,检测时间短,是一种易于实现仪器自动化分析的方法。

免疫单扩散法测定重组铜绿假单胞菌外毒素A蛋白含量方法的建立及其应用

目的:探索建立免疫单扩散法测定不同料液中重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,r EPA)蛋白含量新方法。方法:对缓冲液系统、最佳抗体浓度和最佳观测时间等关键因素进行摸索,确定方法的最佳条件。在此基础上,对该方法的专属性、精密度、准确性和标准曲线的可靠性进行验证,并将该方法应用于r EPA柱层析纯化中不同样品目标蛋白含量的测定及回收率计算。结果:最佳缓冲系统为0.85%Na Cl溶液,最佳抗体用量为50μL·m L-1,最佳观测计算时间为4 h。方法具有较好的专属性、精密度、准确性和线性。结论:初步建立了免疫单扩散试验测定不同料液中r EPA蛋白含量新方法,为其纯化工艺的优化奠定了基础。

重组铜绿假单胞菌外毒素A含量SDS-PAGE检测方法的建立及验证

目的建立测定重组铜绿假单胞菌外毒素A（recombinant exotoxin of Pseudomonas aeruginosa,r EPA）含量的SDSPAGE法,并进行验证。方法采用SDS-PAGE,经考马斯亮蓝R-250染色后,利用Image Lab软件分析获得目标蛋白条带光密度值,计算目标蛋白在待测样品中的含量。对建立的方法进行专属性、准确性和重复性验证,确定检测范围,并用建立的方法检测r EPA宿主湿菌体中r EPA发酵产量及r EPA宿主菌休克液柱层析纯化样品中r EPA含量。结果 r EPA含量在100~600μg/ml范围内与其对应条带的光密度值具有良好的相关性,决定系数在0.97以上。大肠埃希菌固有组分及纯化过程中常用的添加物对r EPA含量检测均未产生明显影响,专属性较好;用建立的方法检测500、300、150μg/ml r EPA样品10次的回收率分别为（102.32±4.18）%、（102.77±4.94）%和（95.04±16.41）%,CV值分别为4.08%、4.81%和17.27%。各批r EPA发酵产量为250~500 mg/L,三步柱层析纯化后,r EPA总回收率约为50%。结论建立了测定r EPA含量的SDS-PAGE法,该方法专属性、准确性和重复性良好,为r EPA生产工艺的优化奠定了基础。

假单孢菌外毒素A的介绍

介绍了假单孢菌外毒素 A的理化性质 ,分子结构与功能的关系以及假单孢菌外毒素 A的应用前景。

铜绿假单胞菌外毒素A免疫毒素片段的抗原性评估及三级结构模拟

目的克隆铜绿假单胞菌外毒素A（PEA）基因及分析不同克隆序列中不同性质氨基酸对抗原性及三级结构的贡献。方法以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，以PEA编码基因特异区段为引物，采用Touchdown PCR克隆PEA编码基因。阳性克隆经菌落PCR鉴定后进行DNA测序及Clustal X（1．83）比对分析；采用生物信息学在线软件BIMAS及SWISS—Model对所得基因编码蛋白进行抗原性评估及三级结构模拟。人为置换关键部位的氨基酸残基，考察不同性质氨基酸对三级结构的影响。结果从铜绿假单胞菌DNA中获得3个克隆。抗原性分析及三级结构模拟结果显示，3个克隆与公开发表的序列之间存在少数氨基酸的差异；个别区段上氨基酸的改变可引起相应位点抗原性的改变，但仅有个别位点的改变对空间结构产生影响。结论基于抗原性评估及三级结构分析，获得了不同性质氨基酸对抗原性及三级结构的贡献等信息，为PEA编码基因用于弱化抗原性靶向性毒素的构建奠定了基础。

假单胞菌外毒素免疫原性的改善策略

重组免疫毒素(recombinant immunotoxin,RIT)是靶向杀伤肿瘤细胞的药物,由抗体与毒素分子连接而成的融合蛋白。其特异性抗体和靶细胞表面的抗原结合,介导毒素分子进入细胞起到杀伤细胞的作用。多种细菌和植物毒素已被用于制备免疫毒素。假单胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin,PE)是构建免疫毒素的优选分子,被证明具有极高的细胞毒性。由于PE分子的免疫原性强、穿透能力差等原因,使其疗效低于预期。近年来利用各种方法降低RIT的免疫原性,去掉B细胞表位和T细胞表位,成为研究重点。现就PE的结构、功能以及免疫原性的降低等作一概述。

免疫毒素IL-3-PE38KDEL的表达及活性测定

目的:制备具有杀伤活性的新型抗白血病免疫毒素。方法:在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-throgalac-top yranoside,IPTG)的诱导下,高效表达免疫毒素IL3-PE38KDEL,采用细胞毒性实验,对毒素活性进行检测。结果:免疫毒素IL3-PE38KDEL以包涵体形式为主高效表达,该蛋白具有较好的毒素活性。结论:免疫毒素IL3-PE38KDEL具有良好的生物学活性,为其作为抗白血病药物的进一步研究打下了基础。

免疫毒素BDI-1-PEA的构建及其活性测定

目的 构建新型免疫毒素BDI- 1-PEA ,并进行抗人膀胱肿瘤活性的初步研究测定。方法 应用异型双功能连接剂N -琥珀酰胺酯 3- (2 -吡啶基二硫 )丙酸 (SPDP)将抗人膀胱肿瘤单克隆抗体 (BDI- 1)与铜绿假单胞菌外毒素 (PEA)交联 ,制备出新型免疫毒素BDI- 1-PEA。应用四甲基偶氮唑盐 (MTT)法初步检测其对人膀胱肿瘤细胞系E -J的选择性杀伤活性。结果 BDI- 1-PEA结合物具有高效靶向杀伤膀胱肿瘤细胞的能力 ,优于游离PEA或PEA与BDI- 1的混合物。结论 新型免疫毒素BDI- 1-PEA有较高的选择性抗人膀胱肿瘤细胞的活性 。